保护Nrf2-Mediated基因调控的蛋白酶体单元和斑马鱼的葡萄糖代谢

文摘

Keap1-Nrf2系统是一种进化保守防御机制对氧化和异型生物质压力。除了外源性应激反应,Nrf2已经发现调节许多细胞功能,包括蛋白质周转和葡萄糖代谢;然而,这些功能的进化起源仍未知。在目前的研究中,我们寻找新的靶基因与斑马鱼Nrf2回答这个问题。微阵列分析斑马鱼胚胎中Nrf2透露,115个候选基因Nrf2的目标,包括蛋白酶体亚基编码的基因组成和酶与葡萄糖代谢有关。实时定量PCR建议3蛋白酶体亚基的表达psma3,psma5,psmb7)和2与葡萄糖代谢有关酶(pgd和fbp1a)被斑马鱼Nrf2监管。我们因此下研究了这些基因的upregulation Nrf2活化剂,马来酸二乙酯,使用Nrf2突变斑马鱼幼虫。结果实时定量PCR和包埋原位杂交显示所有这些5基因调节Nrf2-dependent地通过马来酸二乙酯治疗,特别是在肝脏。这些发现暗示Nrf2-mediated监管的蛋白酶体单元和葡萄糖代谢是脊椎动物中进化保守。

1。介绍

Keap1-Nrf2系统是一个机制,保护细胞免受异型生物质和氧化应激。压力的条件下,转录因子Nrf2 transactivates一系列广泛的基因,而执行的一系列功能,包括(但不限于)抗氧化蛋白的编码,glutathione-conjugating酶和异型生物质运输车。这带来一个诱导防御压力(1,2]。尽管这些基因都已经被广泛地研究过了Nrf2目标,有越来越多的证据表明,Nrf2激活一组广泛的基因比最初认为[3]。Nrf2调节蛋白质周转通过蛋白酶诱导子对慢性疾病具有保护作用[4)和修改细胞代谢过程,例如,磷酸戊糖途径,它提供了NADPH和嘌呤核苷酸的氧化还原体内平衡和细胞增殖(5,6]。由于这种多功能性,Nrf2医学领域的研究已经成为一个新兴的话题(7,8]。

斑马鱼已成为一个受欢迎的模式脊椎动物基础医学(9,10]。虽然方便使用较低的脊椎动物模型用于医学研究,总有一些担忧,这些发现是否适用于人类医学。我们已经调查了Keap1-Nrf2系统使用斑马鱼作为模型并显示,监管系统是基于类似的分子机制的哺乳动物(11- - - - - -15]。此外,Nrf2突变斑马鱼应变的分析,nrf2a^fh318显示,保护作用对氧化和斑马鱼(异型生物质压力是守恒的16,17]。目标基因在斑马鱼的产品线,提供防御功能,从最近的研究也正在澄清18]。我们之前的研究(19和哈恩等的研究。20.]报道微阵列的性能分析使用斑马鱼幼体对待Nrf2抗病诱导剂、马来酸二乙酯(民主党)和叔分别丁基氢醌(特丁基对苯二酚),发现规范Nrf2目标,如解毒和抗氧化酵素在斑马鱼是守恒的。然而,目前尚不清楚是否Nrf2-mediated调节细胞途径除了抗氧化和解毒,例如,蛋白质周转和葡萄糖代谢,是守恒的脊椎动物之间还是只存在于更高的脊椎动物。

在目前的研究中,我们寻找新的靶基因在斑马鱼Nrf2回答这个问题。我们进行了微阵列分析中也是Nrf2的斑马鱼胚胎,这是一种不同的方法从先前的报道19,20.]。分析显示基因编码蛋白酶体单元和酶参与葡萄糖代谢,这表明Nrf2-mediated调节蛋白质周转和葡萄糖代谢是脊椎动物中进化保守。

2。材料和方法

2.1。斑马鱼和化学治疗

野生型(AB)nrf2a^fh318突变体(16]斑马鱼菌株被用于本研究。的nrf2a^fh318应变是由pcr基因分型,所述熔丝et al。17]。胚胎通过自然交配。对于民主党的治疗,幼虫被放置在3厘米文化菜4天postfertilization (dpf), 100处理μ和光,6 h M民主党(kouichi大阪,日本)。所有的实验根据批准的方法进行动物实验委员会筑波大学的。

2.2。微阵列分析

DNA微阵列分析使用定制的16 K MZH芯片(GPL14379),如前所述[19]。生物实验进行了一式三份和微阵列分析进行复制或为每个生物实验一式三份。对斑马鱼的过度nrf2a,限制nrf2a从pCS2nrf2 RNA合成11)使用一个SP6 mMESSAGE 1体外转录工具包(Ambion、奥斯汀、TX)。一百pg的信使rna注入1-cell阶段胚胎的IM300显微注射器(Narishige、东京、日本)。8 h后注入,胚胎收集和均质QIAzol试剂(试剂盒、希尔登,德国)和存储在−80°C。既比方法应用比较nrf2aRNA-injected胚胎与uninjected胚胎(控制),根据制造商的协议AceGene DNA微阵列(日立解决方案,日本东京)。总RNA提取根据制造商的说明QIAzol试剂(试剂盒),结合的清理协议RNeasy迷你包(试剂盒)。使用amino-allyl Amino-allyl-modified RNA合成RNA扩增工具包(Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)和贴上monoreactive Cy3和Cy5染料(通用电气医疗集团,小都,英国)。杂化MZH芯片进行扫描使用Affymetrix 428阵列扫描(Affymetrix,圣克拉拉,CA)。微阵列数据从原始数据图像处理文件Affymetrix捷豹(Affymetrix)并使用每个芯片规范化进行了分析。处理过的数据随后被导入到Excel(微软,微软,佤邦)比较两个样本的表达谱(与uninjected注射nrf2a信使rna)。基因的表达受Nrf2a过度选择基于截止值> 1.5倍或>的1.5倍,而不考虑他们的意义。生物学通路分析使用Reactome数据库(http://www.reactome.org/)。我们已经把原始数据在基因表达综合(GEO)加入GSE86174数量,我们可以确认所有细节是最小一个微阵列实验的信息。

2.3。实时聚合酶链反应

总RNA从nrf2a-overexpressing胚胎和DEM-treated幼虫准备根据过程执行的微阵列分析。互补脱氧核糖核酸合成使用ReverTra Ace qPCR RT大师混合(Toyobo,大阪,日本)根据制造商的指示。定量PCR (qPCR)使用7500执行快速实时PCR系统(热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA)与雷鸟SYBR qPCR混合(Toyobo)。表中列出的特定的引物S1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/5720574。每个基因的表达水平是归一化的水平ef1α。

2.4。原位杂交分析

包埋原位杂交分析如前所述[21]。构建pKSpsma3、pKSpsma5 pKSpsmb7、pKSpgd pKSfbp1a, PCR碎片放大了使用斑马鱼的互补脱氧核糖核酸合成引物见表S2幼虫(4 dpf)和结扎pBluescript II KS +向量使用DNA结扎工具包Ver.1(豆类,大津,日本)。质粒线性化的限制性内切酶(pKSpsma3、pKSpsmb7 pKSpgd:Bam你好;pKSpsma5:生态国际扶轮;pKSfbp1a:Spe我和T3)和转录RNA聚合酶(罗氏诊断,印第安纳波利斯)挖RNA的存在标签组合(罗氏诊断)RNA探针。幼虫拍摄使用MZ16显微镜(徕卡,位于德国)配备DP73数码相机(奥林巴斯、东京、日本),其次是pcr基因分型。

2.5。统计分析

基因表达水平的实时pcr使用双尾学生的比较以及。< 0.05的值被认为是显示统计学意义。

3所示。结果

3.1。小说目标的识别斑马鱼Nrf2基因微阵列分析

小说搜索目标斑马鱼Nrf2基因,我们进行了微阵列分析斑马鱼胚胎overexpressing Nrf2。体外合成的信使rnanrf2a在斑马鱼,哺乳动物的功能直接同源Nrf2,注入1-cell斑马鱼胚胎阶段,和注射胚胎中的基因表达在8 h后注射检查使用16 K MZH芯片,包含16399调查19]。总的来说,115个基因被认为是调节过度的1.5倍以上nrf2a(表S3)。

调节基因的微阵列的阵容nrf2a-overexpressing胚胎进一步分析使用Reactome数据库来确定生物功能可能受到这些调节基因(表1)。除了抗氧化作用和谷胱甘肽共轭,proteasome-related途径进行上市,由于upregulation 3蛋白酶体亚基基因编码,psma3,psma5,和psmb7(蛋白酶体单元α3,α5,β7,职责)。应该注意的是,没有一个蛋白酶体亚基基因编码,包括这三个基因,已确定在以前的微阵列分析(19,20.]。

3.2。蛋白酶体单元被斑马鱼Nrf2监管

来验证芯片结果,我们进行了实时qPCR。nrf2a-overexpressing胚胎准备一样的微阵列分析。过度的nrf2a证实了在mRNA-injected胚胎实时qPCR(图S1, 75.5倍高于uninjected胚胎)。如图1(一),psma3显著诱导的超表达吗nrf2a(1.51倍)。psma5和psmb7也往往是弱诱导的超表达nrf2a(1.28和1.18倍,分别地)。这些结果表明,类似于哺乳动物(4),一些蛋白酶体亚基基因在斑马鱼Nrf2的目标。

然后我们测试3蛋白酶体亚基基因的表达是否由民主党实时qPCR Nrf2-dependent地。尽管民主党并未显著诱导的蛋白酶体亚基基因在6 h(图1 (b)),psmb7诱导后12 h曝光(图1 (c)在野生型幼虫与统计学意义(1.59倍),而感应nrf2a^{fh318 / fh318}突变体(1.33倍)比野生型的弱。psma3和psma5也往往是诱发12 h后暴露在民主党在野生型幼虫(1.49和1.47倍,分别地。)在吗nrf2a^{fh318 / fh318}突变体幼虫(1.27和1.63倍,分别地。)。

我们推测的原因不清楚Nrf2-dependency是由于无处不在的基底蛋白酶体亚基基因的表达。因此,我们接下来进行整体原位杂交来评估tissue-restricted感应的蛋白酶体亚基基因,因为许多Nrf2目标基因显示吉尔,肝脏或nose-specific感应在斑马鱼鱼仔19]。正如我们所料,这三个亚基基因的表达是诱导肝脏中野生型和突变杂合的(nrf2a^{fh318/ +})幼虫后12 h民主党(图2)。这肝脏特异性诱导在兄弟姐妹突变纯合子(没有被观察到nrf2a^fh318/fh318)。这些结果表明,Nrf2调节蛋白酶体亚基在斑马鱼的基因表达水平,特别是在肝脏。

3.3。斑马鱼Nrf2调节参与葡萄糖代谢的酶

值得注意的是许多高素质的基因在目前的微阵列分析也确定了在前面的微阵列分析使用民主党——或者tBHQ-treated幼虫(见表S3,灰色突出显示基因)19,20.]。观察表明,这些27重叠基因可能是强有力的候选人斑马鱼Nrf2目标(图3(一个)表示,基因;表S3,灰色突出显示)。因此我们分析这些基因使用Reactome数据库搜索小说相关的生物学途径斑马鱼Nrf2(表2)。结果,列出的“新陈代谢”通路内的十大类别,除了通路与谷胱甘肽共轭和抗氧化作用有关。三种分解酶参与葡萄糖代谢被包含在“新陈代谢”途径:pck1(磷酸烯醇丙酮酸carboxykinase 1),pcxb(丙酮酸羧化酶b)pgd(phosphogluconate脱氢酶)。此外,回顾阵容的基因超表达的调节nrf2a(表S3),两个相关基因被发现:taldo1(transaldolase 1)fbp1a(特性,6-bisphosphatase 1 a)。

确认Nrf2-dependent upregulation这些基因,我们接下来进行实时qPCR使用nrf2a-overexpressing胚胎。结果表明,表达的水平pgd和fbp1a(1.40和2.76倍,分别地。),但不是pck1,pcxb,和taldo1(1.21,0.75和0.70倍,分别地),明显的过度调节nrf2a(图3 (b))。为pgd和fbp1a,我们进一步分析了基因表达DEM-treated幼虫。如图3 (c)民主党处理诱导的表达pgd和fbp1a在野生型幼虫(5.85和2.18倍,分别地。),和纯合子的感应较弱nrf2a^fh318突变体幼虫(2.15和1.20倍,分别地。),建议明确的遗传证据Nrf2-dependent监管。

感应资料这两个基因的进一步分析了原位杂交(图4)。野生型和nrf2a^fh318杂合的突变幼虫,pgd与民主党在肝脏诱导专门治疗后6 h,而没有观察到感应nrf2a^fh318纯合突变体。fbp1a也引起了民主党在肝脏,这种感应强野生型、杂合的突变纯合突变体。弱DEM-induced表达fbp1a也观察到的腮,但这感应是独立的吗nrf2a基因型。这些结果表明,Keap1-Nrf2系统,至少在某种程度上,这些酶的转录调节参与葡萄糖代谢。

3.4。其他目标斑马鱼Nrf2基因的鉴定

微阵列数据提供更多的候选人守恒Nrf2目标基因在斑马鱼。我们选择6基因来自27个重叠的基因(见图3(一个)和表S3)确定在当前和以前的微阵列分析和分析使用一个实时qPCR表达。所选择的基因包括在内gclm(glutamate-cysteine连接酶、修饰符单元)gsto2(谷胱甘肽年代转移酶ω2),gsr(谷胱甘肽还原酶),sqstm1(sequestosome 1),和keap1a1 (kelch-like ECH-associated蛋白质),一起研究nrf2a目标,问题(谷胱甘肽年代转移酶π(如图1)5(一个),gclm,gsto2 gsr,和问题被过度调节的nrf2a(1.98,9.10,3.12和6.39倍,分别地),sqstm1和keap1a只是略微感应(1.28和1.21倍,分别地。)。这些基因的表达是DEM-treated胚胎(图的进一步调查5 (b))。所有被民主党强烈诱导的基因在野生型幼虫(gclm,6.37倍;gsto2,3.99倍;gsr,9.40倍;问题,5.88倍;sqstm1,5.44倍;keap1a,1.72倍);感应较弱,除了keap1a,在nrf2a^{fh318 / fh318}突变体幼虫(gclm,2.80倍;gsto2,2.08倍;gsr,6.69倍;问题,1.94倍;sqstm1,2.35倍;keap1a2.10倍)。结果表明,这些基因的目标对斑马鱼Nrf2基因。

在我们的微阵列分析中,我们还发现55个基因的过度表达下调nrf2a(表S4)。这些基因,除了hesx1被确定在前面的民主党——或者tBHQ-based微阵列分析(25和82个基因,分别地。)19,20.]。更重要的是,我们找不到与脂肪酸代谢相关的基因或inflammation-recent研究暗示这些函数是负面受Nrf2 [5,22,23]。进化的保护相关Nrf2-dependent某些类型的基因的负调控仍不清楚。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们发现,三种蛋白酶体亚基在20年代核心粒子被斑马鱼Nrf2监管,其中一个(psmb7)有一个trypsin-like蛋白酶活动;其他的(psma3和psma5)组成α环形结构(24]。在哺乳动物中,蛋白酶体的多个单元也被证明是由Nrf2在转录水平(4),表明一种守恒的监管机制在脊椎动物的存在。符合夸克等人的报告。4)显示,蛋白酶体亚基的转录诱导小鼠肝脏与D3T治疗后,观察Nrf2-activating抗氧化剂,感应居多的斑马鱼肝脏的幼虫。尽管大多数Nrf2目标基因在斑马鱼幼虫显示感应测试鼻子和鳃除了肝脏(19),只在肝脏蛋白酶体亚基基因诱导。肝脏特异性的分子基础以及他们的缓慢感应应该在未来的特点。随着Nrf2-dependent upregulation蛋白酶体功能的建议是重要的防御氧化应激,内质网压力,和衰老25- - - - - -27),预计监管医疗应用程序上下文应该澄清。斑马鱼模型还可以提供一个好的模型进行进一步的研究。

葡萄糖代谢相关酶也Nrf2在斑马鱼的目标。Phosphogluconate脱氢酶(Pgd)是一种酶,这种酶将6-phosphogluconate转换为核酮糖5-phosphate氧化磷酸戊糖途径的分支,产生NADPH以及嘌呤核苷酸(28]。的Nrf2-dependent upregulation的pgd在老鼠也得到了证实6]。的upregulationpgd可能带来保护压力,向NADPH的供应,氧化还原内稳态的基本代数余子式(5],核苷酸生物合成通过磷酸戊糖途径的激活,这可能会导致癌细胞代谢重构(6]。斑马鱼最近已成为一个重要的模型在癌症生物学(29日,30.]。这将是值得研究Nrf2-dependent代谢重构,发生在使用斑马鱼致癌作用。除了pgdNrf2-depedent转录调节的特性,6-bisphosphatase (Fbp),一种酶,这种酶转化为果糖1,观察到6-bisphosphate果糖- 6 -磷酸糖质新生,特别是在肝脏。这肝脏特异性诱导机制的进一步研究将提供一个重要的线索来理解Nrf2-dependent调节葡萄糖代谢的生物学意义。

在目前的微阵列分析,重要的截止值upregulation超表达的nrf2a被设定为1.5倍的变化,而不是2倍的变化之前的研究(19,20.]。它是有效的,因为4 6基因,我们验证了微阵列数据的实时qPCR统计学意义,显示小于2倍的变化微阵列分析(见图S2和S3表)。微阵列之间的相关性的褶皱变化和实时qPCR数据是相对贫穷的;因此,不仅值得挑选高素质的基因微阵列分析法还低级基因进行进一步的分析。

本研究的独特点在于基因筛选nrf2a-overexpressing胚胎。Nrf2-target基因的芯片检测的主要方法是使用细胞/组织/动物对待Nrf2-activating化合物(31日- - - - - -33)为前面的屏幕一样研究使用斑马鱼(19,20.]。另一种方法是使用Keap1基因敲除细胞/组织(5,34]。因为Keap1是一个目标Nrf2 E3泛素连接酶,基因的干扰增加的稳定性Nrf2 Nrf2并导致本构激活。耶茨的研究等。22),而治疗组基因调节的一个强有力的Nrf2-activating化合物(CDDO-Im)与调节肝脏特异性Keap1基因敲除是特别感兴趣的。Keap1-knockout Nrf2-dependent转录激活比药物更强烈激活;因此更多的Nrf2-regulated基因检测(22]。类似的效果可能被观察到在目前的超表达方法研究。

5。结论

总之,我们发现小说Nrf2-target在斑马鱼基因微阵列分析使用nrf2a-overexpressing斑马鱼胚胎。蛋白酶体单元的基础表达水平显示由斑马鱼Nrf2监管。此外,参与磷酸戊糖途径的酶和糖质新生被发现受到Nrf2-dependent转录控制。这些结果表明,Nrf2-mediated监管的蛋白质周转和葡萄糖代谢相关的基因,至少他们的一部分,在脊椎动物的进化。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Vu Nguyen Thanh和Yuji同样融合了这工作。

确认

作者感谢Masayuki山本有价值的建议和Hiroshi金子,李立Yaeko Nakajima-Takagi, Tadayuki Tsujita,和武若狭实验的帮助。这项工作是由Grants-in-Aids从教育部、科学、体育和文化的日本(Makoto小林)(21659043,21659043,25118705,26116705,和26520101)和山崎的香料促进基金会的资助。

补充材料

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