文摘

目标。移植动脉硬化被认为是主要影响因素之一器官移植后移植物的存活时间。在这项研究中,我们提出了一个假设的番茄红素是否能通过调节保护移植血管的关键蛋白质表达与动脉硬化有关。方法。同种异体主动脉移植手术使用Brow-Norway老鼠一样捐赠者和刘易斯老鼠接受者。移植后,接受者被分成两组:同种异体移植物组和番茄红素组。负控制老鼠(同基因移植物组)也成立。组织病理学染色进行观察病理变化,和ki - 67的表达水平,caspase-3, Rho-associated激酶,细胞间粘附分子(ICAM-1),和以挪士被评估。免疫印迹分析和实时PCR也进行了定量分析。结果。组织病理学染色显示血管狭窄和番茄红素治疗后内膜的增厚不明显。ki - 67, ROCK1、ROCK2 ICAM-1表达水平明显下降。然而,以挪士表达嫁接番茄红素治疗后动脉和等离子体环鸟苷酸浓度增加。结论。番茄红素能减轻血管动脉硬化在同种异体移植物移植通过下调Rho-associated激酶和规范表达式通过没有/ cGMP通路的关键因素,这可能为移植提供一个潜在的有效的方法在临床器官移植动脉硬化。

1。介绍

虽然重大进展在免疫抑制剂的应用大大提高了器官移植的成功率(1),移植动脉硬化(TA)也被认为是移植失败的主要原因之一,在许多移植患者(2]。血管损伤主要包括缺血再灌注损伤,长期使用免疫抑制药物,浸润的炎性细胞因子,急性或慢性移植排斥。在早期阶段,这些伤害会损伤血管内皮,损害血管内皮功能,并促进迁移和血管平滑肌细胞(VSMC)增殖,最终可导致动脉硬化闭塞(3]。因此,船保护治疗器官移植后移植被认为是至关重要的,这将有效防止移植动脉硬化的发生(4]。

番茄红素是一种天然类胡萝卜素存在于西红柿和番茄制品。它被认为是一个最有效的单线态氧物种类胡萝卜素(5]。其失活能力两倍的β-胡萝卜素和维生素e的100倍的研究报道,番茄红素可以增加活性和一氧化氮(NO)的表达水平(6]。此外,cGMP-dependent蛋白质kinase-I (PKG-I)被认为是一个关键的中介没有/ cGMP通路(7]。众所周知,番茄红素能保持血管内皮的正常功能通过调节通过NO / cGMP通路相关因子表达。一些研究发现,番茄红素具有抑制作用在内膜的增厚和媒体人抽烟。此外,番茄红素可以抑制炎性因子在血管内膜的附着力,减少血管内膜损伤(8]。此外,激活Rho-associated激酶(岩石)也起着重要的作用在血管动脉硬化9]。因此,岩石表达水平的检测是在本研究证明机制移植动脉硬化的进展。

本研究的目的是探讨番茄红素对移植血管的保护作用。假设也提出:番茄红素是否保护移植血管vasotransplantation后通过调节NO / cGMP通路和Rho-associated激酶表达参与了动脉硬化。结果表明,番茄红素能减轻血管移植动脉硬化,调节关键因素的表达相关信号通路的血管,并减少炎症因素的渗透通过其抗氧化作用。这可能会提供一个潜在的有效的治疗方法在临床器官移植移植动脉硬化。

2。材料和方法

2.1。动物

十六岁男性Brow-Norway刘易斯(BN)老鼠和32男大鼠8周的年龄(200 - 220克)是至关重要的河流提供的实验动物科技有限公司有限公司(中国,北京)。所有老鼠都安置在12小时光和12小时黑暗周期24°C±1°C,他们随意喂食实验开始前一个星期。所有动物的程序是基于国际准则和批准温州医科大学动物政策和福利委员会。

2.2。主动脉移植

主动脉移植进行基于前面描述的方法(10]。在刘易斯老鼠同源的主动脉移植手术,同种异体主动脉移植手术使用Brow-Norway (BN)老鼠一样捐赠者和刘易斯老鼠接受者。这些老鼠被腹腔注射戊巴比妥麻醉(60毫克/公斤)。腹主动脉(10 - 15毫米)静脉注射肝素后收获来自捐赠者。足够的灌注生理盐水后,主动脉移植物移植到受者和网状与腹主动脉端到端使用noninterrupted以10 - 0尼龙缝线。总操作缺血时间一直限制在30分钟。手术被认为是成功的时候有完全的移植动脉开放,没有明显的吻合口出血。然后,接收方被分成3组。第一组(与生理盐水),治疗8周后车辆同基因移植物(1毫升/天,同基因移植物组);第二组(与生理盐水),治疗8周后车辆同种异体移植物(同种异体移植物组);第三组(与番茄红素)治疗8周(30毫克/公斤/天,番茄红素组)后同种异体移植物。操作后,所有接受者与头孢他啶治疗(100毫克/公斤)连续3天。

2.3。组织病理学

移植后移植都是收获8周。移植血管组织是组织病理学染色固定在4%多聚甲醛。在乙醇和二甲苯梯度脱水后,血管组织被嵌入在石蜡,切成5μ米部分切片机。deparaffinization和补液后,部分被苏木精和伊红染色(他染色)一般形态学检查和病理分析。内膜面积计算减腔区域包围的区域内部弹性薄板衬里。血管内膜增生和动脉狭窄度的测量在光学显微镜下(原始放大×200)和分析Image-Pro + 6.0图像分析软件(银泉媒体控制论)。10多个领域进行评估从每个部分在每组和中值使用。所有的测量进行盲目的幻灯片。

2.4。酶联免疫吸附试验(ELISA)

收集血液样本在每组移植后8周。老鼠的等离子体环鸟苷酸浓度定量衡量使用酶联免疫试剂盒(美国明尼苏达州的研发系统,Inc .)根据制造商的指示前面描述的(11]。所有的ELISA实验至少重复三次。

2.5。实时定量逆转录-聚合酶链反应(实时rt - pcr),

根据协议,以前被林等。12),总RNA从容器中提取标本使用试剂盒试剂。引物序列如下:ROCK1,向前5′-TGGTTGGGACGTACAGTAAAA-3′和反向5′-GTAAGGAAGGCACAAATGAGA-3′;ROCK2,向前5′-AATGGGTTAGTCGGTTGG-3′和反向5′-CTTGGTTTGTTTGGAGCA-3′;以挪士,向前5′-GCCAAACAGGCCTGGCGCAA-3′和反向5′-GTGCTGTCCTGCAGTCCCGA-3′;PKG-I,向前5′-CTTGGAGTGGGAGGTTTC-3′和反向5′-AATGTGTCGTTTCTTGAGG-3′;ICAM-1,向前5′-TATCCATCCATCCCACAG-3′和反向5′-GTTCGTCTTTCATCCAGTTAGT-3′;β肌动蛋白,向前5′-TACAACTCCTTGCAGCTCC-3′和反向5′-ATCTTCATGAGGTAGTCAGTC-3′。ROCK1 ROCK2,以挪士、PKG-I ICAM-1规范化的β肌动蛋白。基因表达是由实时定量PCR反应的监测与LightCycler系统(罗氏,印第安纳波利斯,美国)。所有PCR实验进行至少三个独立的治疗方法。

2.6。免疫组织化学

在二甲苯脱蜡和石蜡组织部分患者在梯度酒精。然后,部分用蒸馏水洗净,和内源性过氧化物酶被3%的过氧化氢。heat-mediated抗原与柠檬酸缓冲检索进行pH值6开始前IHC染色协议。然后,部分被封锁了60分钟山羊血清为5%。执行间接immunoperoxidase染色的组织部分,样本孵化与初级抗体ki - 67一夜,ICAM-1,(美国Cambridge, MA),以挪士,激活caspase-3(美国Sigma-Aldrich)和ROCK1 ROCK2(美国Proteintech)在4°C。然后,组织部分洗了磷酸盐(PBS, 0.01 M),与二次抗体孵化,可视化与diaminobenzidine(民建联、棕色的颜色,ZSGB-BIO、北京、中国)和苏木精复染色显微镜下。阳性染色强度是衡量IOD /区域Image-Pro + 6.0图像分析软件(银泉媒体控制论)。

2.7。免疫印迹分析

的蛋白表达PKG-I被免疫印迹化验检查。短暂,血管组织均质裂解缓冲,和上层清液离心收集的12000 rpm在4°C为15分钟。在确定总蛋白浓度,每个标本50毫克的蛋白质为运行在10% SDS-polyacrylamide凝胶电泳和转移到硝化纤维膜。阻塞后5%的脱脂牛奶1 h在室温条件下,膜与初级孵化抗体在一夜之间在4°C。然后,包含0.05%的膜与Tris-buffered盐水洗渐变20日他们孵化与二级辣根peroxidase-conjugated抗体在室温下1 h。抗原抗体复合物被可视化使用增强化学发光试剂盒(美国Amersham),而蛋白质带强度与量量化一个软件(美国Bio-Rad 4.6.2版本)。兔多克隆抗体PKG-I和鼠标单克隆抗体β肌动蛋白是从Abcam购买(美国Cambridge, MA)。

2.8。统计分析

SPSS软件(版本19.0;美国SPSS,芝加哥,IL)是用于统计分析。所有的统计数据都是作为手段±标准平均误差(SEM)。用单向方差分析进行了统计分析。组之间的差异被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。模型建立

主动脉移植模型被认为是成功建立了当时完全的移植动脉开放,没有显著的吻合口出血移植后3天。外科血管移植的平均手术时间为41.5±7.5分钟。缺血时间一直不到30分钟。腹部纵切口进行观察移植血管手术后3天。在这项研究中,手术成功率为87.5% (21/24)。移植8周后,血液流动的近端和远端吻合的网站观察。所有成功的移植血管的通畅是足够了。

3.2。番茄红素改善同种异体移植物动脉硬化和VSMCs扩散

番茄红素能显著减轻主动脉移植的血管内膜增生和动脉硬化。如数据所示1(a1) -1(a3),他在每一组的移植血管染色显示血管狭窄和内膜的增厚显著的同种异体移植物组(图1(a2))与同基因移植物组(a1)。这种病理染色还透露,炎症细胞积累和白细胞浸润在同种异体移植物组明显。我们也测量了每组的血管狭窄程度,发现它是更重要的同种异体移植物组。然而,这些特性没有明显的番茄红素组(图1(a3))。番茄红素组内膜的厚度(μm)与同种异体移植物组相比显著降低(μm;)。此外,ki - 67表达(数字1(b1) -1(b3))在VSMCs也显著降低番茄红素组的价格相比同种异体移植物组。这表明VSMCs扩散在番茄红素治疗后移植血管减少。然而,没有明显改善caspase-3表达式(数字1(c1) -1(c3)),这表明proapoptosis番茄红素在这项研究中没有显著的影响。ki - 67 / caspase-3阳性细胞的比例进行了分析评价内膜的细胞的增殖和凋亡水平。番茄红素组(比)明显低于同种异体移植物组()。

3.3。ROCK1 Downregulation和ROCK2在同种异体移植物血管番茄红素治疗后表达水平

岩石激活也是重要血管动脉硬化的进展。ROCK1和ROCK2进行免疫组织化学染色在我们的研究中证明调节岩石表达之间的联系和动脉硬化。如数据所示2(a1) -2(a3)和2(b1) -2(b3) ROCK1 VSMCs和ROCK2表达水平明显降低番茄红素组((a3)和(b3))与同种异体移植物组((a2)和(b2))。IOD /区域的减少意味着ROCK1(集成光密度/区域)和ROCK2番茄红素组((a4)和(b4))正好与免疫组织化学染色结果。实时定量PCR分析还显示,相对mRNA表达ROCK1和ROCK2 ((a5)和(b5))明显低于同种异体移植物组(两个值< 0.05)。

3.4。番茄红素抑制ICAM-1表达同种异体移植物血管

我们评估是否番茄红素抑制移植血管炎症的发生,这也被认为是发挥关键作用的同种异体移植物动脉硬化的进展。在这项研究中,移植血管进行免疫组织化学染色,结果显示为IOD /区域(图3(a4))。如图3,有一个显著减少ICAM-1表达式番茄红素组(a3)与同种异体移植物组血管(a2)。实时定量PCR结果(a5)也证明了相对mRNA的表达ICAM-1番茄红素组显著低于同种异体移植物组。

3.5。番茄红素在主动脉移植以挪士和PKG-I蛋白表达增加

以挪士是一个重要因素在心血管系统保护作用,是由于没有在血管内皮细胞的生产。在这项研究中,以挪士表达水平的免疫组织化学染色法测定每组移植血管(数字3(b1) -3(b3))。积极的染色明显在同基因移植物组(b1)和番茄红素组(b3),同时,在同种异体移植物组(b2),显著降低。IOD /区域意味着分析(图3(b4)和实时定量PCR (b5)测量了免疫组织化学染色的结果。所有这些数据显示,以挪士表达水平在番茄红素治疗后动脉移植可以增加。同时,PKG-I起着至关重要的作用在调节血管平滑细胞通过调节ρ激活。免疫印迹分析评估PKG-I蛋白表达的移植血管。如图4(一)免疫印迹分析的结果显示,不同的表达PKG-I 3组之间的蛋白质在主动脉移植。番茄红素组,PKG-I表达式与同种异体移植物组相比明显增加()。结果也恰逢PKG-I mRNA表达的实时定量PCR分析在移植血管(图4 (b))。

4所示。讨论

移植血管病变是器官移植的移植失败的主要原因。移植血管的保护已成为一个重要的问题在维持正常功能的移植13,14]。在这项研究中,我们调查了番茄红素在治疗移植血管病变的预防和治疗效果。我们的研究结果表明,血管内膜增生和平滑肌细胞增殖显著减少政府的番茄红素在同种异体主动脉移植后8周。此外,我们还发现,番茄红素可以增加PKG-I的表达式,以挪士,表达下调的表达ROCK1, ROCK2, ICAM-1,抑制炎性细胞的浸润在同种异体移植物血管。然而,在血管内膜和媒体,免疫组织化学染色显示,没有显著增加番茄红素治疗后细胞凋亡。这表明,番茄红素的proapoptosis效果不明显在这项研究中,对移植动脉硬化及其改善的影响并非基于proapoptosis机制。此外,等离子体环鸟苷酸浓度也发现在这项研究中评估cGMP信号通路的表达水平。番茄红素治疗后,表现出与同种异体移植物组相比显著增加。所有的数据在这个研究表明,动脉硬化血管异体移植可以改善番茄红素通过调节NO / cGMP通路和Rho-associated激酶的表达。

内皮细胞是非常重要的在调节血管张力和维持血管结构(15]。然而,免疫和多发地伤害,长期出现在内皮细胞(ECs)可能引发内皮细胞激活和器官移植后功能障碍的病人16]。这些可以导致内膜的增生,平滑肌细胞(SMC)增殖,细胞外基质合成,是伴随着导致的移植肾功能的逐渐下降。一氧化氮(NO)是内皮功能的主要中介,它可以通过移植引起血管舒张guanylyl环化酶在底下的血管SMC和抑制血管SMC增殖和迁移17,18]。然而,缺血再灌注(I / R)损伤、氧化应激和免疫抑制药物可以产生过度,它可以迅速灭活没有在同种异体,导致移植物血管病变的发生和进展19]。在这项研究中,移植血管的执行以挪士免疫组织化学染色分析没有的表达水平在活的有机体内。以挪士对心血管系统有保护作用,被认为是由于没有生产在血管内皮细胞。其激活和表达调控中扮演很重要的角色没有生产。番茄红素是最有效的单氧饮料中天然类胡萝卜素。Di灰岩洞等人证明番茄红素抑制活性氧(ROS)生成和增加没有表达水平和生物利用度在人类脐静脉内皮细胞(6]。作者还报告说,番茄红素调节没有被直接减少分子表达水平和生物利用度。我们的研究结果表明,血管内膜增生减轻,和ki - 67表达下调的番茄红素组。此外,这些结果与实验设计提出了在这项研究中,番茄红素可以通过研制提高移植物血管病变。血管平滑肌细胞的细胞凋亡障碍被认为是另一个重要因素导致血管内膜增生和内膜的增厚在血管动脉粥样硬化的进展(20.]。番茄红素的proapoptosis效果不明显的在我们的研究表明,番茄红素改善血管动脉粥样硬化通过调节其他信号通路,这是符合我们的实验假设。

血管平滑肌细胞的迁移从媒体到内膜在动脉粥样硬化斑块的形成中扮演着关键角色,在移植血管病变血管再狭窄。Rho-associated激酶(岩石)是典型的下游效应器的小GTPaseρ家庭(21]。岩石可以激活上游调节器ρ,磷酸化和灭活肌球蛋白轻链(多层陶瓷)磷酸酶,随后提高多层陶瓷磷酸化,导致血管收缩(22,23]。另外,岩石可以调节内皮细胞的肌动蛋白细胞骨架重组(ECs)和SMC,这是与血管重建(9]。在猪模型中,长期抑制ρ激酶在动脉硬化的病变的回归结果(24]。ROCK1和ROCK2是两个亚型代表岩石的家庭。他们有很高的同源性,和65%的氨基酸序列是相同的。此外,帮助调节细胞的许多重要的基本功能,如细胞粘附、迁移、增殖、凋亡和转录调控。调节ROCK1和ROCK2表达水平被认为发挥重要作用在移植血管动脉粥样硬化的进展(24]。我们的研究结果也表明,ROCK1 ROCK2番茄红素治疗后表达水平明显下降,这提高了移植血管。Piera-Velazquez等人表明ROCK1抑制可以减少泡沫细胞的形成和抑制动脉粥样硬化的病理过程25]。然而,ROCK1的具体的监管机制和改善移植动脉粥样硬化ROCK2仍不清楚。此外,PKG-I是一个关键的中介没有/ cGMP通路起着重要的作用在调节血管平滑细胞通过调节ρ激活(26]。在Ser188 PKG-I磷酸化ρ,抑制其膜协会和防止ρ激酶的活化27]。我们的数据表明,番茄红素可以增加PKG-I水平和表达下调ROCK1和ROCK2表达在移植血管。等离子体环鸟苷酸浓度增加后还表示cGMP信号通路的调节表现番茄红素治疗。

早期血管炎症也是一个和重要事件的过程中,同种异体移植物动脉硬化(28]。现在被广泛接受的,生产的细胞间粘附分子(ICAM-1)及其脱落到内皮细胞和白细胞的表面发挥关键作用,调节内皮细胞之间的交互和血液成分在动脉粥样硬化的早期阶段(29日,30.]。此外,ICAM-1增加了血栓形成的潜在影响smc的迁移和扩散的血液。此外,据报道,TNF -α可以上调ICAM-1表达内皮细胞通过血管硬化NF -κ绑定到发起人。据报道,番茄红素可以抑制肿瘤坏死因子-α通过影响NF -全身ICAM-1蛋白表达κB信号通路(31日),这就解释了如何通过抗炎对同种异体移植物动脉硬化番茄红素具有保护作用的活动。

总之,我们的研究结果表明,番茄红素显著治疗效果在移植血管动脉粥样硬化的发生和发展。它可以改善同种异体移植物动脉粥样硬化通过调节NO / cGMP通路的表达,影响许多关键因素。这可能提供新的可能性,防止临床器官移植中移植物动脉硬化的形成。

相互竞争的利益

所有作者声明没有金融或非金融利益冲突有关的出版。

作者的贡献

彭Yunqiang他和夏贡献同样这项工作。

确认

这个项目是支持由中国国家自然科学基金(81501382和81501382),浙江省自然科学基金(LQ16H100002、LQ13H100003 LY16H050007),浙江省科学技术振兴机构(2015 c33186),温州和科技部门(Y20120157)。