吸烟提取物诱导的Graves眼病患者眼眶成纤维细胞氧化应激和纤维化相关基因表达

摘要

吸烟是Graves眼病发展或恶化的最重要危险因素。吸烟引起的活性氧生成增加可能与此有关。然而，吸烟对眼眶成纤维细胞的影响尚不清楚。我们的研究表明，Graves眼眶成纤维细胞对香烟提取物的应激反应增强，氧化应激增加，纤维化相关基因表达，特别是结缔组织生长因子和细胞内转化生长因子-水平增加β1和interleukin-1β．本研究结果为吸烟对Graves眼病的影响提供了一些线索，为抗氧化剂治疗Graves眼病的潜在和合理应用提供了理论依据。

1.介绍

Graves眼病(GO)，也称为Graves眼病、甲状腺相关眼病或甲状腺眼病，是一种美容毁容和潜在的视力威胁疾病。虽然氧化石墨烯的病理生理机制尚未完全阐明，但它是多种内源性和环境因素相互作用的复杂过程[1- - - - - -4］．吸烟是氧化石墨烯发生或恶化的最重要的环境和风险因素，风险随着目前每天吸烟人数的增加而增加[5- - - - - -7］．此外，吸烟与氧化石墨烯治疗反应不良有关[8- - - - - -10]，而戒烟是目前预防氧化石墨烯的唯一方法[11，12］．在Planck等人的研究中，一些与脂肪细胞相关的即时早期基因，白介素- (IL-) 1β，与不吸烟者相比，氧化石墨烯严重活跃的吸烟者IL-6过表达，表明吸烟激活了与脂肪生成和炎症相关的途径[13］．然而，氧化石墨烯中吸烟有害影响的确切机制仍有待确定。有人提出，烟可通过与周围鼻窦直接接触或间接通过血液循环在眶窝中诱发活性氧(ROS)的生成[14］．据报道，香烟烟雾提取物(CSE)通过与IL-1或ROS协同作用，刺激培养的眼眶成纤维细胞的脂肪细胞分化[12，14］．在我们之前的研究中，我们证明了ROS可以诱导培养的氧化石墨烯眼眶成纤维细胞中一种重要的成纤维因子结缔组织生长因子(CTGF)的蛋白表达[15］．本研究的目的是研究氧化应激、纤维化相关基因表达的变化胞内细胞因子在对CSE反应的眼眶成纤维细胞的原代培养中。我们还评估了cse是否诱导氧化应激，纤维化相关基因表达，以及胞内细胞因子氧化石墨烯眼眶成纤维细胞的抗氧化剂预处理可降低细胞的活性。

2.材料和方法

2．1．患者和组织获取

5例GO (GO1-GO5)患者眼眶减压术的手术标本(男1例，女4例;平均年龄:37岁)和5名年龄和性别匹配的患者(N1-N5)(1名男性和4名女性;平均年龄:36岁)。所有标本都是根据《赫尔辛基宣言》和患者的知情同意收集的。所有氧化石墨烯患者在术前至少6个月的抗甲状腺药物治疗后均达到稳定的甲状腺功能正常，并维持在氧化石墨烯的非活性阶段。此外，所有研究对象均未接受氧化石墨烯的特殊治疗(全身类固醇或放疗)。排除标准包括氧化石墨烯以外的眼部疾病、饮酒、定期摄入抗氧化剂和怀孕。此外，患有慢性或急性疾病的患者，如糖尿病、高脂血症、肺、肝、肾疾病、癌症、其他内分泌功能障碍、免疫或炎症疾病也被排除在外。

2．2.眼眶成纤维细胞原代培养

眶成纤维细胞原代培养是根据我们之前的研究建立的[16］．简单地说，在磷酸盐缓冲盐水(PBS, pH 7.3)中无菌地将眼眶组织切成小块，然后与含有0.5%胶原酶和溶解剂的无菌溶液(Sigma-Aldrich Chemical Co.， St. Louis, MO, USA)在充满5% Co气氛的培养箱中孵育24小时₂保持在37°C。将消化的眶组织混合物离心成颗粒，然后再悬浮在Dulbecco 's Modified Eagle 's Medium (DMEM，购自Gibco Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA)中，该培养基含有10%胎牛血清(FBS)和抗生素混合物(生物工业，Kibbutz Beit Haemek，以色列)。由100 U/mL青霉素G和100μg/mL硫酸链霉素(生物工业，Kibbutz Beit Haemek，以色列)。培养的眶成纤维细胞在第3代和第5代之间使用，相同传代数的细胞培养用于同一组实验。

2．3.香烟烟气提取物(CSE)的制备

CSE是根据以前的研究编制的，稍加修改[12，14］．本研究使用的是商业卷烟(购自台湾台北的长寿卷烟包装)，每根卷烟焦油含量为10毫克，尼古丁含量为0.8毫克。用抽烟机连续抽10支香烟，生成200毫升预热的CSE-PBS溶液。每根烟抽3min，将CSE-PBS溶液的pH调至7.4，然后通过0.22-μm孔径过滤器(Millipore Corporation, Billerica, MA, USA)，可去除大颗粒和细菌。CSE- pbs溶液定义为100% CSE，后续实验将使用DMEM稀释CSE。通过测量320nm波长(光密度= 2.0-2.2)的吸光度对CSE制剂进行标准化，在320nm波长下观察到的吸光度规律在CSE不同制剂之间变化不大。在目前的研究中，CSE的浓度范围为0 - 15%。

2．4．CSE和抗氧化剂治疗眼眶成纤维细胞

PBS缓冲液(pH 7.4)冲洗两次后，将眼眶成纤维细胞用1% ~ 15%浓度的CSE处理24小时。为了研究抗氧化剂是否能阻断CSE的作用，我们用1mm n -乙酰半胱氨酸(NAC)或2mm维生素C (VitC)预处理眼眶成纤维细胞1小时，然后分别诱导5% CSE治疗24小时。

2．5．细胞活力测定

用台盼蓝排除试验测定细胞活力，用血球计计数。在排除0.4%台班蓝的基础上测定活细胞数(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)。相对细胞活力用未加CSE处理的细胞值进行归一化，用三次独立实验结果的平均值±SD表示。

2．6．活性氧含量测定

来自2 '，7 ' -二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA, Molecular probes, Eugene, OR, USA)的探针将用于评估细胞内H₂O₂内容(17］．经20μM DCFH-DA在37°C下处理20分钟，胰蛋白酶化细胞，然后在0.5 mL PBS缓冲液(pH 7.4)中重悬，用流式细胞仪分析(Beckman-Coulter, Miami, FL, USA) EPICS XL-MCL模型。激发波长设置为488 nm, DCFH-DA探针在FL1通道上记录525 nm处10000个细胞发出的荧光强度。数据通过EXPO32进行分析™软件(Beckman-Coulter，迈阿密，佛罗里达州，美国)。细胞内H₂O₂处理后的细胞内含量以相对值表示，与未处理的细胞相比₂O₂或CSE治疗。

2.7。脂质过氧化的测定

用分光光度法测定培养的眼眶成纤维细胞脂质过氧化产物丙二醛(MDA-586;OxisResearch Inc.，波特兰，OR，美国)，根据制造商说明[18］．在与显色剂n -甲基-2-苯基吲哚反应中，MDA被量化，形成强烈着色的碳菁染料，最大吸光度在586 nm。该方法针对丙二醛而不是其他脂质过氧化产物，如4-羟基烯醛，因为在实验条件下它们在586 nm处不能产生显著的吸光度。采用0-50浓度范围内的MDA样品建立MDA标准曲线μM，眶成纤维细胞MDA水平归一化至细胞数(10⁶细胞)。结果以三个独立实验结果的平均值±SD表示。

2.8。免疫印迹分析

等分50μg蛋白在10% SDS-PAGE上分离，并印迹在PVDF膜上(Amersham-Pharmacia Biotech Inc.， Buckinghamshire, UK)。用5%脱脂牛奶在TBST缓冲液(50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20, pH 7.4)中封闭1小时后，在室温下与一抗再孵育1小时。用TBST缓冲液洗涤三次后，用辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗在室温下再孵育1小时。一种增强化学发光检测设备(英国白金汉郡Amersham-Pharmacia生物技术有限公司)是用于检测蛋白质信号富士x射线胶片(日本东京富士胶片Corp .),以及信号的强度被第三映象LabScan 6.0软件量化(通用电气医疗集团生物科学公司,皮斯卡塔韦,新泽西,美国)。HO-1抗体(SC-10789)和CTGF抗体(SC-14939)购自Santa Cruse Biotechnology Inc. (CA, USA)β-actin (#A1978)分别购自Sigma-Aldrich Chemical Co. (MO, USA)。所有数据均以三次独立实验结果的平均值±SD表示。

2.9。实时逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)

通过SYBR green-based real-time quantitative PCR检测纤维化相关基因的表达水平。简单地说，在加入TRIZol试剂(MO，美国)后，用氯仿溶液从眶成纤维细胞裂解液中提取细胞总RNA。提取的RNA用异丙醇溶液沉淀，冰干，用DEPC-H溶解₂5的折算μ用Ready-to-Go RT-PCR试剂盒(Amersham Biosciences，乌普萨拉，瑞典)在42°C条件下过夜，将RNA逆转录为cDNA。根据制造商说明书使用SYBR Green Master试剂盒(Sigma-Aldrich)进行定量RT-PCR [18］．引物对5 -CTCAACACGGGAAACCTCAC-3和5 -CGCTCCACCAACTAAGAACG-3 18 s rRNA, 5“-CTGCAGGCTAGAGAAGCAGAG-3”和5的-GATGCACTTTTTGCCCTTCT-3 CTGF, 5“-CTGGCCGAAAATACATTGTAA-3”和5的-CCACAGTCGGGTCAGGAG-3纤连蛋白,和5 -GGACATCCACTTCCACAGC-3和5的-GGTCATCGTCGCCTTCTC-3载脂蛋白J,分别。眶成纤维细胞中各基因的mRNA表达水平分别与18S rRNA基因的mRNA表达水平标准化。

2.10。细胞内细胞因子含量的测定

人转化生长因子- β 1 (TGF-β1;目录#DB100B)和白细胞介素1β(il - 1β；用购自R&D Systems, Inc.(明尼阿波利斯，MN)的酶联免疫吸附测定试剂盒对细胞培养上清中的水平进行定量。简单地说,大约10⁵将眼眶成纤维细胞接种于3.5 cm培养皿中，37℃、5% CO的细胞培养箱中培养48小时₂分别用1 mM NAC或2 mM VitC预处理1小时，再诱导CSE处理24小时。根据制造商的建议和我们之前的研究[19]，细胞培养上清4℃，12,000 ×g离心，等量立即测定。TGF-的标准β1和il - 1β在0 ~ 200 pg/mL范围内使用，结果按细胞数归一化，表达为pg/10⁴细胞。

2.11。统计分析

使用Microsoft Excel 2010统计软件包和SigmaPlot 12.3软件(Systat software Inc.， San Jose, CA, USA)对结果进行分析，数据以三次独立实验结果的均数±标准差(SD)表示。对照组与实验组差异的显著性水平由学生的差异决定以及。差异被认为是有统计学意义的值< 0.05值< 0.01。

3.结果

3．1.cse诱导的眼眶成纤维细胞的细胞毒性和氧化应激

为了研究烟提取物对眶成纤维细胞的细胞毒性作用，我们用不同浓度的CSE处理眶成纤维细胞24小时。图中显示了用台班蓝排除试验测定的CSE对GO患者(GO1-GO5)和正常受试者(N1-N5)眼眶成纤维细胞活力的影响，其范围为0 - 15%1．数据显示，正常成纤维细胞和氧化石墨烯成纤维细胞分别以剂量依赖的方式减少(图1(一))．5% CSE治疗后，正常和氧化石墨烯眼眶成纤维细胞存活率差异有统计学意义(图)1 (b)分别是85%和62%，)．另一方面，我们也观察了cse诱导氧化应激和氧化反应在氧化石墨烯眼眶成纤维细胞。不同浓度CSE(0-15%)处理氧化石墨烯眼眶成纤维细胞24小时后，流式细胞仪DCF染色检测细胞内ROS和Western blot检测血红素加氧酶-1 (HO-1)蛋白表达均呈剂量依赖性增加(图)2)．

３．２．与正常对照组相比，氧化石墨烯眼眶成纤维细胞易受5% cse诱导的氧化应激和氧化损伤以及抗氧化剂的保护作用

由于与正常对照组相比，5% CSE暴露可显著降低氧化石墨烯眼眶成纤维细胞的细胞活力，因此我们决定在接下来的实验中使用5% CSE处理正常和氧化石墨烯眼眶成纤维细胞。用5% CSE处理眼眶成纤维细胞24小时后，DCF染色测量的正常和氧化石墨烯眼眶成纤维细胞内ROS分别显著增加(图)3(一个)，和)．此外，在添加5% CSE 24小时后，正常和氧化石墨烯眼眶成纤维细胞的脂质过氧化标志物丙二醛(MDA)也分别显著升高(图)3 (b)，和)．此外，我们注意到，5% CSE处理后，GO眼眶成纤维细胞内ROS和MDA水平的诱导率分别比正常对照组更明显(图)3(一个)和3 (b)，和)．另一方面，我们也观察了NAC和VitC对cse诱导的氧化应激和氧化损伤的保护作用。分别用1mm NAC或2mm VitC预培养1小时后，DCF染色检测到GO眼眶成纤维细胞中5%的细胞内ROS水平显著降低(图)3 (c)，和)．分别用1 mM NAC或2 mM VitC预培养氧化石墨烯眼眶成纤维细胞后，可显著降低5% cse诱导的MDA含量升高(图)3 (d)，和)．

3．3．与正常对照组相比，GO眼眶成纤维细胞易受5% cse诱导的纤维化相关基因表达变化的影响

之前，我们已经证明细胞内氧化应激升高与氧化石墨烯眼眶成纤维细胞中纤维化相关基因表达的增加有关[15］．在本研究中，我们进一步研究了5% cse诱导的ROS是否能诱导眶成纤维细胞纤维化相关基因的表达。通过SYBR green的RT-PCR，我们观察到5% CSE治疗24小时后，正常和GO眼眶成纤维细胞的纤维化相关基因表达水平显著升高，包括载脂蛋白J、纤维连接蛋白和CTGF(表)1，与，与,与、职责)。此外，5% CSE在GO眼眶成纤维细胞中诱导载脂蛋白J、纤维连接蛋白和CTGF的比例比正常对照组更明显(表)1，，,、职责)。

3．4．抗氧化剂对氧化石墨烯眼眶成纤维细胞中5% cse诱导的纤维化相关基因表达的抑制作用

为了研究5% CSE诱导的氧化石墨烯眼眶成纤维细胞纤维化相关基因表达是否能被抗氧化剂阻断，我们分别用1mm NAC或2mm维生素C预处理眼眶成纤维细胞1小时，然后用5% CSE处理。结果显示，1 mM NAC或2 mM VitC预孵育细胞后，SYBR green-基RT-PCR结果显示，5%的氧化石墨烯眼眶成纤维细胞中载脂蛋白J、纤维连接蛋白、CTGF等与纤维化相关基因表达明显抑制(表)2)．1mm NAC处理对载脂蛋白J、纤维连接蛋白和CTGF的抑制率分别为14%、17%和13% (，,、职责)。在GO眼眶成纤维细胞中，2mm维生素C对载脂蛋白J、纤维连接蛋白和CTGF的抑制率分别为24%、28%和27% (，,、职责)。因此，我们也通过Western blot检测了cse诱导的CTGF蛋白表达水平。结果显示，在GO眼眶成纤维细胞中加入5% CSE 24小时后，CTGF蛋白表达明显增加(图)4，)．此外，2 mM VitC预处理氧化石墨烯成纤维细胞也能抑制43%的CTGF蛋白表达升高(图)4，)．

3．5.与正常对照相比，5% cse诱导氧化石墨烯眼眶成纤维细胞内细胞因子的变化和抗氧化剂的保护作用敏感

5% CSE刺激眼眶成纤维细胞后细胞内细胞因子的变化见表3.．TGF-的基础水平β1和il - 1β与正常对照组相比，氧化石墨烯眼眶成纤维细胞的含量显著升高(和、职责)。此外，CSE诱导TGF-明显升高β1和il - 1β与相应对照组比较的氧化石墨烯眼眶成纤维细胞含量(和、职责)。此外，TGF-的诱导率β1和il - 1β5% CSE刺激后，GO眼眶成纤维细胞比正常对照组更明显(和、职责)。表格45% cse诱导的细胞内TGF-升高显著降低β1和il - 1β氧化石墨烯眼眶成纤维细胞经1 mM NAC (和)或2毫米VitC (和、职责)。

4.讨论

越来越多的证据表明氧化应激在氧化石墨烯的发育中起着重要作用[17，20.- - - - - -22］．我们在这项研究中证明，CSE在氧化石墨烯眼眶成纤维细胞中引发了更明显的氧化应激反应。更重要的是，这是第一次研究表明，与正常对照组相比，CSE可以诱导GO眼眶成纤维细胞纤维化相关基因的表达，特别是CTGF。此外，NAC、维生素C等抗氧化剂预处理对CSE对氧化损伤、纤维化相关基因表达及TGF-诱导的影响具有明显的保护作用β1和il - 1β．

眼眶成纤维细胞是氧化石墨烯的主要靶细胞之一，与许多氧化石墨烯相关的病理状况有关，包括氧化应激[14，15，23］．氧化应激也被认为在氧化石墨烯的有害影响中扮演了一个角色[14］．本研究提供的证据表明，氧化石墨烯眼眶成纤维细胞比正常对照组更容易受到cse诱导的细胞毒性和氧化应激。cse诱导的ROS积累可能导致更多的氧化损伤，包括氧化DNA损伤和脂质过氧化，这可以部分解释我们之前的观察，在GO患者中吸烟者尿液中8-羟基-2 ' -脱氧鸟苷(8-OHdG)明显高于从不吸烟者[24］．此外，ROS的生成增加，特别是超氧阴离子和过氧化氢的生成，可以刺激氧化石墨烯眼眶成纤维细胞的增殖[19]，并诱导产生促炎细胞因子[25，这些都是GO的关键病理特征。此外，香烟烟雾介导的氧化应激可以召集炎症和免疫细胞，如淋巴细胞、巨噬细胞和中性粒细胞，并激活一些促炎介质[26]，可能加剧氧化石墨烯的炎症和组织重塑过程。

氧化石墨烯的病程不仅表现为早期炎症过程，还表现为组织重塑和/或纤维化。虽然纤维化是氧化石墨烯的一个静止期，但它可能导致大量的实质性发病率，这通常对传统的药物治疗无效，需要手术干预。氧化应激被认为是一种可以诱发各种病理性纤维化的因素[27，28］．在本研究中，我们还注意到香烟烟雾介导的氧化应激可诱导GO眼眶成纤维细胞中载脂蛋白J、纤维连接蛋白、CTGF等纤维化相关基因的表达，而抗氧化剂预处理可抑制这些作用。载脂蛋白J、纤维连接蛋白和CTGF通常被认为是重要的纤维形成因子。虽然载脂蛋白J在氧化石墨烯纤维化过程的发展中是作为纤维化的生物标志物还是适应性反应尚不清楚，但CTGF已被证明在很大程度上参与了各种纤维化疾病的发病机制，如肝、心、肾和眼纤维化[29- - - - - -32］．CTGF具有多种细胞功能，包括产生细胞外基质、细胞迁移、增殖、分化等。重要的是，CTGF是TGF-的关键β-介导的成纤维细胞-肌成纤维细胞转分化和随后的细胞外基质沉积[33]，可能参与氧化石墨烯组织重塑和纤维化过程。也有报道称，吸烟中的尼古丁可通过影响CTGF促进牙周纤维化[34］．综上所述，之前的报告和我们在这项研究中的发现可能部分解释了为什么吸烟与严重氧化石墨烯以及氧化石墨烯免疫抑制治疗的不良反应有关。

我们之前发现，低浓度的过氧化氢可以诱导促炎细胞因子的产生，如TGF-β1和il - 1β氧化石墨烯眼眶成纤维细胞[19］．本研究进一步观察到，5% CSE诱导细胞内TGF-水平升高β1和il - 1β在氧化石墨烯眼眶成纤维细胞中的含量高于正常对照组。5% cse诱导TGF-升高β1和il - 1β在氧化石墨烯眼眶成纤维细胞中有明显的抑制作用。TGF -β1是一种有效的成纤维因子，据报道可调节成纤维细胞的增殖和组织纤维化[35，36］．il - 1β，氧化石墨烯中一种重要的促炎细胞因子，已被证明能刺激眼眶成纤维细胞中透明质酸的合成[37］．成纤维细胞增殖、组织纤维化和透明质酸积累都是氧化石墨烯临床表达的重要病理特征。总的来说，这些发现表明氧化应激在吸烟对氧化石墨烯的恶化作用中起着重要的作用。

综上所述，本研究表明，氧化石墨烯成纤维细胞对香烟提取物的刺激反应增强，氧化应激、纤维化相关基因表达以及细胞内TGF-水平升高β1和il - 1β．本研究结果为研究吸烟对氧化石墨烯的影响提供了一些线索，为抗氧化剂治疗氧化石墨烯的潜在和合理应用提供了理论依据。

相互竞争的利益

作者对本文所提及的材料没有任何商业利益。

致谢

本研究获行政院科技部MOST104-2314-B-075-056-MY2及MOST104-2320-B-715-006-MY2及台北退伍军人总医院V105-C-022资助。作者对国立阳明大学和麦凯医学院核心设施的技术支持和服务表示感谢。

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