文摘

过多的脂肪酸和糖的摄入会影响心血管疾病的发展,包括心肌梗塞。但是,底层的机制是不清楚的。我们调查prosurvival之间的平衡和有害的通路在C57Bl / 6心吃普通食物的同类雄性老鼠(SD)或高脂肪高果糖饮食(HFHF) 12周和暴露于心脏体外缺血/再灌注(IR)损伤。饮食操纵老鼠心里唤起一种适应性反应,所展示的内容从肌凝蛋白重链对碘氧基苯甲醚的转变α来β的增加表达Nlrp3 inflammasome、氧化代谢标记的差别,对这些缺氧诱导因子(HIF -) 2α和再灌注损伤抢救激酶(风险)的途径。暴露在红外光谱、HFHF小鼠心脏显示更大的梗塞大小和乳酸脱氢酶释放与SD鼠相比。这些效应相关的加重了过度Nlrp3 inflammasome,导致标志caspase-1激活和心血管风险/ HIF-2妥协激活α通路。破坏这里报道的常见机制导致更好的理解相声prosurvival和有害的途径导致心血管疾病的发展与代谢疾病相关。

1。介绍

心血管疾病与代谢相关疾病被称为代谢疾病疾病(CMDs)。尽管最近出版的一些文件和论文建议临床和社会干预防止CMDs和受益对象患有这些并发症,常见的疾病机制的识别是远未明朗。越来越多的证据表明,过量的脂肪酸和糖摄入影响心血管疾病的发展和进展,包括心肌梗塞、通过增加局部炎症反应,同时,通过减少保护性反应的效率,通常由短暂缺氧激活(1- - - - - -3]。但是,导致这些障碍的潜在机制是复杂的,,更透彻地了解是必要的。

当暴露于一个缺血性侮辱心肌细胞容易从脂肪酸(FA)氧化对糖酵解代谢,增加葡萄糖摄取保持ATP生成和心脏功能的支持。这种代谢的灵活性的丧失是不适应的心脏的主要特征。例如,与食源性肥胖小鼠暴露于每日重复brief-duration心肌缺血表现出早期心肌基因的差别而深刻的对这些参与FA氧化,如muscle-type肉碱palmitoyltransferase 1 (CPT-1m)和碳链acyl-coenzyme脱氢酶对瘦老鼠(2]。此外,过度FA氧化已被证实能引起心脏功能障碍在肥胖和糖尿病4]。

之一,最近发现炎性信号通路参与CMDs nod样受体pyrin域包含3 (Nlrp3) inflammasome大型multimeric蛋白质复杂的中介活动的乳沟prointerleukin - (IL) 1β和地震活动形式(5]。我们和其他人最近表明,激活Nlrp3 inflammasome导致心力衰竭的发展和食源性肾脏功能障碍(6,7),主要是通过诱导il - 1β生产过剩和地震。这些细胞因子il - 1家庭调节产生胰岛素的胰腺β细胞功能和作为炎症介质在心肌缺血/再灌注(IR)损伤(8,9]。产生活性氧(ROS)在红外,可能激活Nlrp3 inflammasome和所有已知Nlrp3 inflammasome活化剂成分也会生成活性氧簇ROS而活性氧抑制剂阻止Nlrp3 inflammasome激活(10- - - - - -12]。缺血性损伤也可能唤起prosurvival瞬时激活的信号通路,几项研究表明,适应缺氧条件规定的相对活动分子如Akt、extracellular-signal-regulated激酶(ERK)和糖原合成酶激酶- (GSK) 3β加在一起构成了所谓的再灌注损伤抢救激酶(风险)途径13,14]。风险的激活途径赋予对红外避免伤心脏保护线粒体渗透性转换孔开放的出现再灌注(15]。有趣的是,这prosurvival风险通路信号不是很有效的肥胖和胰岛素抵抗动物模型(16]。例如,心从32周高脂肪饮食的老鼠显示受损基底的表达和激活prosurvival风险通路信号相比,老鼠在正常饮食(3]。

其他防护途径包括蛋白质家族坐标在转录水平的细胞反应氧的可用性,主要的缺氧诱导因子(HIF -)α(17]。HIF-1 peri-infarct地区和HIF-2蛋白质都是增加心肌梗死后大鼠和人类,和他们强大的保护似乎暗示机制调节葡萄糖摄取和利用和保护线粒体功能(18- - - - - -21]。HIF-2α表达发生在偏远地区的梗塞[18),有必要维持正常的脂质稳态,作为本构HIF-2激活肝细胞导致脂肪酸机会受损,降低脂肪生成的基因表达,增加脂质存储容量(22]。这些数据表明HIF-2更广泛的作用α在几个CMDs的病理生理学,包括缺血性心脏疾病。

然而,以上提到的研究调查dysmetabolic条件(即的直接影响。,diet-induced insulin resistance) on the potential cross-talk among these different prosurvival and detrimental signaling pathways involved in ischemic myocardial dysfunction. Thus, we investigated the effects of an obesogenic/diabetogenic high-fat high-fructose (HFHF) diet on cardiac tolerance to IR challenging in mice and we validated the relevance of impaired pivotal intracellular mechanisms, in the heart, a key target organ of CMDs.

2。材料和方法

2.1。动物和饮食操纵

雄性C57Bl / 6 j小鼠(查尔斯河实验室、Calco、LC、意大利)年龄在4周后被随机分配到饮食方案:一个标准的低糖低脂饮食(控制,)和高脂肪高果糖饮食(HFHF),12周。标准的饮食(D12450K,研究饮食公司,新布伦瑞克,新泽西州,美国)组成如下:70%的热量碳水化合物从麦芽糊精从玉米淀粉(55%和15%),10%的热量脂肪(5%来自大豆、5%来自黄油)。高脂肪高果糖饮食(D03012907,研究饮食Inc .)组成如下:35%的热量碳水化合物从麦芽糊精和25%果糖(10%),45%的热量脂肪(5%来自大豆、40%来自猪油)。所有组收到的饮料和食物随意。

动物协议是在这项研究中被批准的当地“动物使用和保健委员会”,并按照欧盟指令2010/63 /欧盟的保护动物用于科学目的。所有组收到的饮料和食物随意。

2.2。一般参数

每周体重和食物摄入量都被记录下来。空腹血糖测定的协议通过隐静脉穿刺,每4周使用一个(GlucoGmeter Menarini诊断,佛罗伦萨,意大利)。

血压和脉搏率是评估在11周的饮食操纵10连续测量的平均值得到在早晨使用tail-cuff血压计(IITC;生命科学、林地,CA)。

2.3。体外缺血/再灌注(IR)损伤

经过12周的饮食操纵、控制和HFHF老鼠用500 U肝素预处理与硫喷妥钠麻醉(50毫克/公斤)腹腔注射之前被颈椎脱位扑杀。心被迅速切除,血液从胸腔腔迅速收集,等离子体是孤立的。切除心脏灌注迅速在80毫米汞柱Langendorff技术包含(mM)氯化钠118 Krebs-Henseleit碳酸氢盐缓冲,NaHCO₃25日,4.7氯化钾,KH₂阿宝₄1.2,MgSO₄1.2,CaCl₂1.25,和葡萄糖11。缓冲区被毒气毒死O为95%₂:5%的公司₂。灌注系统的温度保持在37°C。

30分钟后稳定时期,心灵受到红外协议,由在全球30分钟的流体,性常温缺血后再灌注的一段60分钟心的两组(红外控制和红外HFHF)。心控制,HFHF老鼠,稳定后,进行了90分钟只灌注(虚假的控制和虚假HFHF)和免疫印迹分析作为参照组(见下面)。

心脏灌流液流出的是收集和测量。冠状动脉污水收集用于测量乳酸脱氢酶(LDH)释放。评估冠状动脉流量实验制备的条件是由灌流液的数量以一个特定的时期。

灌注期结束,心里迅速远离灌注装置分为两个部分,一个日冕部分(垂直于长轴);在顶端部分(少于1/3的心室质量)在液氮快速冻结,储存在−80°C,随后用于免疫印迹和组织学分析,心室基底的部分被用于评估梗塞大小。

2.4。梗塞大小评估

梗塞区域评估最后的实验氮蓝四唑(电视台)技术(23]。心室的基底部分被横截面切割成2 - 3片。后20分钟37°C的孵化0.1%解决方案电视台(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)在磷酸盐缓冲剂,清白的坏死组织是仔细分开染色可行的组织由一个独立的观察者,不知道是谁的协议。既然缺血是全球性的,我们只分析了基底的部分心室,坏死的质量表示为一个百分比的分析缺血性组织(%在缺血性梗塞大小的组织,% /)。

2.5。检测乳酸脱氢酶(LDH)释放

灌注的废水收集在缺血前5分钟立即和整个再灌注期。LDH释放心里的分光光度分析在340纳米23]。

2.6。生化参数

血浆血脂是由标准酶程序使用试剂盒(甘油三酯(TG)、胆固醇和高密度脂蛋白(HDL);意大利的佛罗伦萨,Hospitex诊断)。低密度脂蛋白(LDL)的计算公式:总胆固醇−[HDL + (TG / 5)]。血浆胰岛素水平测量使用酶联免疫吸附试验(ELISA)工具包(Mercodia AB,乌普萨拉,瑞典)。

2.7。油红染色

心脏intramyocellular脂质积累被10日油红染色评估μm顶点cryostatic部分。被认为在奥林巴斯Bx4I显微镜下观察染色组织(40 x放大)与一个AxioCamMR5摄影附件(蔡司,哥廷根,德国)。

2.8。免疫组织化学

GLUT-4 10日评估表达式μm顶点cryostatic部分免疫组织化学。内源性氧化物酶灭活了孵化部分与0.3% H 5分钟₂O₂。部分被堵塞1 h和3% BSA在PBS。一夜之间,因此,部分被孵化与兔子anti-GLUT-4主要抗体(Abcam,剑桥,英国)其次是HRP-conjugated二级抗体。部分与高分辨率相机数字化(蔡司)20 x放大。

2.9。免疫印迹分析

总蛋白提取获得10% (w / v)的顶端匀浆里帕缓冲区(0.5%诺乃清洁剂p 40, 0.5%钠脱氧胆酸盐,0.1% SDS, 10 L更易与EDTA和蛋白酶抑制剂)。使用布拉德福德测定蛋白质含量测定。蛋白质提取存储在−80°C到使用。等量的蛋白质分离通过sds - page和electrotransferred硝化纤维膜。探讨了膜与山羊反α肌球蛋白重链(αmhc),山羊抗βmhc,兔子anti-carnitine palmitoyltransferase (CPT) 1 m,鼠标anti-succinate脱氢酶(SDH)、anti-glucose运输-(过剩)4主要抗体(Abcam,剑桥,英国),兔子anti-phospho-insulin受体2 (),和鼠标anti-IRS-2(细胞信号,丹弗斯,妈,美国),兔子anti-Nlrp3(美国Epitomics,伯林盖姆,CA),兔子anti-caspase-1,兔子anti-pERK1/2,兔子anti-ERK,兔抗兔子,兔子anti-Akt anti-pGSK-3,兔子anti-GSK-3β、鼠标国内外诱导因子- (HIF -) 2α和山羊anti-hydroxynonenal (HNE)(罗福斯生物制品,阿宾顿,英国)主要抗体,其次是孵化与拨款HRP-conjugated二级抗体(Bio-Rad实验室、大力神、钙、美国)。蛋白质与发射极耦合逻辑检测系统检测到(发射极耦合逻辑清晰、Bio-Rad实验室、大力神、钙、美国)和量化微使用分析软件(数量、Bio-Rad实验室、大力神、钙、美国)。结果规范化对α微管蛋白光密度值。

2.10。材料

除非另有说明,所有化合物都购自Sigma-Aldrich有限公司(圣路易斯,密苏里州,美国)。抗体是来自圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯、钙、美国)。

2.11。统计分析

所有的值表示为±SD方法。Shapiro-Wilk测试是用来评估变量的常态分布。单向方差分析后跟Bonferroni事后测试中采用对比选择双组:控制虚假和控制红外;控制虚假与HFHF骗局;控制红外与HFHF红外;HFHF骗局而HFHF IR。一个值< 0.05被认为是具有统计学意义。统计测试进行GraphPad Prism 6.0软件包(GraphPad软件、圣地亚哥、钙、美国)。

3所示。结果

3.1。一般参数

HFHF饮食的12周后,小鼠显示,身体总重量明显增加,伴随着减少heart-to-body重量比和血浆空腹血糖水平显著增加,胰岛素,甘油三酯和胆固醇,当控制老鼠相比(表1)。相比之下,HFHF饮食并不影响收缩压或脉搏率(数据没有显示)。

3.2。食源性心脏适应

作为一个肌球蛋白重链(MHC)同种型内容的转变α来β众所周知,导致心力衰竭的发展,我们测量了两个功能不同的心脏的心脏表达MHC亚型的免疫印迹分析。如图1(一),显著增加β平行的mhc表达式表达略有下降αMHC在小鼠的心脏长期暴露在HFHF饮食相比,从控制老鼠的心,从而确认重大MHC同种型转变。这种效应与大幅增加CPT-1m和SDH,后两种氧化代谢标记,HFHF饮食曝光(图1 (b))。

此外,油红O染色显示心脏部分的intramyocellular脂质积累HFHF老鼠(图中没有检测到控制老鼠1 (c))。

3.3。梗死面积和LDH释放增加HFHF心

当老鼠进行了心肌红外,红外梗塞HFHF组记录规模翻了一番关于记录在控制红外(图2(一个))。总LDH释放60分钟再灌注期间证实这种观察,因为它达到了2.5倍增加HFHF IR组与对照相比,红外光谱值(图2 (b))。

3.4。HFHF和红外损伤对心脏的影响GLUT-4易位和表达和IRS-2激活

免疫组织化学和免疫印迹分析表明,易位从胞质膜(图3(一个)(图)和表达式3 (b))GLUT-4都减少HFHF饮食,从而表明食源性心肌细胞的胰岛素抵抗。这证实了显著增加磷酸化率IRS-2从而使胰岛素信号HFHF心里评估免疫印迹(图3 (c))。诱导的红外挑战GLUT-4易位和IRS-2激活控制老鼠,老鼠在HFHF-fed红外没有明显修改GLUT-4表达式和易位或IRS-2磷酸化率,对HFHF骗局(数字3(一个),3 (b),3 (c))。

3.5。HFHF和红外损伤对心脏的影响脂质过氧化和线粒体氧化应激

通过免疫印迹分析如图所示,HFHF饮食诱导显著增加HNE-protein加合物在虚假的和红外实验条件控制的老鼠相比,从而展示一个健壮的食源性脂质过氧化产物(图的生产4(一))。有趣的是,心暴露在红外挑战引发的脂质过氧化水平的进一步提高产品控制和HFHF组(图4(一))。抗氧化剂MnSOD酶的表达测量时,一个重要upregulation记录后慢性HFHF饮食治疗。相比之下,红外损伤诱导MnSOD表达中心的控制老鼠而不是HFHF小鼠的心脏,因此这表明抗氧化防御HFHF心不能进一步增加了红外(图4 (b))。

3.6。NLRP3 Inflammasome复杂的激活

评估通过免疫印迹分析,红外感应强烈upregulation两Nlrp3 inflammasome并激活caspase-1心中样本HFHF控制鼠标,虽然基础表达水平Nlrp3 inflammasome和激活caspase-1骗局HFHF老鼠心脏已经大大高于心(图记录在虚假的控制5)。

3.7。风险途径激活

控制饮食的心,红外挑战没有诱导phospho-ERK1/2的重大变化(图6(一)),而显著增加phospho-Akt / Akt(图6 (b))和phospho-GSK-3β/ GSK-3β比率(图6 (c))被观察到。ERK1/2的基底的水平,一种蛋白激酶,GSK-3β磷酸化的心HFHF组显著低于报道在控制饮食的心。的IR-induced upregulation酶磷酸化后饮食操纵仍低于唤起同样的侮辱控制老鼠和没有记录在ERK1/2表达和磷酸化的影响。

3.8。HIF-2α激活

十二周的HFHF饮食导致轻微的但不是在HIF-2显著减少α表达心中提取。心从控制小鼠暴露于红外HIF-2经历了一个健壮的感应α表达式。相比之下,心中HFHF老鼠,HIF-2的表达水平α降低了HFHF暴露和红外控制虚假报道价值,剩余显著低于红外控制心(图7)。

4所示。讨论

在这项研究中,我们表明,慢性喂养一个HFHF饮食诱发心脏组织的适应性反应,如图所示的α-βmhc同种型转变,表达的增加线粒体氧化代谢的标记,如CPT-1m和SDH,减少心肌葡萄糖吸收。有趣的是,尽管增加氧化代谢的标记,HFHF饮食与intramyocytes甘油三酯积累有关,这表明FA的严格监管过程吸收和利用摄动。这些影响是由一个健壮的平行增加标记线粒体氧化应激和脂质过氧化的心HFHF老鼠。类似的结果之前记录在不同实验模型的糖尿病心肌病(24,25)和心肌脂质积累的影响收缩期心脏损伤的表现是众所周知的(26]。虽然有对比数据模型中对心脏缺血后结果食源性dysmetabolism [27),我们在这里记录恶化心脏的致胖/红外效果在动物暴露于致糖尿病的饮食。为了更好地阐明饮食操纵对心肌的影响红外受伤,我们评估IR-related信号通路的表达和激活。研究最广泛的保护瀑布之一,参与调节许多心血管的保护作用干预的风险通路(16,28,29日]。有趣的是,成员的活动的风险通路,包括一种蛋白激酶,ERK1/2, GSK-3β条件,通常是受损的糖尿病、肥胖、胰岛素抵抗和高胆固醇血症(3,16,29日,30.]。在这种背景下,我们之前报道,高脂肪高糖饮食导致减少Akt-mediated胰岛素信号(21,31日]。在这里,我们表明,保护心肌的风险通路调节心脏红外具有挑战性,最值得注意的是,这个upregulation迷失在HFHF老鼠。这些结果表明,风险降低激活有助于HFHF加重心肌损伤的老鼠。这是与其他作者的研究结果一致表明,代谢紊乱的存在废除保护preconditioning-induced激活的风险通路(16,30.,32]。早期结果的风险通路激活心脏缺氧的反应是增加HIF-2的表达式α在偏远地区的梗塞[18]。HIF-2α调节关键过程的长期适应和维护线粒体稳态调节生产的抗氧化酶(33]。最近的一项研究报告之间的联系减少一种蛋白激酶信号和诱导受损蛋白质活动(34]。此外,最近的研究表明,HIF-2α直接调节IRS-2转录在糖尿病小鼠在活的有机体内在原发性肝细胞,从而改善胰岛素敏感性和增加Akt激活(35,36]。我们的结果进一步扩展这个观察,首次展示,一个心脏HIF-2 HFHF饮食产生负面影响α表达式在红外光谱,从而影响心脏的IR和相关的激活胰岛素信号。

有趣的是,保护的食源性抑制信号通路与一个健壮的心肌蛋白质含量的增加Nlrp3 inflammasome。的关键作用Nlrp3 inflammasome中央中介组织损伤的炎症反应在心肌梗死或胰岛素抵抗是已知7,37,38]。强烈的表达之间的相关性Nlrp3 inflammasome-related基因和胰岛素抵抗在肥胖男性受试者最近报道与葡萄糖耐量和2型糖尿病患者(39,40]。此外,基因或药物抑制Nlrp3 inflammasome减少梗塞大小和限制食源性肥胖的发展(41,42]。然而,目前的研究是我们所知,第一个证明Nlrp3蛋白诱发的upregulation红外伤害大幅提高食源性代谢紊乱的存在。这些发现表明潜在的关联活动的增加Nlrp3 inflammasome后代谢紊乱和增强对心肌缺血的侮辱。总的来说,饮食和IR-induced氧化还原平衡可能代表的关键事件导致信号通路的修改。事实上,一项研究表明,HIF-2α基因敲除小鼠显示multiorgan损害由于活性氧过剩[43),和基因删除HIF-2α导致的氧化应激水平增加标记(33]。符合这些发现,我们观察到降低HIF-2的表情α和MnSOD HFHF老鼠暴露在红外,这可能占HNE-adducts急剧增加。同样,线粒体氧化应激的主要刺激引发Nlrp3激活(44- - - - - -46]。例如,HNE治疗视网膜色素上皮细胞强烈诱导Nlrp3表达,导致il - 1β和地震生产(47]。我们可能,因此,推测氧化不平衡将在风险/ HIF-2障碍α途径可以恶化引发的促炎反应Nlrp3激活。然而,需要进一步的调查,以更好地阐明信号通路之间的复杂机制串音发病机理和潜在的操作也CMDs的决议。

实验模型提出了允许我们研究的内在能力心肌买得起IR的挑战在严格控制的环境中,避免extracardiac影响和可能的温度和抵押品流量变化的影响。然而,我们知道目前的研究的一些局限性,包括缺血后心肌的血流动力学和功能数据的缺乏和不可能的解剖之间的氧化还原对缺血后坏死和惊人的影响。未来特别的研究与技术实现,必须澄清这些方面。

总之,我们的研究结果清楚地表明,高脂肪高果糖饮食改变不同的信号通路参与心脏红外受伤。虽然心血管通路的元素表达下调,那些由HFHF炎症过程的调节饮食和红外伤害加剧了这些不适应的途径调节。这些结果提供进一步改善我们的理解之间的联系心血管和代谢损伤。然而,还需要进一步的研究来更好的阐明这些途径的相互交互在CMDs发病机制,从而使识别的新治疗靶点改善肥胖和糖尿病患者的缺血后恢复。

利益冲突

作者没有利益冲突声明。

承认

本研究支持都灵大学的资助(Ricerca地区ex - 60%, 2013 - 2014年)。