酚类成分和提取物的抗氧化和抗增殖活动十二菜豆(菜豆l .)特有的优势生态型意大利南部之前和之后做饭

文摘

bean是重要的饮食组件与通用的健康益处。我们分析了十二个生态型的提取菜豆为了确定酚醛概要,抗氧化活性,在体外抗增殖活动。超高效液相色谱二极管阵列检测器(UPLC-DAD)承认我们检测和量化一些已知的多酚类物质,如没食子酸、绿原酸、表儿茶素、杨梅酮、芒柄花黄素、咖啡酸、山柰酚。抗氧化活性(AA)范围从1.568±0.041,66.572±3.197毫克必要抑制的活动2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (EC (DPPH)激进的50%₅₀)。提取,除从nonpigmented获得样本,能够抑制人类上皮的增殖大肠癌细胞腺癌(Caco-2),人类乳腺癌细胞MCF-7,非小细胞型肺癌A549细胞株。品种不同成分和浓度的多酚包括花青素;烹饪抗氧化活性的影响甚微。酚类成分的定性和定量差异群体之间的豆类生物活动的影响;另一方面,我们并没有发现显著差异在同一品种的生物活动,之前和之后做饭。

1。介绍

在豆科植物中,常见的bean (菜豆l .)在世界各地广泛使用。他们扮演了一个重要的角色在人类营养、植物蛋白的重要来源,矿物质,和某些维生素和展览,出于这个原因,营养价值高。在最后几年,生物活性的影响,与纤维、多酚和其他bean组件与人类健康(引起了公众的关注1,2]。豆类含有大量的酚酸和类黄酮;一些品种(红、黑、到紫罗兰色bean)也表明花青素,飞燕草色素和花青色素等,整体属性他们一种很强的抗氧化剂和反激进主义的活动3]。多酚类物质本质上是存在于子叶的种子大衣和小金额。

多酚类物质对人类健康的有益影响表达主要通过减少氧化应激(4]。一些多酚也能够发挥抗凋亡,延缓衰老的,整体以及抗癌的活性,抑制细胞增殖的过程(5,6]。

流行病学研究显示食用豆类之间强有力的联系和预防癌症的风险,以及减少糖尿病和心血管疾病的风险通过规范化的血脂和血糖7]。Wedick et al。(2012)表明,摄入量较高的花青素类黄酮,可以显著降低2型糖尿病的风险(风险:0.85)8]。

食用豆类通常不消除后的外套,在任何情况下做饭。Oroian和Escriche(2015)报道了抗氧化作用和共同bean的总酚含量,表明色素豆子一般主要抗氧化作用和更高的总多酚的量,对nonpigmented的(9]。由于其特殊的地理特征,意大利南部的领土显示许多不同的环境。在过去几个世纪以来,当地农民选择各种豆种子后,他们发现在南美和欧洲的扩散。这么长时间活动的选择产生了少量的选择本地品种,具有独特的特点。研究关于热处理的影响咖啡豆的健康相关的功能是有限的,特别是对传统的品种出现在这些地区的地中海饮食模式依然强劲。化学成分和生物的一种改进的信息属性的本地bean品种可以帮助定义和规定价格那些建议消费者营养更大潜力。

从这样的假设,本研究的目的是研究多酚类物质(包括总类黄酮素和花青素),抗氧化活性,抗增殖活性的提取从一些nonpigmented,获得红、斑点、黑大豆特有的生态型意大利南部。这项研究是国内烹饪过程之前和之后进行。

2。材料和方法

12种常见的bean (菜豆l .)收集各种来自坎帕尼亚和巴西利卡塔地区的农村社区的意大利南部(图1)。样品被分成四个bean组基于颜色:nonpigmented豆类,红豆,斑豆、黑大豆;每组包括三个品种(表1)。干豆之前被存储在黑暗中提取。

2.1。样品制备

样品(10克)患者(1:5 w / v) 24小时;丙酮的水被排放和4卷是补充道。2 h后孵化在4°C和离心11600×g(贝克曼,Biofuge Cassina de Pecchi意大利),上层清液的回收和储存在4°C。丸治疗又一个卷的丙酮和1 h孵化在4°C;两上层清液池、过滤,完全蒸发后,储存在−20°C在黑暗中,直到分析(10]。豆子的烹饪与去离子水(1:5 w / v),在家用高压锅,20分钟后恒定输出的蒸汽压力安全阀。煮熟的豆子都立即冷却,提取准备如前所述。

2.2。总多酚含量

总多酚(TP)的提取测定使用Folin-Ciocalteu比色的方法,所述单体和罗西Jr。11]。简单地说,50μL提取物添加到50μL 800年Folin-Ciocalteu试剂μL的蒸馏水。用碳酸钠中和反应(20 g / 100毫升)的解决方案。在室温下孵化2 h后,吸光度纳米决心使用卡里UV / Vis分光光度计(美国瓦里安,帕洛阿尔托,CA)。量化是基于使用没食子酸标准曲线生成的。结果表示为μ克没食子酸当量(GAE) / g DW样本±标准差(SD)。

2.3。总类黄酮

总类黄酮(TF) spectrophotometrically在510纳米以下的方法确定Zhishen et al。12)做了一些调整。提取(50μL)加入蒸馏水5%纳米紧随其后₂5分钟后,间变性大细胞淋巴瘤引起的₃10%。进一步的5分钟后,反应混合物是氢氧化钠处理0.2毫升的1毫米。最后,反应混合物与去离子水稀释1毫升和吸光度测定纳米(美国瓦里安,帕洛阿尔托,CA)。特遣部队被表示为μg槲皮素等价物/克DW样本±标准差(SD)。

2.4。花青素含量

花青素的含量是由微分pH值方法(13]。吸光度测量卡里UV / Vis分光光度计(美国瓦里安),同时在纳米和nm缓冲区的pH值1.0和4.5,使用公式。摩尔吸光26900摩尔/ cm用于cyanidin-3-glucoside(449.2克/摩尔分子量)。结果表示为微克cyanidin-3-glucoside等价物/ g的DW样本±标准差(SD)。

2.5。DPPH自由基清除活性

免费使用稳定的自由基清除活性决心彻底2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH实验)14]。分析了在微型板块通过添加15μL提取到300μL的methanolic DPPH的解决方案(6×10⁻⁵米)。接下来,吸光度纳米是spectrophotometrically测量(美国瓦里安卡里50 MPR)。DPPH的吸光度,而抗氧化剂(控制样本)用于基线测量。清除活动表示为50%有效浓度(EC50),它被定义为所需的样本数量(mg)抑制DPPH自由基活性50%在60分钟的孵化。这些实验进行了一式三份,结果被表示为平均值±标准差。

2.6。酚抗氧化指数(PAOXI)

所建议的文森et al。15酚抗氧化指数(PAOXI)可以用来估计的综合衡量抗氧化剂存在于样本的数量和质量。在这项研究中,它是计算除以DPPH自由基清除活性的样品(μ摩尔DPPH抑制/毫克)的总酚浓度(毫克/克)16]。

2.7。色谱分析

一个ACQUITY超高效LC系统(水)与PDA 2996光电二极管阵列检测器(水)是用于超高效液相色谱分析。授权软件控制仪器和获取和处理数据。提取和标准(以前溶解在甲醇)过滤(0.45μm;水域)分析。分析进行30°C使用反相柱(本·C₁₈,1.7μ2.1 m, 100毫米;水)后,弗拉蒂亚尼等人的方法。17]。溶剂的流动相由B(7.5毫米醋酸)和溶剂(乙腈)在250年的流量μL敏⁻¹。采用梯度洗脱,从5%的B 0.8分钟;然后5 - 20% B / 5.2分钟;权力平等主义的20% B 0.5分钟;20 - 30% B 1分钟;权力平等主义的30% B 0.2分钟;30 - 50% B / 2.3分钟;50 - 100% B / 1分钟;权力平等主义的100% B 1分钟;和100 - 5% B / 0.5分钟。 At the end of this process, the system equilibrated the column under the initial conditions for 2.5 min.

2.8。的决心在体外癌症细胞生存能力

2.8.1发布。细胞培养和提取

MCF-7、A549和Caco-2细胞系得到来自美国文化类型集合(写明ATCC,罗克维尔市,MD)。细胞生长在杜尔贝科修改鹰的中等heat-inactivated (DMEM)补充10%胎牛血清的边后卫,青霉素(0.010 U L⁻¹)、链霉素(10毫克L⁻¹),丙酮酸钠0.0002米。文化是孵化公司的5%₂在37°C和100%相对湿润的气氛。数浓度的提取是溶解在DMEM培养基。文化媒体进行评估的pH值和降水的组件,为了避免可能由于细胞毒性影响这些因素的变化在细胞微环境。的浓度并没有改变培养基条件被选中作进一步化验。

2.8.2。结晶紫测定

这些细胞被镀(10×10³/)在完全培养基48-well板块。24小时后,中移除和替换第一天相同的介质(控制)或补充与不同的提取剂。细胞与倒置显微镜观察每24 h,识别形态变化,毒性,或细胞死亡。细胞增殖的比例估计在第四天的比色测定报道Kueng et al。18)修改如下:细胞被固定在室温下20分钟的1%多聚甲醛(PFA),结晶紫沾0.1% 20%甲醇为20分钟,用PBS洗净,用10%乙酸可溶性,阅读在595 nm标仪(美国瓦里安卡里50 MPR)。实验条件下测试了一式三份,单独的实验进行至少三次。

2.8.3。(3)- 4 5-Dimethylthiazol-2-yl 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)还原试验

在96孔酶标细胞被播种密度5×10³细胞/好,成长为24小时37°C之前的测试样品。细胞治疗与不同样品浓度溶解在杜尔贝科的磷酸缓冲盐(PBS)。48 h的孵化后,使用比色MTT测定细胞生存能力确定。细胞存活率(%)测量的肝癌和减少甲瓒在550海里。特里同®x - 100 (10μL 10%的解决方案)是作为一个积极的控制。未经处理的细胞(车辆)被选为负控制。控制,并为每个浓度样本化验一式三份和复制三次。吸光度值被转换成比例的细胞生存能力使用以下公式:细胞生存能力= Abs样本/ Abs控制×100。

2.9。统计分析

数据表示为一式三份的平均值±标准偏差测量。方差分析(方差分析)是用来比较的结果和意义被接受。个人电脑软件被用于计算“Excel统计”。主成分分析(PCA)是用来关联值的生物活性酚醛成分,使用自由软件R统计计算和图形(环境https://www.r-project.org/)。细胞化验,EC50值计算使用ED50plus v1.0在线软件。

3所示。结果与讨论

3.1。多酚含量

总多酚(TP)的内容中提取的豆类如表所示2。结果,表示为μg GAE / gr (dw的种子),显示显著差异(样品之间的);另一方面,这些差异都不显著(在同一组bean)。最大数量的差异提取之间的TP得到白豆(从135.04到275.4)和斑点bean(从1061.9到1249.7),甚至比约1:10。提取的红色和黑豆,TP的中间值,结果一致报道Heimler et al。19),研究了意大利的其他品种菜豆l .异常是由提取的Cannellino罗索(CR) (TP = 229.70),虽然属于红组,表现出的多酚类物质与nonpigmented bean。这种多样性的色彩更明显比其他红豆(图1)。

提取物经煮熟的豆子显示较低的TP对相应的原始样本,除了那些从nonpigmented bean获得,烹饪后的多酚物质仍然类似。例如,考虑品种比安科di Acerra,TP的数量仍然几乎相同,在热处理前后(275.442和241.782,分别地)。

3.2。类黄酮测定

通常,类黄酮和其他酚类化合物通常存储在种皮因其antipathogen和antifeeding活动;此外,这种本地化保证最好的保护种子的外部攻击(病原体、昆虫等)20.]。许多黄酮类化合物产生bean的外套颜色可能还提供积极的有益健康的抗氧化剂。这类多酚是出现在所有样本分析,尤其丰富的豆类,和一个非常相似的趋势的多酚类物质,如表所示2。白豆显示提取的黄酮类化合物含量低、不超过58.73μ克/量化宽松政策。最高的发现大量的类黄酮提取的斑点bean以及红色品种的O Russu(或)。提取得到的三个斑点beanPettilanculo(P),Sanghellatto(年代),Screziato impalato925.654 (SI)显示μ910.551 g /量化宽松政策μ703.336 g /量化宽松政策,μ分别为g /量化宽松政策;提取的品种尼禄di Acerra(NA)最富有的在黑暗中类黄酮含量bean分析(542.337μ克/ QE)。

3.3。总花青素的测定

如预期般,较高含量的花青素提取物中可观察到黑豆子,而较低的数量被发现在那些斑点和红色样品,除了Zampognaro(Z) bean (10.706μg C3GE /克)(表2)。黑暗中提取bean尼禄di Caposele(63.278 (NC)显示最高的价值μ花青素的g C3GE /克);此外,这种品种也被证明是最富有的总多酚和类黄酮在黑暗的品种进行了分析。应该强调,花青素的bean是只存在于果皮(21]。因此足够的种子获得更高的花青素价值小,当我们在测试方面品种数控。烹饪降低花青素的内容出现在样品;然而,一些品种(Z中斑点和数控黑品种)保持花青素含量为6.11μg C3GE /克和10.508μ分别g C3GE /克。

3.4。抗氧化活性

豆提取物的抗氧化作用是通过DPPH测试调查。总的来说,样品展示相关的抗氧化特性,几毫克的提取物是足以抑制活性的50%自由基DPPH(表1毫升2)。显示抗氧化活性最高(EC斑点bean₅₀不超过1.813毫克/毫升),紧随其后的是红豆(CR除外)和黑豆(EC₅₀不优越于5.2毫克/毫升)。正如预期的那样,nonpigmented品种表现出最低的抗氧化活性的提取物(EC₅₀值介于23.62毫克/毫升和55.21毫克/毫升)。煮熟的豆子,尽管总多酚的丧失,披露了有趣的结果。估计合并后的抗氧化剂存在于样本的数量和质量,我们采取了所谓的酚类抗氧化剂指数(PAOXI)所建议的文森et al。15]。在我们的研究中,这些指数计算除以DPPH自由基清除活性的示例(表示在这种情况下μ摩尔的DPPH抑制/克产品)对总多酚浓度(毫克/克)。这是可能的转换中获得的值mg的抗氧化活性μM DPPH /毫克样品。PAOXI值最高(36.25)被提取斑点bean的展出Sanghellatto(年代);因此,提取的黑暗品种尼禄di Caposele表现出最低的PAOXI价值的bean(表中(10.79)3)。这个简单的计算可以帮助澄清的多酚和抗氧化活性之间的关系并不总是那么直接。

虽然有可能建立一个清晰的多酚类物质的含量之间的相关性和自由的自由基清除属性提取,我们观察到一些多样性,这可能是由于他们的组件之间的差异构成总多酚。众所周知,有一个变量的每个示例的化合物的组合,这些单个组件的抗氧化潜力是可变的。从分析总多酚、总类黄酮,抗氧化活性,我们观察到黑暗的bean的提取尼禄di Caposele(NC)显示最高的总多酚;然而,斑点Screziato impalato豆(SI),虽然含有多酚略小,表现出更高的总黄酮含量,及其PAOXI指数明显高于(10.79和29.0)。这钢筋的抗氧化潜力可能与黄酮类化合物的内容密切相关。烹饪影响抗氧化活性;对一些品种(如NA和NF) PAOXI值之前获得的类似烹饪;确实在某些情况下(NC)观察PAOXI指数更高,这表明热处理强化了它们的抗氧化功效。

3.5。识别的多酚

UPLC分析概述了主要的酚类化合物在每个样本。在图2我们报道获得的色谱提取四个品种的豆子,每一个都代表一组(白色斑点,红色,和黑暗)。对于每一个,我们之前和之后获得的资料报道烹饪的过程。表4表格形式显示,组织,每个多酚认可的设备的数量,根据已知的标准。根据分离的数据组。

的资料nonpigmented bean非常简单的提取;事实上,我们发现,只有几个高峰,出现在最初的色谱图的一部分。不同的提取不好di MortoDM显示即使是一个小数量的峰值相对于其他两个nonpigmented bean BA和Q分析(色谱图中未显示)。尽管几个山峰可视设备的灵敏度还允许我们探测和识别几个已知的多酚,即使他们在少量nonpigmented bean(表中4(a))。多酚提取的资料斑点,红色,黑豆子要更加丰富和完整。一些只有在在场的多酚提取物引起色素的bean。例如,杨梅酮仅被提取的色素豆:这是目前提取的生豆数控(1.986μ克/克,表4(d))和Z和Si的提取后烹饪(3.35μ克/克和0.218μ克/克,表4(c)和4(b),职责)。总体而言,我们的研究结果与剂量的多酚在协议之前报道的豆类,特别是关于类黄酮(22,23]。我们分析更广泛的类黄酮已经在文献报道的抗增殖活动(24),我们发现可观数量的一些黄酮和/或黄酮类化合物,如芒柄花黄素、染料木素、槲皮素3 4-diglucoside, spiraeside, hyperoside,提取红色的样品(表4(b))。的提取Cannellino罗索,同时含有少量的总多酚的提取对其他两个红色品种,表现出多酚姿态绝对相关的提取物对其他两个红色品种。还应该强调,烹饪后的总多酚bean的减少并不影响黄酮类化合物的数量,如染料木黄酮和芒柄花黄素。芒柄花黄素是一个典型的生物活性红三叶草异黄酮的植物与强大的药理作用,包括抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、心脏保护作用[25]。此外,这种异黄酮能够抑制增殖,诱导细胞凋亡在人类癌症细胞,如乳腺癌、前列腺癌肿瘤,骨肉瘤(26,27]。高效液相色谱的研究上执行62个野生和杂草丛生的墨西哥豆指标确定山柰酚作为主要的类黄酮,假设其定量变化可能与基因型比种皮颜色(28]。在我们的实验中,黄酮醇,如槲皮素和山柰酚,被发现在原始和处理bean。同样地,我们发现山柰酚的提取红色品种Zampognaro(Z)和两个斑点的P和Si品种(表4(b)和4(c))。山柰酚的酚类化合物因其抗诱变剂的研究和抗癌的活动在体外和在活的有机体内(29日];它的浓度在p .寻常的是非常变量,从痕迹< 0.2毫克/公斤(在托斯卡纳长白猪)[30.)209.4毫克/公斤(墨西哥栽培品种)(3]。我们的数据更符合Tuscany品种(31日]。强调这些化合物的存在是在煮熟的豆类,这样他们就可以真正执行他们的营养特性,最重要的是,因为不影响热处理(黄酮醇32]。

提取的三个斑点豆类,除了类黄酮,表现出许多咖啡酸衍生物和可观的儿茶素衍生品,包括儿茶素(表4(c))。

黄酮类化合物显示出伟大的可变性;事实上,除了芒柄花黄素和槲皮素的衍生品,他们也含有染料木素和大豆苷,在少量。抗增殖活性的黄酮类化合物是众所周知的在许多研究和分析(33,34]。烹饪后,提取的Pettilanculo(P)和Sanghellatto芒柄花黄素(S)显示高值;它也强调的提取spiraeoside的存在Sanghellatto烹饪(Sc后,表4(c))。

暗bean的提取well-varied概要,芒柄花黄素显著值和槲皮素糖甙3 - 4(表的存在4(d))。

3.6。Anti-Proliferative活动

提取物的抗增殖活性是评价MCF-7乳腺癌细胞系,非小细胞型肺癌A549细胞株,Caco-2结肠癌细胞使用MTT比色试验。治疗48 h后,经济增长显著地抑制细胞的剂量依赖性的方式,对于每个提取,EC50值计算剂量反应曲线的细胞系。在表3EC50值在三个细胞株,报道,表明提取物的浓度(表示为μg相当于没食子酸,GAE的标准,总多酚提取/毫升)中能够减少50%的细胞生存能力。nonpigmented品种的提取物(BA、DM和V)没有造成显著减少细胞的生存能力,对于每个细胞株,即使在最高浓度使用;数据没有显示,这些品种并不包括在表中5。EC50值变化强烈的三个细胞系和不同提取测试,表明不同的提取细胞敏感性,说明从EC50值。然而,均值方差分析分析EC50值获得三个细胞株没有回复意义重大值()。最高的EC50值测量A549肿瘤细胞,使用不同的提取Pettilanculo最低,而被发现CaCo-2细胞,与CR提取物。通常,需要抑制扩散浓度1.06 - -3.64折的Caco-2细胞低于A549和MCF-7细胞没有例外。总的来说,提取P和电脑显示只有温和的抑制作用对三个癌症细胞系,而那些CR和NFc是最活跃的。此外,煮熟的豆子的提取物比记者原油提取效率较低,除了电脑,NFc, NCc,显示EC50值低于类似粗提取物。有可能的是,在这些情况下,热处理释放化合物抑制能力。总的来说,同样的细胞系,抑制与原始样本获得的值没有显著不同的煮熟。

3.7。主成分分析

我们应用主成分分析(PCA)的12个品种的豆子根据其生物活性。该方法成功地用于研究中的数据处理的苹果35和黑豆36]。在我们的研究中,七个变量测量在24个样本(12生和熟豆12),利用主成分分析法(PCA)和数据进行分析(图3)。累计百分比的总方差解释为前两个组件是84.4%。二维的图(图设计3)。品种的分布沿PC1和PC2表明,样本可分为三类:A组,其中包括红色品种和斑点bean定位中心附近的二维的情节;B组,由黑色的品种,C组,对应nonpigmented独家品种。A组包含bean与最高浓度的酚类化合物和最好的抗氧化活性。这些品种不同于其他人因为他们的高总多酚的含量,特别是,类黄酮,能更有效地影响抗氧化活性和抑制癌细胞的生长能力。事实上,我们发现了一个正相关()之间的总浓度的茶多酚和黄酮类物质和抗氧化和抗增殖活动。花青素的含量最高的提取物中检测出黑豆(表2)。,重要的是要强调,这种变量的贡献区分这B组和其他人(图3)。C组包括nonpigmented bean的提取物,表现出低酚和抗氧化活动相关内容无意义的抗增殖效果。

我们的分析表明,类黄酮和花青素是负责这些提取物的抗氧化和抗增殖效果。最活跃的品种属于斑点组。红色品种稍微不那么活跃PCA和重叠的斑点。暗bean的提取物,尽管花青素含量较高,表现出较低的AA值比斑点,这表明类黄酮主要是负责这样的生物活性。

4所示。结论

常见的bean是一个关键的地中海饮食的食物,代表一个重要的蛋白质来源,纤维,一些矿物质,维生素,和生物活性的化合物。我们评估多酚提取物的抗氧化和抗增殖效果从老十二个品种获得流行bean (菜豆l .),意大利南部的一些农村的国家。我们的研究结果证实了斑点,红色和黑色颜色品种的豆子比nonpigmented的更活跃。煮豆子,有趣的是,尽管造成一定损失的生物活性分子,并没有影响他们的生物学性质。这无疑可能代表的结果相当大的重要性,为了维护和促进老品种的豆子的重要营养食品的潜力,提高他们的市场机会生产功能性食品和保健品。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这部分工作由项目“缓和”和“AGRIGENET”, PSR 2007 - 2013,管理信息系统。214年,行动f2,坎帕尼亚地区委员会的意大利,以及安全智能PON04a2_F意大利项目,“&保存。”

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