文摘

虽然在静脉曲张发展内皮的作用是毋庸置疑的,病理学的影响内皮细胞的生物性质尚不清楚。我们检查如果静脉曲张的存在影响内皮细胞的衰老(HUVECs),如果是这样的话,本地和系统性的结果会是什么效果。实验表明,HUVECs受静脉曲张患者血清显示改进的扩散,增加衰老标记物的表达,SA -β加,增加代的活性氧(ROS),而血清从健康的捐赠者。既增加了SA -β加活动和活性氧释放被TGF -介导的β1,在静脉曲张血清的浓度升高,它的活性在体外避免使用特定的中和抗体。衰老HUVECs暴露于静脉曲张血清生成增加大量的ICAM-1, VCAM-1, P-selectin, uPA PAI-1, ET-1。直接比较血清的静脉曲张和健康的捐赠者显示病理血清含有ICAM-1水平增加,VCAM-1, P-selectin, uPA和ET-1。日历年龄健康受试者和P-selectin积极与血清uPA和负相关。静脉曲张的患者的年龄相关积极ICAM-1, VCAM-1, ET-1。总的来说,我们的研究结果表明,静脉曲张引起伴随老化的存在血管内皮功能障碍,导致当地的发展和系统性炎性环境。

1。介绍

静脉曲张指曲折的存在,延长和/或扭曲的血管,通常在下肢浅或深处1]。在西方国家,静脉曲张的患病率达到了一半的成年人(2,3随着年龄的增长和上升显著(4,5]。有一个共识,静脉曲张静脉和错误的阀门的发展削弱了血管壁。从力学上看,削弱和随后的静脉扩张诱发退行性变化的所有层内静脉壁,胶原蛋白和弹性蛋白之间的不平衡扮演重要角色(6]。除了异常从墙上的重组蛋白,导致静脉曲张的病因包括平滑肌细胞和成纤维细胞的增生和伤害有关激活血管内皮4,7]。疾病的症状和并发症包括皮肤变色,疼痛,瘙痒,溃疡,浅或深静脉血栓形成和出血(8]。

虽然功能失调的内皮的作用在静脉曲张是良好的发展9),静脉曲张对内皮细胞生物学的影响,间接,endothelium-related病理生理学的静脉曲张并发症仍然是难以捉摸的。为了解决这一问题本文全面我们比较血清骨盆韧带从静脉曲张患者和健康志愿者对如此关键的作用,内皮细胞的功能特性,如增殖,衰老,产生活性氧(ROS),和分泌属性。这些在体外调查比较紧随其后体外分析两组血清对八个任意选择血管炎症介质水平(ICAM-1、VCAM-1 E-selectin, P-selectin, uPA, PAI-1, ET-1,和TFPI)和通过研究这些分子在血清浓度与血清的日历年龄捐助者。

2。材料和方法

2.1。材料

除非另有说明,所有的化学物质和文化塑料都购自σ(圣路易斯,密苏里州)。外生,重组形式的人类TGF -β1和特定的TGF -β1中和抗体得到从研发系统(英国阿宾顿)。

2.2。静脉曲张患者和健康的捐赠者

这项研究是与血清样本来自原发性下肢静脉曲张的患者,从志愿者(献血者)静脉曲张是排除在外的存在和治疗作为对照组。静脉曲张患者症状性疾病( 研究)和入选标准是基于临床检查。拍摄前1 h的静脉曲张患者的血液计划静脉曲张的手术切除。血样离心收集和血清后立即获得存储在整除−直到需要80°C。该研究机构伦理委员会批准(同意号441/13)。人口数据对静脉曲张的病人和控制个人展示在表1。

表1
静脉曲张患者的特点和控制个体人血清样本。
2.3。内皮细胞培养和衰老

人类脐静脉内皮细胞从美国购买(通过传代形成细胞类型文化集合(罗克维尔市,医学博士,美国)。细胞在DMEM培养20%胎牛血清的边后卫,谷酰胺(2毫米),玫瑰(20 mM)、表皮生长因子(10μg / mL),肝素(5 U /毫升),青霉素(100 U /毫升),和链霉素(100μg / mL)。内皮细胞的衰老是由串行使每隔7天直到完成疲惫的细胞分化的能力。细胞从通道1 - 2被视为“年轻”细胞,而文化不再分裂和显示外表肥厚性被认为是“衰老。“在实验中,年轻和衰老内皮细胞被镀在培养皿中高密度(80 - 90%的confluency),然后同时暴露于20%血清从静脉曲张患者和健康志愿者72 h。然后用磷酸缓冲盐细胞被小心翼翼地清洗(PBS)和无血清培养系统暴露对72 h产生自体条件培养基。

2.4。免疫测定

浓度的细胞间粘附分子1 (ICAM-1)、血管细胞粘附分子1 (VCAM-1) E-selectin, P-selectin,尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)、纤溶酶原激活物抑制剂1 (PAI-1) endothelin-1 (ET-1),组织因子途径抑制剂(TFPI),与生长有关的癌基因1 (GRO-1),转化生长因子β1 (TGF -β1)、肿瘤坏死因子α(肿瘤坏死因子α)和白介素6 (il - 6)在血清和/或由内皮细胞生成的条件培养基测定使用适当DuoSet®免疫测定开发工具包(研发系统),根据制造商的指示。

2.5。核扩散和衰老化验

内皮细胞培养基被播种到低密度(5×104细胞每),允许附加2 h,然后增长同步血清剥夺下4 h。之后,获得的细胞暴露于20%血清从静脉曲张患者和健康志愿者72 h。孵化后,细胞分离酶学,统计使用伯克室,和人口的数量倍增(细胞增殖)的测量是使用以下公式计算:人口倍增= ,在那里 表示数量的细胞接种, 是细胞收获的数量。

细胞衰老的活性生物标志物,senescence-associatedβ牛乳糖(SA -β加),在同一文化量化测量4-methylumbelliferyl的转化率β-D-galactopyranose 4-methylumbelliferone在pH值为6.0,如[10]。

在一些实验中,两个参数测量在内皮细胞暴露于外源性重组人类TGF -的形式β1中使用相对应的浓度从静脉曲张患者血清细胞因子的水平。在另一组实验中,SA -β加在内皮细胞受到再分析对72 h血清从静脉曲张患者preincubated特定TGF -β1中和抗体(400 ng / mL) (11]6 h。

2.6。测量活性氧(ROS)

ROS生产评估内皮细胞暴露于20%血清从静脉曲张患者和健康志愿者72 h。总之,1×105细胞被孵化的5μM 2′, 7′二乙酸-dichlorodihydrofluorescein (H2DCFDA)(美国尤金分子探针)为45分钟37°C。细胞溶解产物的荧光强度监测在荧光光谱仪Victor2(优秀,图尔库,芬兰)激发在485 nm和发射在535 nm)。在一些实验中,ROS生产检查内皮细胞暴露于外生,重组TGF -β1中使用相对应的浓度从静脉曲张患者血清细胞因子的水平和血清的存在从静脉曲张的病人与特定的预培养TGF -β1中和抗体(400 ng / mL) 6 h。

2.7。统计数据

统计分析了使用GraphPad棱镜™v.5.00软件(美国圣地亚哥GraphPad软件)。方法比较与Mann-Whitney测试或Wilcoxon符号秩检验,在适当的时候。使用枪兵的相关性进行了分析测试。结果表示为±SEM手段。差异与 值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。静脉曲张患者血清导致TGF -内皮细胞功能障碍β1-Dependent机制

低密度培养的内皮细胞暴露于20%血清(通过传代形成细胞来自患者静脉曲张(VV)和健康,与志愿者(高压)72 h,然后三个功能参数,即细胞增殖、活动的SA -β加(衰老的生化标记),生产活性氧(氧化应激的指标),检查。实验表明,VV患者血清刺激内皮细胞的增殖(人口倍增的数量增加了 %, ;图1(一)),增加了活动的SA -β加( %, ;图1 (b)),ROS水平(增加了 %, ;图1 (c)从控制捐助者),而血清。

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图1
血清的影响从健康志愿者(高压)和静脉曲张患者(VV)扩散(a),衰老(b),在培养的内皮细胞氧化应激(c)。Subconfluent文化的内皮细胞暴露在检测血清(20%)72 h,然后实现倍增的人口数量(测量细胞增殖能力),SA -的活性β加(细胞衰老的标志),ROS的产生(氧化应激的指标)。结果(表示为意味着±SEM)来自实验执行与血清12(扩散)或16(衰老,氧化应激)个人/团体。星号显示显著差异与高压。RFU:相对荧光单位。

加剧内皮细胞扩散结合加速衰老和增强氧化应激的反应从VV病人血清鼓励我们尝试识别serum-derived因子(s)可以负责这些影响。为此我们选择,基于文献数据,四个代理(TGF -β1、GRO-1 TNFα和il - 6)会影响细胞增殖(12],衰老[11,13),和氧化应激14,15]。VV患者和健康志愿者血清的比较分析表明,样本不同显著只对TGF -的浓度β1。即静脉曲张患者的血清中细胞因子水平较高(通过 %, ;图2(一个)比对照组)。GRO-1浓度(图2 (b))、肿瘤坏死因子α(图2 (c)),il - 6(图2 (d))两组血清几乎相同( )。

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图2
TGF -的浓度β1 (a), GRO-1 (b)、肿瘤坏死因子α(c)和血清中il - 6的分泌(d)从健康志愿者(高压)和静脉曲张患者(VV)。使用适当的ELISA试剂盒进行了测量。结果(表示为意味着±SEM)来自实验进行血清与每组24个人。星号显示显著差异与高压。

为了澄清如果VV病人的血清对其通过TGF -对内皮细胞的影响β1,外源性重组蛋白质的形式应用于低密度HUVECs剂量的100 pg / mL,对应TGF -β1水平从静脉曲张的病人血清,然后扩散,衰老,氧化应激进行了复查。这个实验表明,内皮细胞扩散受到TGF -β1持平( ;图3(一个)),而SA -的活性β加和活性氧的产量增加了 % ( ;图3 (b)),由 % ( ;图3 (c)),分别。

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图3
TGF -的作用β1在内皮细胞功能障碍接受静脉曲张患者血清(VV)。外因的影响,重组TGF -β1细胞增殖(a),衰老(b),氧化应激在HUVECs (c)。细胞受到外源蛋白在剂量使用相应的血清(病人)水平72 h。星号显示显著差异与控制(Con)组(细胞保持在标准条件)。TGF - - -的影响β1在VV患者血清中和衰老(d)和氧化应激在HUVECs (e)。星号显示显著差异与细胞暴露于高压血清。结果(表示为意味着±SEM)来自实验一式八份。RFU:相对荧光单位。

为了最终确定TGF -致病作用β1,SA -β加和ROS在内皮细胞受到测试从VV病人血清中细胞因子是使用特定的抗体中和。最初的研究表明,两种参数升高血清反应从VV病人拒绝描述对照组水平(高压)当TGF -β1是灭活(数字3 (d)和3 (e))。

3.2。静脉曲张患者血清增加衰老内皮细胞分泌促炎的代理

分泌表型(SASP)是最基本的特性之一衰老细胞(16]。

在这个项目中我们通过串行诱导内皮细胞的衰老使,然后通过比较年轻,衰老细胞的分泌特性暴露在从静脉曲张患者和健康对照组血清。这项研究是集中在八任意选择血管炎症介质的释放,也就是说,ICAM-1, VCAM-1, E-selectin, P-selectin, uPA, PAI-1, ET-1和活性。实验表明,衰老HUVECs保持在20%血清的高压调节分泌显示所有测试代理与年轻的同行相比。释放ICAM-1增加了 % ( ;图4(一)),VCAM-1 % ( ;图4 (b)),E-selectin % ( ;图4 (c)),P-selectin % ( ;图4 (d)),uPA % ( ;图4 (e)),PAI-1 % ( ;图4 (f)),ET-1 % ( ;图4 (g))和活性 ( ;图4 (h))。

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图4
促炎的药物浓度条件培养基由年轻和衰老血清内皮细胞受到的健康志愿者(高压)和静脉曲张患者(VV)。内皮细胞受到20%血清72 h,然后他们清洗和暴露下72 h无血清培养基来生成条件培养液促炎的测量。结果(表示为意味着±SEM)来自实验进行血清与每组24个人。单星号显示显著差异与年轻的内皮细胞。与高压双星号显示显著差异。

当衰老细胞的反应从捐赠者的两组比较,血清原来生成的条件培养液细胞暴露于VV患者血清含有更高浓度的ICAM-1(通过 %, ;图4(一)),VCAM-1(通过 %, ;图4 (b)),P-selectin(通过 %, ;图4 (d)),uPA(通过 %, ;图4 (e)),PAI-1(通过 ; ;图4 (f))和ET-1 ( %, ;图4 (g))。的浓度E-selectin(图4 (c))和TFPI(图4 (h)),反过来,没有差别( 团体之间的)。

此外,也观察到显著差异的两个代理发布的年轻的内皮细胞:ET-1的浓度在中所产生的细胞暴露于血清的患者增加了 ( ;图4 (g)),而这些细胞产生的活性因子的浓度下降了 % ( ;图4 (h)),而血清细胞受到高压。

3.3。静脉曲张患者血清包含改变水平的几个促炎的代理

浓度培养条件的促炎之前代理测试又分析了直接在血清样品从静脉曲张患者和健康的捐赠者。研究表明,五的八因子的浓度的血清中VV患者增加,而两个浓度的降低和保持不变。更具体地说,ICAM-1的浓度增加了 % ( ;图5(一个)),VCAM-1的 % ( ;图5 (b)),P-selectin的 % ( ;图5 (d)uPA),经过 % ( ;图5 (e)),ET-1的 ( ;图5 (g))。与此同时,PAI-1下降了的浓度 % ( ;图5 (f))和“活性的 % ( ;图5 (h))。E-selectin持平(图的浓度5 (c))。

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图5
浓度的血清中促炎代理健康志愿者(高压)和静脉曲张患者(VV)。使用适当的ELISA试剂盒进行了测量。结果(表示为意味着±SEM)来源于血清从每组40个人获得的分析。星号显示显著差异与高压。
3.4。静脉曲张易诱发血清水平的促炎的代理之间的正相关和日历老化

相信人类的衰老与慢性炎症反应所体现的年龄相关性增加地方和系统性的几个促炎的分子(所谓的浓度inflamm-aging)[17]。在这个项目中我们的目的是比较的年龄抚养生产健康人的血清中促炎的药物和静脉曲张的病人。利用高压控制血清进行的分析表明,衰老相关积极uPA的浓度( , ;图6 (e))和消极P-selectin水平( , ;图6 (d))。根据其他测试代理,没有关系( )之间的代理级别和捐助者的年龄。

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影响健康的志愿者的年龄的血清浓度促炎的代理。与斯皮尔曼相关分析测试使用血清样本从40个人。确切的统计显著性 和相关系数 值可以在部分3。

类比进行评估时从VV病人血清,结果是不同的。具体来说,衰老似乎与ICAM-1的浓度正相关( , ;图7(一)),VCAM-1 ( , ;图7 (b))和ET-1 ( , ;图7 (g))。与此同时,没有关系( ),剩余的因素。

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图7
效应的静脉曲张患者的年龄的血清浓度促炎的代理。与斯皮尔曼相关分析测试使用血清样本从40个人。确切的统计显著性 和相关系数 值可以在部分3。

4所示。讨论

在过去的二十年里,一个证据积累了衰老的细胞形成血管内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞)会导致各种血管疾病的发展,包括动脉粥样硬化(18,19)、高血压(20.),和静脉溃疡的愈合受损21]。同时,血管功能障碍和细胞衰老之间的关系显然是双向的,证实了报告显示加速衰老的内皮细胞受到atherosclerosis-related干扰血液流动(22]或暴露于泡沫细胞衍生脂质过氧化产物,4-hydroxynonenal [23]。在本文中,我们描述为第一,患者血清来自静脉曲张引起伴随老化血管内皮细胞的功能障碍。

我们考虑静脉曲张的prosenescence效应源于组织病理学评价Aunapuu和。艾伦(24),他发现内皮细胞从静脉曲张的患者显示特定的不连续和剥蚀,可能是细胞衰老的表现。为了验证这种可能性,我们暴露了内皮细胞(HUVECs)静脉曲张患者和健康人血清,发现细胞生长在静脉曲张血清的存在显示改进的增殖能力,还增加了活动的SA -β加,衰老的标志25],ROS水平增加,内皮细胞衰老的最重要的原因26]。

考虑到上述脱皮的内皮细胞(24],你可以假设一个场景,摧毁了完整的细胞单层静脉曲张的患者可能会突显出这些细胞氧化应激相关衰老,后跟一个补充强化有丝分裂分裂的27]。增加内皮细胞的可扩展性可能反映了他们的反应病理血清的有害的活动似乎是,然而,一个死胡同,因为它会导致有益的影响(修复细胞的完整性)只是暂时的。在长期的角度来看,这样的补偿将导致过早耗尽有限数量的可实现的分歧,造成进一步的恶化疾病(28]。这种情况已经被描述,例如,由宋和Kagawa谁发现胰岛细胞的代偿增生受胰岛素抵抗导致衰老细胞的高分数,导致更深的恶化和糖尿病(胰岛素的活动29日]。

比较分析检测的血清以及干预实验与外源性蛋白质和特定的中和抗体可以识别TGF -β1作为一个可信的中介,静脉曲张的血清诱导衰老和内皮细胞氧化应激。这个发现符合Takehara et al .,结果发现这个细胞因子能够诱导衰老在内皮细胞(12]。TGF -类似的效果β1也被发现在成纤维细胞(30.),上皮细胞(31日),和间皮的细胞(11]。此外,TGF -β1已被公认的诱导活性氧在mitochondria-dependent机制(32]。

为了进一步验证我们的概念,静脉曲张增强内皮细胞功能障碍在伴随老化机制中,我们比较直接的反应年轻和衰老HUVECs两组的血清。内皮功能障碍的措施我们使用细胞的能力hypersecrete血管炎症介质,包括粘附分子(ICAM-1、VCAM-1和E -和P-selectin), vasoconstrictive蛋白质(ET-1)丝氨酸蛋白酶(uPA)丝氨酸蛋白酶抑制剂(PAI-1)和凝固抑制剂(TFPI)。在这种情况下,我们观察到,衰老细胞的蛋白质释放所有的测试与年轻的同行相比非常大。这一发现,证实存在SASP培养内皮由其他组符合报告,描述,例如,生产过剩PAI-1 [33],ICAM-1, VCAM-1 [34由衰老内皮细胞)。然而,我们的研究丰富因子列表中发布在较高环境由这些细胞在E-selectin, P-selectin, uPA和活性。我们的观察也同意大意炎性表型特征内皮细胞衰老,描述在一个优雅的在分子水平上研究Prattichizzo et al。35]。更重要的是,然而,生产的八个测试代理,也就是说,ICAM-1, VCAM-1, P-selectin, uPA, PAI-1, ET-1,衰老细胞暴露于静脉曲张患者血清似乎与对照组相比更加明显。有趣的是,进一步分析的促炎的药物的浓度直接从静脉曲张患者和健康人血清透露,五,六的水平蛋白质,由衰老调节内皮细胞的分泌(除了PAI-1),也增加了在第一组,这可能表明,衰老内皮细胞可能是病因与这一现象。

考虑到上述结果可以想象,病态造成静脉曲张的存在,尤其是血栓性疾病,可能诱发,至少在某种程度上,通过衰老内皮细胞的促炎的行为,有效地翻译血清特征。这个论证支持由田和李的一篇论文中,他总结了可用数据表明,内皮细胞的衰老可能参与几位血管疾病的发展36]。根据代理测试在我们的项目中,上述假设同意其他组的结果显示ICAM-1浓度的增加和VCAM-1从静脉曲张的病人血清中37]或高架ICAM-1之间的关系,VCAM-1, P-selectin和静脉血栓形成的发展(38,39)和肺栓塞(40]。

在项目的最后一部分,我们检查,如果出现静脉曲张可能加重系统性(serum-dependent) inflamm-aging现象17]。这个假设是基于事实,(我)从静脉曲张患者血清诱导内皮细胞的衰老,(ii)衰老这些血清内皮细胞受到过度分泌的促炎的代理,和(3)衰老期间内皮细胞积聚在组织老化(41]。澄清这个问题我们相关水平的八促炎代理日历年龄血清捐助者。按照健康个体只有uPA积极与衰老相关的浓度(uPA产生动脉粥样硬化能力42]),而P-selectin的浓度负相关。分析是重复使用时,重要的是,然而,静脉曲张的病人的血清,衰老似乎与其他组特工正相关,也就是说,ICAM-1, VCAM-1 ET-1,而健康的捐赠者的相关性发现消失了。应该强调此时此刻的年龄相关性降低P-selectin应该被认为是有益的过程对于健康的人来说,这个分子介导炎性级联的各种元素,有助于血管疾病(43]。缺乏相关的关于P-selectin在静脉曲张患者中,结合ICAM-1积极的人际关系,VCAM-1和ET-1(都是积极参与动脉粥样硬化(44,45]),意味着静脉曲张血清促炎,因此它可能是部分负责一些与年龄相关的疾病的发展。

5。结论

总之,我们的研究提供了证据,从静脉曲张患者血清能够生成促炎的地方(endothelium-related)和系统环境。这个活动的静脉曲张的血清似乎主要与TGF -β1-dependent激活内皮细胞衰老。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

的资助支持的研究部分是国家科学中心、波兰(决定。DEC-2011/03 / B / NZ3/01214)。