文摘
氧化应激在burn-induced心肌损伤中起着重要的作用,但细胞机制,控制活性氧(ROS)生产和扫气还没有完全理解。这项研究表明,封锁Notch信号通过敲除转录因子RBP-J或药理抑制剂加剧postburn心肌损伤,表现为血清CK恶化,水平和LDH水平和细胞凋亡增加在体外和在活的有机体内。Notch信号细胞内ROS增加生产的中断,和活性氧清除剂逆转加剧了Notch信号封锁后心肌损伤。这些结果表明,缺口信号缺陷加剧postburn心肌损伤通过增加活性氧的水平。也减少了Notch信号封锁MnSOD表达式在体外和在活的有机体内。值得注意的是,Notch信号封锁下调p-JAK2和p-STAT3表达式。显著抑制JAK2 / STAT3信号AG490 MnSOD表达减少,ROS增加生产,加重心肌损伤。AG490 + GSI施加没有额外的效果。这些结果说明Notch信号防止burn-induced心肌损伤通过JAK2 / STAT3信号,激活MnSOD的表达和导致减少ROS水平。
1。介绍
严重的烧伤损伤导致多器官功能障碍,这是死亡的主要原因在重症监护病房(icu) [1,2]。心肌损伤是导致死亡的主要因素,特别是在个人与既存的心脏病理(3,4]。大量实验研究调查了burn-induced心肌损伤的分子机制创建新颖的治疗干预措施和代理来减少威胁生命的并发症的发生率。然而,目前仍缺乏有效的治疗方法,增加心肌抗烧伤病人尽管几十年的实验室研究和临床实践。
越来越多的证据表明,氧化应激在burn-induced心肌损伤中起着重要作用[5- - - - - -7]。然而,细胞机制,控制活性氧产量和扫气还没有完全理解。Notch通路是一种进化保守的信号系统,起着至关重要的作用在细胞命运决定、分化、增殖和凋亡。四个级距受体(Notch1-4)和五个级距配体(Delta-like1 3 4, Jagged1 2)已确定在哺乳动物。绑定一个等级配体的受体触发γ-secretase-mediated切口胞内的蛋白水解劈理域研究所,它把细胞核形成transcription-activating复杂。这个复杂的调节Hes1等下游靶基因的转录,Hey1,细胞周期素D (8]。
Jagged1 Notch1和在成人心脏中表达的9),这些蛋白质保护心脏组织在不同病理生理条件下(10),包括酒精性心肌病心肌梗死(11),心脏肥大(12),和缺血再灌注损伤13]。最近的研究表明,Notch1抑制氧化应激在肝细胞(14和内皮细胞15]。值得注意的是,最近我们发现Notch1防止MI / R损伤通过减少氧化/ nitrative压力(13]。然而,Notch1信号是否扮演了一个角色在burn-induced心肌损伤还有待确定。本研究证明了Notch1途径防止postburn心肌损伤通过镇压活性氧(ROS)生产通过JAK2 / STAT3信号。
2。材料和方法
2.1。动物
健康成年男性Sprague-Dawley (SD)大鼠(重200 ~ 250克)或新生SD大鼠(1 - 3天)获得第四军医大学实验动物中心。所有动物实验进行依法管理的指导方针为医学研究目的动物实验中国卫生部颁发的。动物伦理号码是xjyyll——2014177。动物喂养随意标准饮食和水在整个研究。所有的动物都是分开住,保持在标准条件下室温(22 ~ 24°C)在12 h光/ 12 h暗周期。
条件RBP-J等位基因(RBP-J液氧)老鼠慷慨的礼物华汉教授,医学博士,Ph.D. (Department of Medical Genetics and Developmental Biology, Fourth Military Medical University). Myh6-Cre mice were obtained from Model Animal Research Center of Nanjing University. Cardio-specific RBP-J knockout mice were generated from RBP-J floxed mice and Myh6-Cre mice. Tamoxifen was administered to each mouse, when mouse reached 6 weeks after birth, at 50 mg/kg by intraperitoneal injections once a day for 5 days.
2.2。燃烧过程
动物与戊巴比妥钠麻醉轻(50毫克/公斤)。老鼠被放置在一个预制模板与一个矩形开口暴露了背侧皮肤表面,但剩下的皮肤接触燃烧的保护。这个模板限制燃烧区域回溯到一个预先确定的30%。暴露的皮肤表面沉浸在95°C水18岁如前所述[16,17]。Sham-burn控制动物治疗烧伤组中相同的动物,除了皮肤被水浸在37°C。老鼠(在18到22岁的g)被放置在一个模板估计30%体表面积和受到蒸汽消耗8年代如前所述[18]。动物立即充满乳酸林格氏溶液根据公园的公式和皮下注射了生理盐水为0.1毫克/公斤的丁丙诺啡(σ,圣路易斯,密苏里州)疼痛控制。样本收集的燃烧和虚假的动物后燃烧过程在不同的时间点。
2.3。血清收集
动物是被麻醉后每个端点燃烧伤害。大鼠血液样本取自aortaventralis。小鼠血液样本被眼球切除。收集的血液在10分钟1500克、离心机和血清收集和储存在−80°C为进一步使用。从大鼠血清12 h后心肌细胞燃烧被用来挑战。
2.4。心肌细胞培养与烧伤血清刺激
新生大鼠心室的心肌细胞分离一个抱Sprague-Dawley老鼠使用先前描述的过程(19]。细胞丰富了心肌细胞放在6板和维护心脏肌细胞中(美国ScienCell CMM),其中包括心脏肌细胞增长补充(发生)和低浓度的胎牛血清(5%)有限公司2孵化器在37°C在指定的时间点。一个γ分泌酶抑制剂(GSI;Calbiochem拉霍亚,CA)曾在75年的浓度μ米,二甲亚砜(DMSO)作为控制。烧伤血清添加15% (v / v)。
2.5。评价心肌损伤和细胞凋亡
心肌损伤是评估使用小鼠血清肌酸激酶(CK)、肌酸激酶MB同工酶的(水平)和乳酸脱氢酶(LDH)。化验都是使用化学自动分析器执行(体外750,强生,罗彻斯特,美国)。通过测量心肌细胞损伤评估LDH释放到培养基中。短暂,孵化中被储存在4°C的治疗,和同样体积的冷缓冲区(10毫米Tris-HCl (pH值7.4),1毫米EDTA)添加到细胞。这些细胞被刮并使用粉状细胞溶解。溶菌产物离心机在4°C,上层清液储存在4°C。LDH水平在中(LDH释放)和细胞溶解产物(保留LDH)使用分光光度分析测定。结果表示为LDH释放百分比与总LDH(+保留发布)。
心肌细胞凋亡进行了分析使用TUNEL原位化验和细胞死亡检测设备根据制造商的协议。心肌细胞凋亡是评估使用吖啶橙(AO) /溴化乙锭(EB)。细胞收获confluency在70 - 80%,种子在48-well板块2×105细胞/好,孵化一夜之间的细胞附着。AO / EB的解决方案是与100年准备μ每个试剂的g / mL。细胞治疗与烧伤血清12 h,并且每个样本是沾染了100年μL (AO / EB解决方案之前显微镜和量化。为每个治疗至少300细胞数,以及凋亡的百分比(红橙色核)和生活(绿核)细胞计算。
2.6。ROS测量
心肌细胞被贴上2′,7′二氯荧光素(DCFH-DA) (S0033 Bryotime,中国上海)测量细胞内ROS生成后推荐协议。通过测量细胞内ROS水平测定氧化转化cell-permeable DCFH-DA对荧光二氯荧光素(DCF)。细胞培养与DCFH-DA 37°C为20分钟。的DCF荧光分布200000个细胞用流式细胞术检测的激发波长488 nm和发射波长535 nm)。细胞内ROS水平的量化使用平均荧光强度(MFI),结果在统计学上组间相比,所述。
心肌超氧化物阴离子含量是决定使用lucigenin-enhanced发光(13]。样本的重量,切成均匀的块(0.5毫米3),转移到包含1毫升的PBS和lucigenin聚丙烯管(0.25σ,更易/ L)。管被放置在一个FB12-Berthold光度计(坏Wildbad Berthold技术,德国)。RLU发出记录和集成在30年代间隔为5分钟。活动是干组织权重归一化。
2.7。免疫印迹分析
心肌和心肌细胞样本均质裂解缓冲包含20毫米Tris-HCl (pH值7.4),150毫米氯化钠,5毫米EDTA, 1% Triton-X 100年,德勤1%,和1%的蛋白酶抑制剂鸡尾酒。溶菌产物离心机在12000 g×15分钟,以及由此产生的上层清液被转移到一个新的管和储存在−70°C。蛋白质浓度测定用布拉德福德化验设备。等量的蛋白质分离使用10%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)和转移到硝化纤维膜。膜被封锁的1 h Tris-buffered盐水和渐变20 (TBST, pH值7.6)包含5%脱脂奶粉和孵化一夜之间在4°C抗体Notch1 ICD和Hes1 (Abcam、剑桥、马),MnSOD(圣克鲁斯生物技术),JAK2 / phospho-JAK2 (Abcam、剑桥、马),STAT3 / phospho-STAT3和GAPDH(细胞信号技术,丹弗斯,MA),其次是与TBST洗。探讨了膜与适当的二次抗体(1:3000稀释)在室温下与TBST 90分钟,洗。发现了蛋白质乐队使用Bio-Rad成像系统(Bio-Rad、大力神、钙、美国)和量化使用数量一个软件包(美国西伯克利,CA)。
2.8。统计分析
所有值的文本和数据意味着±SEM。数据(除了免疫印迹密度)受到方差分析其次是事后的Bonferroni调整测试。免疫印迹分析了密度利用克鲁斯卡尔-沃利斯检验其次是邓恩的事后测试。值< 0.05被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。Notch1通路对烧伤后心肌损伤
正常小鼠受到燃烧伤害,Notch1和Hes1心肌组织的蛋白质表达是研究在不同时间点从0到24小时。Notch1 ICD蛋白质含量,Notch1激活的标志,在早期的时间点显著增加(3和6 h)燃烧后的应用程序。最大Notch1 ICD蛋白质含量发生12 h后燃烧应用程序和减少在24和48 h(图1(一))。Hes1蛋白质含量,这是一个下游效应器Notch1信号,达到峰值在12 h和24和48 h(图表达下调1 (c))。类似的趋势在培养大鼠心肌细胞接触烧伤后血清(数字1 (b)和1 (d))。ICD Notch1和Hes1蛋白表达增加在早期时间点(6、12和24 h)和减少在稍后的时间点(48小时)。这些结果表明,在燃烧伤害心脏Notch1信号被激活。
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3.2。切口封锁加剧Burn-Induced心肌细胞凋亡的信号在体外
鼠心肌细胞是使用助教或车辆,其次是烧伤血清的调查在心肌细胞postburn Notch1信号损伤的作用。AO / EB染色显示显著升高的细胞凋亡细胞与烧伤血清的挑战。值得注意的是,烧伤血清诱导显著增加细胞凋亡当Notch信号被GSI(数字2(一个)和2 (b))。烧伤血清还导致显著增加caspase-3表达式,以及封锁Notch1信号通过GSI进一步加剧caspase-3表达式(图2 (c))。助教也显著加重心肌细胞损伤,就是明证上层清液中LDH含量增加(图2 (d))。
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3.3。Notch信号缺陷加剧Burn-Induced心肌损伤在活的有机体内
我们使用一个条件RBP-J-knockout方法进一步阐明的角色Notch1 postburn心肌信号通路。水平的水平明显高于血清CK, LDH RBP-J KO小鼠中发现在12 h和24 h postburn受伤比正常小鼠受到烧伤损伤数据3(一个)- - - - - -3 (c))。TUNEL染色显示,燃烧伤害诱导凋亡细胞RBP-J KO小鼠比正常小鼠(数字3 (d)和3 (e))。这些数据表明,Notch1中断信号加剧postburn心肌损伤。
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3.4。切口封锁导致ROS增加生产
我们对大鼠心肌细胞对烧伤血清活性氧产量缺口信号的缺失。数据4(一)和4 (b)表明烧伤血清明显增加心肌细胞ROS水平由流式细胞仪,和封锁Notch信号GSI烧伤血清后显著增加活性氧水平的挑战。在在活的有机体内实验中,小鼠受到烧伤病人12 h。同样的现象被发现在RBP-J KO小鼠(图4 (c))。RBP-J KO小鼠超氧化物生产在KO小鼠相比显著增加控制老鼠。这些结果表明,加剧了心肌损伤造成切口封锁是由活性氧产量的增加。我们进行预处理心肌细胞GSI和暴露了细胞燃烧血清,其次是与活性氧清除剂NAC治疗进一步调查这一假设。助教明显增加血清在烧伤后大鼠心肌细胞ROS水平的挑战。形成鲜明对比,NAC有效降低ROS GSI-treated和车辆组(数字5(一个)和5 (b))。GSI-treated组表现出恶化细胞凋亡和LDH水平相比汽车组。值得注意的是,南汽显著降低心肌细胞凋亡和LDH水平(数字5 (c),5 (d),5 (e))。这些发现表明,封锁Notch信号严重postburn心肌损伤通过增加活性氧的生产。
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3.5。的差别Notch信号中断,从而对这些MnSOD
线粒体呼吸提供了超过90%的细胞内ROS,由MnSOD回收。MnSOD在心肌细胞的表达对烧伤血清的存在GSI显著下调(图6(一))。在在活的有机体内实验中,RBP-J KO小鼠受到烧伤MnSOD表达的差别也表现出了一个重要的对这些心肌(图6 (b))。这些数据表明,封锁Notch信号表达下调MnSOD表达式,这增加了活性氧清除和加重心肌损伤。
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3.6。Notch信号变弱封锁STAT3激活在燃烧伤害
JAK2 / STAT3信号transactivates MnSOD,这表明Notch1信号会使转录抑制的MnSOD通过减少STAT3激活并导致活性氧增加,加剧了氧化应激损伤。数据6 (c)和6 (d)表明烧伤血清明显减少p-JAK2 p-STAT3表达式,以及抑制Notch1信号通过GSI进一步减毒p-JAK2 p-STAT3表达式。RBP-J KO小鼠受到燃烧伤害也表现出显著的差别进一步对这些p-JAK2和p-STAT3表达心肌(数字6 (e)和6 (f))。
3.7。抑制JAK2 / STAT3信号优先严重烧伤后心肌损伤
我们的研究结果表明,Notch1加剧的抑制活性氧的生产,并通过抑制心肌损伤JAK2 / STAT3信号。额外进行了一系列的实验来获取更多的证据来支持这一假说。大鼠心肌细胞受到烧伤血清如上所述,对待AG490 (JAK2 / STAT3抑制剂,2μ米)或AG490 +助教。数据7(一)和7 (b)表明治疗AG490显著降低p-JAK2和p-STAT3表达式。治疗GSI + AG490诱导没有额外的效果。的表达MnSOD有一致的趋势(图7 (c))。AG490治疗也显著增加氧化应激和加重心肌损伤。治疗GSI + AG490诱导没有额外的心血管效应(数字7 (d)- - - - - -7 (g))。这些结果表明,抑制JAK2 / STAT3信号优先加剧postburn心肌损伤,和JAK2 / STAT3信号Notch1心脏保护中发挥了关键作用。
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4所示。讨论
本研究发现了以下主要结果。首先,基因敲除或药物抑制Notch1显著加重心肌损伤在体外和在活的有机体内。第二,我们首次展示了Notch信号封锁加剧postburn心肌损伤通过JAK2 / STAT3信号,其表达下调MnSOD表达和增加活性氧的水平。这些结果表明,内生Notch1 burn-induced心肌损伤信号是至关重要的,这个信号通路可能作为一种新的治疗目标。
Notch信号是高度相关的损伤心肌功能和适当的反应。我们先前的研究发现,Notch1击倒显著加剧MI / R损伤,就是明证肿大梗塞大小、抑郁的心脏功能,提高心肌细胞凋亡(13]。激活的Notch1 Jagged1也减毒MI / R损伤。目前的研究调查了Notch1通路的作用首次在burn-induced心肌损伤,进一步证实了Notch1心血管效应的途径。这些数据类似于先前的研究在其他实验中Notch信号施加保护在一些病理生理条件,包括酒精性心肌病(10),心肌梗死(11),和心脏肥大(12]。
活性氧引起氧化应激和作为的主要中介postburn心肌损伤(7,20.,21]。越来越多的证据表明,Notch1通路中发挥着关键作用在活性氧的生产22- - - - - -24]。我们之前的研究也表明,激活Notch1信号抑制ROS生产肝缺血/再灌注(I / R)损伤和MI / R损伤(14]。我们目前的数据表明,完整的切口缺乏burn-induced ROS增加产量缺口RBP-J基因敲除小鼠,这表明Notch1心血管效应的途径参与活性氧的规定。
氧化应激是一个失衡的生产和消除活性氧(25]。在正常情况下,人体有一个强有力的抗氧化防御系统,反对过度ROS的生成。然而,在某些病理条件下,这些天然抗氧化剂防御损坏或过度ROS生成,并发生氧化应激,导致结构和功能损伤(26]。在生物体抗氧化防御系统是复杂的。其中,MnSOD是细胞抗氧化系统中最关键的酶(27]。
在目前的研究中,我们的研究结果表明,MnSOD,这是一个关键在线粒体活性氧清除剂,缺切口后明显下调。这些观察表明,降低SOD活性负责提供的抑制ROS切口postburn心肌缺。
Janus激酶/信号传感器和激活转录(JAK / STAT)信号通路在后生动物中控制多个生物过程的发展和组织恒定性28]。四种哺乳动物的木菠萝(JAK1 2 3和Tyk2)和7个哺乳动物统计(STAT1、2、3、4、5, 5 b,和6)已确定(29日]。JAK2 / STAT3信号通路是一个高度的进化途径参与细胞增殖、分化、凋亡和炎症30.- - - - - -32]。最近的研究发现,JAK2 / STAT3信号通路中发挥着重要作用心肌I / R损伤(33- - - - - -35]。某些心血管药物,包括硫化氢和fasudil,防止心肌I / R损伤通过激活JAK2 / STAT3的生存途径(36,37]。越来越多的证据证实JAK2 / STAT3信号起着至关重要的作用在氧化应激反应的调节35,38]。同样,我们目前的研究发现,抑制JAK2 / STAT3信号AG490显著增加氧化应激和加重postburn心肌损伤,支持JAK2 / STAT3信号的关键作用burn-induced心肌损伤。
JAK2 / STAT3信号调节的转录MnSOD [14]。我们目前的数据表明,封锁Notch信号明显减弱p-JAK2 p-STAT3表达,这表明Notch1的抑制信号会使通过减少STAT3 MnSOD转录激活并导致活性氧增加,加剧了I / R损伤。优先抑制JAK2 / STAT3信号也加剧了氧化应激和postburn心肌损伤,和预处理GSI没有影响。这些结果进一步支持了这种观点,即Notch信号调节氧化应激和postburn心肌损伤通过JAK2 / STAT3信号。这些数据类似于我们之前的研究表明,规范Notch信号保护肝细胞免受I / R损伤通过JAK2 / STAT3信号的激活,激活MnSOD的表达,导致活性氧清除。
然而,在这项研究中需要注意的一些限制。ROS的机制影响的差别后,对这些Notch1相当复杂。Notch1通路报道心肌增强Akt活动(39]。和其他结果从我们以前的研究表明,PI3K / Akt信号burn-induced心肌细胞凋亡中发挥了重要作用[40- - - - - -42]。有趣的是,几项研究表明,一种蛋白激酶信号调控活性氧产量在几个模型(43- - - - - -45]。这些事实表明,PI3K-Akt信号可能发挥重要作用在监管期间Notch1燃烧氧化应激的损伤。进一步的研究需要进一步研究Notch1氧化应激的可能机制。
在结论中,我们使用基因敲除和药物抑制Notch1展示小说的角色Notch1 burn-induced心肌损伤的信号。Notch信号也可防止burn-induced心肌损伤通过JAK2 / STAT3信号,激活MnSOD表达和抑制gp91phox表达和导致减少ROS水平。这些发现表明新的限制burn-associated心肌损伤的治疗靶点。
利益冲突
作者声明没有竞争的经济利益。
作者的贡献
Weixia Cai,杨Xuekang Shichao汉,海涛郭贡献同样这项工作。
确认
作者感谢实验室的其他成员的洞察力和技术支持。这项工作是支持部分由中国国家自然科学基金(号。81201463,81272084,31100827),中国山西省自然科学基金(没有。2014 jq4153),第四军医大学医院Xijing助推器程序(没有主题。XJZT14M04)。