文摘

肝缺血再灌注(I / R)损伤是一种严重的并发症在临床实践中。但是,没有有效的生物标志物可用于I / R损伤的严重程度的评价。最近,renalase据报道,涉及了I / R损伤的各种器官。这种蛋白质分泌到血液增加氧化应激的反应。调查renalase氧化压力的响应性,我们检查了renalase的变化在细胞和小鼠模型。我们观察到显著增加renalase HepG2细胞中表达时以时间和剂量依赖性的方式治疗H₂O₂。Renalase表达也显著增加肝组织进行了肝脏I / R的过程。增加renalase水平可以有效地抑制抗氧化剂在体外和在活的有机体内。此外,血清renalase水平显著增加小鼠模型,也有效地抑制了抗氧化剂治疗。renalase之间的变化趋势是一致的,肝酶的小鼠模型。总之,renalase高度敏感和氧化应激反应在体外和在活的有机体内。此外,renalase可以检测到血液中。这些属性使renalase非常有前途的生物标志物评估肝脏I / R损伤的严重程度。

1。介绍

缺血是停止的血液供应,造成氧气的短缺;缺血后再灌注是恢复血液供应。缺血再灌注(I / R)过程发生在许多临床重要事件,包括肝对于手术,移植,创伤,和出血性休克1- - - - - -3]。肝脏I / R损伤是不可避免的并发症导致严重的细胞死亡,组织损伤,和肝脏功能障碍,这就增加了死亡率(4- - - - - -6]。活性氧(ROS),氧化应激的主要毒物,在肝脏I / R损伤[扮演至关重要的角色7- - - - - -10]。正弦内皮细胞,血管内皮细胞,肝枯否细胞或多形核白细胞激活的I / R过程并产生大量的活性氧在氧化应激过程中,包括超氧化物、过氧化氢(H₂O₂)、羟基自由基、一氧化氮。ROS生产的主要因素负责损害肝实质细胞,增加血管通透性,诱导炎性细胞浸润(2,11- - - - - -15]。H₂O₂是最丰富的和稳定的活性氧。它会导致氧化应激,涉及多种炎性疾病(16,17]。H₂O₂可以转化为羟基自由基,非常被动,比其他有毒活性氧(8,9]。在这种背景下,H₂O₂是完美的代理建立在细胞氧化应激模型并模拟I / R损伤在体外在某种程度上。

它提出了I / R损伤是一个复杂的过程中,氧化剂和抗氧化的平衡改变的氧化剂(18]。治疗与超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)减少ROS水平,迅速为SOD超氧化物歧化酶()H₂O₂和猫H拾荒₂O₂生产水,减少氧化应激的程度(5]。SOD和CAT旁边,各种化合物和生物材料被开发为I / R损伤的潜在治疗药物(6,17]。然而,它仍然缺乏有效的、具体的和敏感的生物标志物的准确评价氧化应激在肝脏I / R损伤的严重程度(19]。

Renalase,无处不在的黄素腺嘌呤dinucleotide-containing氨基酸氧化酶,已经涉及到I / R损伤的过程(20.]。自2005年首次被发现,renalase被报道合成各器官,包括肾脏、心脏、肝脏和脂肪组织(21]。Renalase分泌进入血液,以应对增加氧化应激(22- - - - - -24]。高架renalase水平应力条件下使renalase潜在生物标志物评估器官I / R损伤的严重程度。

在目前的研究中,我们表明,renalase是一个敏感的ROS-responsive基因在肝细胞。在肝脏I / R损伤小鼠模型,renalase增强肝脏和血液中。此外,renalase的增加可以改善抗氧化剂预处理,可以减少氧化应激的程度,在体外和在活的有机体内。这些发现提供证据表明renalase可以作为一种有效的和敏感的生物标志物早期预警或评估肝脏I / R损伤的严重程度。

2。材料和方法

2.1。道德声明

所有动物实验进行按照美国国立卫生研究院(NIH)指南发表的实验动物保健和使用由美国国家卫生研究院(NIH出版,2011年8日版)和同济医学院伦理委员会的批准,华中科技大学,中国。

2.2。试剂和细胞培养

H₂O₂戊巴比妥钠、SOD和猫从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。人类肝癌细胞株HepG2从美国购买类型文化集合(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)。细胞在DMEM(高葡萄糖;表达载体,麦迪逊,美国WI)补充10%的边后卫(美国UT HyClone,洛根)和100 U /毫升青霉素- 100μg / mL链霉素(美国Gibco,卡尔斯巴德,CA)和保存在一个湿润的气氛在37°C公司为5%₂在一个孵化器(热费希尔科学Inc .)、沃尔瑟姆,妈,美国)。

2.3。在活的有机体内肝脏I / R模型

的在活的有机体内肝脏I / R模型进行如前所述[3,16,17,25]。雄性C57BL / 6小鼠,年龄在8 - 12周,购自北京大学(中国,北京)和保持食物饮食在12 h光/ 12 h黑暗环境中在25°C同济医学院的动物保健设施。在无菌条件下手术在老鼠身上进行的政府戊巴比妥钠腹腔内注射(50毫克/公斤)的。一小时前的戊巴比妥钠麻醉,I / R + SOD +猫组腹腔注射300 KU 60毫克/公斤/公斤SOD和猫,而虚假的老鼠和I / R组注射生理盐水作为溶剂通过相同的方法。剖腹手术是由垂直开2.5 - 3厘米的前部分腹部麻醉老鼠。识别门户三和弦和胆道树后,肝动脉和门静脉主干,除了脉管系统下叶,与血管夹夹紧达到大约70%的肝脏缺血性损伤。1 h后缺血,再灌注是通过释放血管夹。没有血管夹了虚假的组的老鼠。然后,切口与丝绸缝合关闭。6个小时再灌注后,肝脏叶进行了I / R和相应的老鼠的肝脏叶假组被移除和用于进一步分析。 Histological evaluations (H&E staining and IHC of cleaved caspase-3) were performed to quantify the degree of liver injury. Confocal immunofluorescence imaging of frozen sections was performed to detect the renalase levels. Western blotting and real-time qPCR were performed to detect the protein levels and mRNA expression of renalase in liver tissue. Blood was taken by eyeball extirpating and then centrifuged for serum separation, and the serum was used for detection of levels of the renalase and liver enzymes.

2.4。免疫印迹分析

如前所述(26- - - - - -28),总细胞和组织细胞溶解使用里帕裂解缓冲,和蛋白质浓度测定BCA蛋白质化验设备(美国皮尔斯公司,罗克福德,IL)。蛋白质提取用于sds - page(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)和蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜(美国微孔,Billerica的),这是阻止5%脱脂牛奶TBS 3 h和孵化与各种主要抗体在一夜之间在4°C。孵化后HRP-conjugated二级抗体(稀释1:5000)1 h在室温条件下,膜的处理ECL试剂(170 - 5061年,Bio-Rad大力神、钙、美国)之前使用ChemiDoc议员可视化成像分析系统(美国Bio-Rad大力神,CA)根据制造商的指示。特定的蛋白表达水平正常化β微管蛋白在同一硝化纤维膜。以下主要抗体和稀释:anti-renalase (GTX89570稀释1:1000)从GeneTex购买(欧文、钙、美国);反β微管蛋白(sc - 9104,稀释1:2000)购买从圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯、钙、美国)。

2.5。实时RT-RCR

如前所述(29日,30.),总RNA分离使用试剂盒试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的指示。2μ克总RNA是相对地记录使用RNA PCR试剂盒(豆类生物技术,首先,日本),以及由此产生的cDNA被用作PCR模板。mRNA水平由实时qPCR ABI棱镜7900序列检测系统(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)根据制造商的指示,和β微管蛋白作为内生控制。实验进行了一式三份。相对基因表达水平进行了计算比较方法应用公式。引物序列实时qPCR表中列出1。

2.6。共聚焦免疫荧光

收集新鲜缺血再灌注肝叶和生理盐水冲洗去除剩余的血液。组织切成6 -μ米厚的部分冻结切片切片机。部分被沉浸和固定在4%多聚甲醛在室温下1/2小时。之后,部分被孵化5%牛血清白蛋白(BSA)和immunolabeled表示抗体(renalase GTX89570, GeneTex)一夜之间在4°C。洗后,部分被孵化Alexa萤石594山羊anti-rabbit免疫球蛋白(R37117,英杰公司)为1 h。洗后,4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)添加到染色细胞核的冰。组织荧光成像在共焦显微镜(硅铝合金,尼康)。renalase的定量表达式,分析了荧光的密度ImageJ 1.44便士软件。

2.7。肝脏组织学和包含IHC

Formalin-fixed肝脏标本嵌入在石蜡块,切成5μ米的部分。部分被苏木精和伊红染色组织学。对于包含IHC,部分deparaffinized,水化与乙醇和二甲苯和加热到95 - 98°C的20分钟10毫米柠檬酸缓冲,pH值6.0。与PBS阻塞后含有10%山羊血清1 h在室温下,部分被孵化的主要抗体1:200裂解caspase-3一夜之间在4°C。与二次抗体孵化后,部分安装,评估一个奥林巴斯显微镜。

2.8。检测血清肝酶

丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、gamma-glutamyl转肽酶(GGT)、碱性磷酸酶(ALP)、乳酸脱氢酶(LDH)测定血清中使用自动生化分析仪(TBA-40FR、东芝、日本东京)。相关检测试剂盒购自MedicalSystem生物技术有限公司,宁波,中国。

2.9。检测血清Renalase蛋白质水平

renalase血清中蛋白质含量的测定使用鼠标renalase (rnl)酶联免疫试剂盒(MU30925 Bio-Swamp,武汉,中国)根据制造商的指示。简而言之,先稀释标准。添加血清40μL测试好,然后添加生物素化的anti-RNLS-antibody 10μL,轻轻混合。孵化为30分钟37°C。干燥和洗好。添加HRP-Conjugate试剂50μL之间,除了空白。孵化和清洗。然后加入发色体解决方案和孵化为15分钟37°C。测量光密度(OD) 450海里添加后15分钟内停止解决方案。计算根据制造商的指示。

2.10。统计分析

先前的研究中描述(31日,32),统计分析与社会科学统计软件包(SPSS 13.0版;美国IBM分析,芝加哥,IL)。所有的数据都表示为平均数±标准差(标准差,SD),分析了单向方差分析测试的区别。使用学生的统计分析t以及成对数据。被认为是显著的区别。

3所示。结果

3.1。增加Renalase HepG2细胞诱导表达的H₂O₂

探讨氧化应激的影响renalase表达式HepG2细胞,这些细胞被孵化与H₂O₂在不同浓度和不同时间。首先,HepG2细胞孵化与H₂O₂增加浓度(0μ米、100μ米、200μ米、500μ米,1000μ分别为6 h M)。随着H₂O₂浓度,renalase比例增加(图的mRNA的表达1(一))。的最大表现renalase检测浓度为500μm . Renalase表情略孵化时浓度的1000年有所下降μ相比之下,500μM(图1(一))。这表明1000年的浓度μ米可能超出了细胞的负担得起的范围和造成细胞死亡。我们使用浓度较高(1000μ米、2000μ米、3000μ米,5000μ米)H₂O₂治疗细胞,发现细胞死亡增加H浓度的增加₂O₂。治疗以2000μM H₂O₂6 h甚至可能导致超过一半的细胞死亡。没有细胞能存活5000年的浓度μM H₂O₂(数据没有显示)。然后,与500年HepG2细胞被孵化μM H₂O₂不同的时间(15分钟、30分钟、1 h、3 h, 6 h, 12 h, h和24)。增加孵化时间诱导renalase mRNA表达的比例增加(图1 (b))。的最大表现renalase测量的孵化时间12 h。Renalase表达减少当孵化24 h(图略1 (b))。这表明这些细胞可能不会容忍H的长期培养₂O₂。此外,renalase在HepG2细胞的蛋白质含量与500年孵化μM H₂O₂6小时或者12 h测量和发现更大的孵化时间越长(,数据1 (c)和1 (d))。

3.2。抑制H₂O₂全身增强Renalase表达式HepG2细胞介导的抗氧化剂预孵化

抗氧化剂可以降低氧化应激的严重程度。调查是否H₂O₂全身renalase表达的增强HepG2细胞可以减少抗氧化剂,细胞与300年preincubated KU 60 mg / L / L SOD和猫2 h。在H₂O₂治疗,SOD和CAT-containing介质被FBS-free介质所取代。结果表明,SOD /猫预培养显著降低H₂O₂全身renalase mRNA表达的增强HepG2细胞(,图2(一个))。此外,SOD /猫预培养显著降低H₂O₂全身renalase HepG2细胞中的蛋白质含量的增加(,数据2 (b)和2 (c))。

3.3。增加Renalase表达与组织学损害肝脏I / R损伤小鼠模型和抑制Renalase表达增加了抗氧化剂

在肝脏I / R损伤小鼠模型,renalase mRNA表达肝脏显著增强(,图3(一个)),SOD和CAT的腹腔内注射前显著增加(减少,图3(一个))。小鼠模型的肝脏renalase蛋白质含量显著增加(,图3 (c)),也可以抑制腹腔内注射前的SOD和CAT (,图3 (c))。这个结果证实了免疫印迹(数字3 (b)和3 (c))和共聚焦免疫荧光成像(图4 (b))。组织学评价表明,I / R引起水肿的肝组织和细胞的变性和坏死。显著改善观察I / R + SOD +猫组(图4(一))。符合观察水肿的变性和坏死在I / R,肝细胞凋亡增加布朗在细胞内染色的裂解caspase-3在大多数肝细胞。显著减少的裂解caspase-3染色观察I / R + SOD +猫组(图4(一))。

3.4。增加Renalase的血清和肝酶在肝脏I / R损伤小鼠模型和抑制Renalase和肝酶增加了抗氧化剂

肝脏酶(ALT、AST、GGT、高山,和LDH)和renalase水平测定的血清肝脏I / R损伤小鼠模型。renalase水平被发现显著增强肝脏I / R过程()。ALT水平()、AST (),高山()和LDH ()显著升高肝脏I / R组相比,虚假的组,而GGT略微增加肝脏I / R组和虚假的组没有统计学意义()。增加的ALT, AST、LDH和renalase水平可以有效地抑制(renalase、ALT和LDH:;AST:),SOD和CAT的腹腔内注射前。高山和GGT也可以抑制抗氧化剂,但无统计学意义()I / R组(图5)。

4所示。讨论

肝脏I / R损伤可能发生在肝切除术,肝移植,创伤,和血管手术33- - - - - -35]。这是一个严重的并发症在临床实践中。氧化还原平衡的过程中肝脏I / R损伤导致活性氧积累,提出了这种疾病最常见的调用机制在肝脏I / R损伤(33]。抑制ROS-burst在氧化应激是一个有效的方式来减轻肝脏I / R损伤。然而,早期预警、评估的严重性,或氧化应激的治疗效果,这是更重要的是在临床实践中肝脏I / R损伤的管理,是一个剩余的挑战。这是由于缺乏有效的,具体的,敏感的生物标志物的严重程度的准确评价氧化应激(19]。生化标记用来评估氧化应激的程度包括丙二醛(MDA) (36,37)、抗坏血酸(AA) /脱氢抗坏血酸(DHA) (38,39),以及一系列的炎症,促炎、抗炎生物标记(40- - - - - -42]。然而,这些标记面临各种各样的限制。MDA是脂质过氧化作用的标志,通常在I / R损伤的四肢43]。MDA和心肌坏死标志物之间的密切关系已经报道(36),但MDA水平能否反映氧化应激或I / R损伤的严重程度的其他器官尚不清楚。AA和DHA水平的确定是一个挑战,因为这些化合物的稳定性质的39]。炎症、促炎和抗炎标记覆盖广泛的细胞因子。然而,这些细胞因子不是具体的评估氧化应激。因此,一个有效的、具体的和敏感的生物标志物来评估氧化应激仍然是急需的。

人类renalase基因位于染色体10 q23.33和编码保守蛋白renalase由342个氨基酸组成。Renalase据报道,有效地降低血液中多巴胺和肾上腺素(21),它已证明这是唯一参与儿茶酚胺代谢的酶,可以分泌进入血液循环到目前为止(44]。先前的研究表明,renalase是多功能的,并与氧化应激密切相关的条件,如中风、心脏移植,或急性肾损伤45- - - - - -48]。考虑其与氧化应激的关系紧张,renalase被认为扮演一个角色,或者至少响应,在肝脏I / R损伤的过程。

特别是,H₂O₂被认为是最丰富的和稳定的活性氧。H₂O₂是一个温和的氧化剂,但转化为羟基自由基,这是非常被动的,比其他有毒活性氧(49,50]。因此,调查renalase的响应性肝细胞氧化应激的情况下,H₂O₂被用来模拟ROS-burst氧化应激。细胞模型在体外,常见的肝癌细胞系HepG2被选中。Renalase表达式与H HepG2细胞表现出正相关₂O₂浓度和培养时间。这些结果表明,renalase ROS-burst或氧化应激反应在肝细胞,这是敏感的程度或氧化应激的严重程度和持续时间。

干扰氧化还原平衡特性的氧化应激过程中肝脏I / R损伤,从而导致ROS-burst和抗氧化剂消耗(33]。最有效的方法来改善氧化应激是补充ROS-scavenging抗氧化剂17]。SOD是一种常见的抗氧化剂,这是广泛分布在哺乳动物生物(51]。它是一个重要的自由基清除剂,在若干国家已临床应用。猫也是一种内源性抗氧化剂,它可以催化地分解H₂O₂(52,53),但尚未应用于临床实践。在这项研究中,使用了SOD和CAT的预培养细胞。我们观察到,SOD /猫预培养显著改善的海拔renalase HepG2细胞中表达。抗氧化剂的应用减少了氧化应激的严重性,和响应海拔renalase表达相应的改善。这个结果表明renalase对肝细胞氧化应激的治疗手段。和的表达renalase密切相关学位或氧化应激的程度。

肝脏I / R损伤小鼠模型是最常用的动物模型在各种研究肝脏I / R损伤和氧化应激在活的有机体内。我们使用这个模型来调查renalase是否对肝脏I / R损伤在活的有机体内。Renalase表达显著增加肝脏的肝I / R损伤小鼠模型。腹腔内注射前的SOD和CAT的海拔renalase改善肝脏显著。此外,一致的高低差异renalase表达式在肝脏和肝损伤的程度,包括组织坏死和细胞凋亡、被观察到。肝酶是最重要的评价指标标准肝功能测试(融通)面板。血清肝酶水平,包括ALT、AST、GGT、高山,和LDH,增加了不同程度的肝脏I / R损伤小鼠模型。一致,血清renalase肝脏I / R损伤小鼠模型的水平明显升高。血清的海拔renalase或肝酶可以显著降低SOD和CAT的腹腔内注射前。这些结果表明,renalase对肝脏I / R损伤和治疗手段。肝组织的表达密切相关,氧化应激和随后的肝损伤的严重程度。 Moreover, the serum renalase level can sensitively reflect the severity and therapeutic effect of oxidative stress in the process of hepatic I/R injury. Combining with the standard LFT panel, more accurate and specific evaluations of the hepatic I/R injury can be made.

总之,我们所知,本研究首先展示的价值和适用性renalase作为一个有前途的生物标记的严重性评估氧化应激在肝脏I / R损伤。我们调查了响应renalase条件与氧化应激有关在体外和在活的有机体内。我们的研究结果表明,氧化应激有效地诱发renalase表达式的高程在体外和在活的有机体内。此外,这个高架renalase表达式可以减少抗氧化剂。其敏感响应性氧化应激的严重性和方便检测血液中使renalase的理想生物标志物的严重程度和治疗效果的评价肝脏I / R损伤。在未来,临床治疗决策基于检测血液中的renalase活动可能有助于改善肝切除术的临床结果,肝移植、创伤或血管外科手术。然而,renalase血清水平的变化趋势肝脏I / R过程在不同条件下和时间点没有被证明在这项研究中,需要进一步调查。旁边的I / R损伤,有各种病理生理过程相关的氧化应激。Renalase可能在这些过程中扮演角色,Renalase表达这些过程的变化趋势可能不同。相关研究可能使renalase作为一种新的检验项目,这可以帮助现有的检验项目,使疾病更准确的评估。其他潜在renalase在临床实践中的应用需要进一步探索和调查。

信息披露

投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表,或准备的手稿。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作是财务支持的科研训练计划为年轻人才从同济医学院联合医院,HUST李(家具);中国自然科学基金会理李(81602419);中国自然科学基金黄库恩(81500348);自主创新基金HUST会理李(0118530218);中国自然科学基金Jiliang小王(81570568);研究基金会的公益健康产业,2014年,中国卫生部Guobin小王(201402015);湖北省自然科学基金(2013 cfb131历下王);的基础卫生和计划生育委员会湖北省(WJ2015MB075延锋妞妞)。