红景天甙的详尽的运动性心脏损伤的保护作用增强PGC-1α- - - - - -NRF1 / NRF2通路,在大鼠线粒体呼吸功能

文摘

客观的。来测试假设红景天甙(SAL)可以通过加强保护心脏免受详尽的运动性损伤的线粒体呼吸功能和线粒体生物起源的关键信号通路PGC-1α-NRF1 / NRF2在老鼠身上。方法。男性Sprague-Dawley老鼠被分为4组:久坐不动的(C),详尽的运动(EE),低剂量的萨尔(LS),高剂量萨尔(HS)。一次性详尽的游泳锻炼后,我们测量心肌细胞超微结构的变化和心脏标记酶和线粒体电子传递系统(ETS)复合物的活动原位。我们还测量了线粒体生物起源主监管机构PGC-1α及其下游转录因子,NRF1和NRF2,在基因和蛋白质表达水平。结果。EE组与C组相比,表现出显著的心肌超微结构损伤和减少线粒体呼吸功能和蛋白质水平的PGC-1α,NRF1,NRF2 但显著增加PGC-1α,NRF1,NRF2基因水平;EE组相比,萨尔改善心肌损伤,增加线粒体呼吸功能,基因和蛋白质含量升高PGC-1α,NRF-1,NRF-2。结论。红景天甙可以保护心脏免受详尽的运动性损伤。它可能通过改善心肌线粒体呼吸功能通过刺激的表达PGC-1α-NRF1 / NRF2途径。

1。介绍

强度运动训练是一把双刃剑,适当的锻炼有利于人体健康,而过度锻炼会伤害身体,尤其是心脏。心脏损伤引起的过度运动训练包括严重的心律失常、心力衰竭,甚至心脏性猝死,这是常见的在军事和体育训练。研究心脏损伤引起的详尽的锻炼是很重要,然而很少有人系统研究心脏损伤诱导的详尽的锻炼已经出版和底层信号通路机制还有待阐明。

术语“心力衰竭能源饥饿”提出了几十年前(1];然而,非常精力充沛的起源目前知之甚少失败。看起来,转录辅激活过氧物酶体proliferator-activated受体-γcoactivator-1α(PGC-1α),这是一个主调节器线粒体生物起源的2),在控制过程中发挥作用的速率线粒体增生。能源赤字和PGC-1α标记的心脏功能障碍,从而导致能量代谢受损,导致心脏衰竭。线粒体生物起源是指线粒体增生。运动,冷,能量限制,氧化应激和其他环境压力都能诱导线粒体生物起源。发现maladapitive线粒体生物起源的积累会导致病理现象,如心肌肥厚和心力衰竭,突出的重要性,阐明线粒体生物起源的分子调控机制。

线粒体生物起源需要协调表达的核和线粒体DNA;信号通路协调转录和复制信号通路基因与线粒体DNA仍有待阐明。据报道,PGC-1α扮演一个关键的角色在骨骼肌线粒体生物起源及其表达水平对骨骼肌线粒体基因表达率限制。PGC-1α与核呼吸因子(合作nrf),包括NRF1和NRF2,促进多个nuclear-encoded基因的表达和线粒体转录因子(Tfam)。尽管如此,仍有一些点的争论;例如,的表达PGC-1α信使rna并没有改变在急性或耐力运动训练和基因和蛋白质水平的NRF1和NRF2与没有联系PGC-1α基因或蛋白质含量(3]。

线粒体呼吸链复合物酶化验为个人已经广泛用于估计线粒体功能和功能障碍。然而,它已经建立了一个完整的分析,这种方法是不够的,一个潜在的线粒体损伤,因为它不能揭示酶复合物之间的相互作用。此外,常规的线粒体隔离程序将导致改变线粒体形态和功能受损(4]。呼吸运动计量法(5]提供了一个强大的和生理相关方法来描述在permeabilized组织耦合的呼吸功能。一个特别设计的substrate-inhibitor滴定方法允许的逐步分析几个线粒体复合物。然而,特定的适应性改变力竭运动后心肌线粒体呼吸功能尚不清楚。

的茎红景天crenulata已被用来作为中药1000多年(6]。r . crenulata的补充气(生命力)和激活血液循环,已被公认为植物的产生,能保持生理稳态在接触压力。红景天甙(SAL)是一种有效的提取组件r . crenulata。许多研究发现,萨尔对心肌缺血再灌注保护作用[7),心肌缺氧(8),和心肌损伤9]。我们之前的研究已经表明,萨尔可以改善低氧诱导心脏肌细胞能量代谢通过增加细胞内呼吸酶的活性琥珀酸脱氢酶(SDH) [10]。然而,并没有研究对萨尔是否预防急性心肌损伤目前详尽的运动造成的。在这项研究中,我们建立了模型,详尽的游泳运动诱发大鼠心脏损伤调查萨尔对心肌线粒体呼吸功能的影响,并讨论是否保护机制是通过线粒体生物起源PGC-1α- - - - - -NRF1/NRF2信号通路。

2。方法

2.1。材料

萨尔(98%)是购自南京Zelang医疗科技有限公司(很多:ZL201204012A)(南京、江苏、中国)。ELISA试剂盒对心脏损伤标记物得到从BD(纽约,纽约,美国)。试剂测定线粒体呼吸功能是从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。抗体PGC-1α,NRF1,NRF2,β肌动蛋白的蛋白质从春秋国旅(美国)购买。

我们获得40男性Sprague-Dawley老鼠(190 - 200 g)从军事医学科学院实验动物中心(中国,北京),认证SCXK数量:2003-1-003。动物被安置在25°C-26°C下12 h黑暗,12 h光周期。还提供了一些食物和水随意之前和天实验期间。所有的程序都按照建立的准则执行实验动物保护公约的解放军第252医院。

高分辨率的呼吸运动计量法(Oroboros仪器、奥地利),微型板块阅读器(热费舍尔SC, FI),生化分析仪(7600 - 02年、日立、日本)和透射电子显微镜(TEM) (h - 7500、日立、日本)被用于实验。

2.2。实验组和运动训练

老鼠训练在水槽前3天正式实验,那些无法适应游泳的老鼠被排除在外。总共32个老鼠最终进入正式实验。他们被随机分为4组:久坐不动的对照组(C,),力竭运动组(EE,)、预处理与低剂量的萨尔集团(LS,SAL),高剂量的预处理组(海关,)。C和EE组管理0.9%氯化钠(12毫克公斤⁻¹·d⁻¹14天)intragastrically LS和HS组服用100毫克公斤⁻¹·d⁻¹或300 mg·公斤⁻¹·d⁻¹萨尔,分别intragastrically 14天(11]。

老鼠在EE、HS和LS集团受到一次性详尽的游泳测试单独在一个水槽(60厘米×90厘米×50厘米),50厘米的水深和温度35°C±0.5°C。疲惫是由两个标准:大于10 s花费低于表面,缺乏“扶正反射”放在一个平面上12]。疲惫的时候,所有老鼠都麻醉的腹腔内注射戊巴比妥(50 mg·公斤⁻¹)。血清收集和保存在−80°C,心被移除。左心室组织立即是孤立的,一部分是用于线粒体功能的测量和部分是不惜−80°C进行进一步的分析。

2.3。Histomorphometric分析

老鼠的心脏在10%甲醛固定,在室温下保存,使用光学显微镜)染色后观察。

一小块(2毫米×1毫米×1毫米)的subendocardial心肌左心室乳头肌的根源是收获和固定在0.1 L更易与磷酸盐缓冲剂和透射电子显微镜(TEM)观察到。

2.4。试验测量心脏标记酶的活动

酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒用于确定的水平增殖蛋白激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(水平)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌红蛋白(MB)和血清肌钙蛋白(cTn-I)。所有化验根据制造商的说明进行。

2.5。原位研究线粒体呼吸功能

我们使用permeabilized心肌纤维,它提供了一个优秀的方法来研究线粒体原位没有将他们孤立于组织。心肌纤维被解剖分离肌肉组织(左心室)BIOPS解决方案在冰上紧随其后皂素透化作用。细胞膜透化作用与皂苷使细胞器功能的研究,同时保持细胞结构和控制细胞内环境。线粒体功能是由高分辨率测量呼吸运动计量法在37°C使用双腔滴定注入呼吸器。呼吸介质(包括MiR05) 110毫米蔗糖,K-lactobionate 60毫米,0.5毫米EGTA, 1 g / L牛血清白蛋白(本质上脂肪无酸的),3毫米MgCl₂KH 20毫米牛磺酸10毫米₂阿宝₄,20毫米玫瑰(pH值7.1)。DatLab软件(Oroboros仪器)被用于数据采集和分析。一系列的呼吸道滴定协议被设计用来测试多个线粒体缺陷,包括细胞色素c的消耗。我们使用1毫米二磷酸腺苷(ADP)刺激呼吸(状态3)和测量顺序通过复杂的我(10毫米谷氨酸和苹果酸2毫米),复杂的琥珀酸二世(10毫米和0.5μ米鱼藤酮)和复杂的IV (TMPD 0.5毫米、5毫米抗坏血酸盐和2.5μ米抗霉素A)。化学背景控制被用来纠正TMPD自然氧化和抗坏血酸盐。呼吸测量之前和之后的刺激通过增加细胞色素c (10μ米)。呼吸率每毫克干重表示,从oxygraph收集的样本测量室的实验。

2.6。实时聚合酶链反应

RNA被从冷冻分离大鼠心肌使用超纯RNA设备根据制造商的协议。执行实时PCR和分析使用荧光PCR仪器(IQ-5)使用cDNA SYBR绿色PCR掌握混合。引物序列表中列出1。信使rna的相对量是基于决定的计算。

2.7。西方墨点法

组织蛋白试剂用于提取蛋白质。蛋白质浓度测定使用bicinchoninic酸测定(BCA)。然后,蛋白质稀释后加入sds - page示例加载缓冲区在类似的体积和放置在一个100°C水浴5分钟。蛋白质sds - page分离的样品15分钟100 V和150 V为45分钟,然后被转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。膜被封锁在5%脱脂牛奶阻断缓冲区在室温为1.5 h,然后孵化一夜之间在4°C主要抗体。洗后样品与Tris-buffered盐水(TBS)渐变,膜被孵化与二次抗体在室温下2 h。发射极耦合逻辑用于比色检测5分钟洗后TBS渐变三次。值是规范化的内部控制(β肌动蛋白)。

2.8。统计分析

SPSS 16.0版(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)是用于统计分析。结果表示为±SD方法。以及被用来比较两组之间的数据。单向方差分析(方差分析)是用于比较数据在多个组。统计学意义是考虑。

3所示。结果

3.1。在Histomorphometric详尽的红景天甙和运动干涉的影响分析

3.1.1。光学显微镜

图1显示大鼠心肌结构的光学显微镜分析。图1(一)表明,C组,肌纤维排列整齐为间质水肿,肌膜没有损伤,肌肉纤维没有骨折,变性或坏死。图1 (b)表明,EE组心肌纤维排列不规则,间质水肿,肌膜损伤,肌肉纤维显示骨折的证据,变性,坏死。数据1 (c)和1 (d)表明,在LS和HS组,肌肉纤维方向改变,间隙区域显示轻微的水肿,肌膜没有损伤。

3.1.2。电子显微镜

图2显示心肌细胞超微结构。图2(一个)显示TEM结构代表C组大鼠:观察排列整齐,密度均匀,细胞器没有水肿,细胞膜和线粒体的嵴正常。图2 (b)显示EE组大鼠的心肌结构:心肌核基质水肿,核差距扩大,线粒体和糖原含量显著降低,细胞膜和线粒体嵴部分融合,成为模糊或丢失,和少量的肌纤维坏死。数据2 (c)和2 (d)显示LS和HS组大鼠的心肌结构,这是如下:心肌细胞矩阵有水肿和细胞膜和线粒体嵴部分融合,成为模糊或缺席。

3.2。情感表达的影响和萨尔干扰酶标记的心脏损伤

如表所示2相比,C组、LDH水平,CK, CTN-I, MB EE组显著增加();EE组相比,LDH水平,CK, CTN-I, MB的LS组显著减少();LS集团相比,LDH水平,CK, MB的HS组也显著降低()。

3.3。EE和萨尔干扰的影响线粒体呼吸功能

如图3,细胞色素c的滴定不改变流量,表明线粒体外膜是完整的。谷氨酸和苹果酸盐作为电子给体复杂的我,与C组相比,状态3 EE组的呼吸率显著降低();EE组相比,LS是显著增加();和LS集团相比,HS是显著增加()。与C组相比,EE的软组显著减少();EE组相比,RCR LS和HS组均显著增加()。

使用二琥珀酸为基质复杂,与C组相比,状态3 EE组的呼吸率显著降低();EE组相比,LS是无关紧要的增加()和HS是显著增加();和LS组相比,HS是显著增加()。

抗坏血酸盐/ TMPD被用作基质对于复杂的静脉,与C组相比,状态3 EE组的呼吸速率显著降低();EE组相比,LS是无关紧要的增加()和HS是显著增加();和LS集团相比,HS是显著增加()。

3.4。EE和萨尔干扰的影响PGC-1α,NRF1,NRF2基因表达水平

如图4,与C组相比,PGC-1α,NRF1,NRF2信使rna表达水平在EE组都显著升高();EE组相比,PGC-1α,NRF1,NRF2信使rna表达水平在LS组显著升高();和LS集团相比,PGC-1α,NRF1,NRF2信使rna表达水平在HS组都显著升高()。

3.5。详尽的锻炼和红景天甙干扰的影响PGC-1α,NRF1,NRF2蛋白表达

如图5,与C组相比,PGC-1α,NRF1,NRF2蛋白质含量在EE组显著减少();EE组相比,PGC-1α,NRF1,NRF2蛋白质含量在LS组明显升高();和LS集团相比,PGC-1α,NRF1,NRF2蛋白质含量在HS组显著增加()。

4所示。讨论

在这项研究中,我们调查了萨尔的保护作用和潜在机制在详尽的运动性心脏损伤的能量代谢。我们主要观察心肌结构的改变,心肌损伤酶标记,线粒体呼吸功能permeabilized纤维详尽的锻炼。我们还观察到线粒体生物起源的关键信号通路的表达PGC-1α- - - - - -NRF1/NRF2描述的细胞和分子机理,详尽的运动性心脏损伤。

血清标志物分析表明CK水平,LDH, cTn-I,和MB被释放到血液,所以这些酶的内容在血清中显著增加,表明心肌细胞受伤。应用光学和电子显微镜标本的形态学分析,我们发现,情感表达的特征组大鼠心肌核基质水肿,核差距拉大,增加线粒体和糖原,部分膜和线粒体嵴融合变得模糊或缺席,和少量的肌纤维坏死。这些发现表明,心肌细胞结构受损的详尽的锻炼。

肌肉氧化能力已经被测量评估呼吸permeabilized纤维没有限制的线粒体基质,ADP,或氧气13]。状态3的结果表明,ETS复合体I, II,第四,下降了55%,32%,和45%,分别。这表明力竭运动诱发抑郁症的心肌线粒体呼吸功能。为了实现细胞的能源需求,ETS将补偿生产大量的超氧化物反过来伤害心肌(14- - - - - -16),导致呼吸装置损坏和能源生产失败。相比之下,治疗组显示改善上述指标,特别是对萨尔高剂量组有明显改善能量代谢。这些数据表明,萨尔可以从详尽的运动性心脏损伤的保护通过改善线粒体呼吸功能和能量代谢。

共激活剂的PGC-1α在一份监管网络管理中起着核心作用的转录控制线粒体生物起源和呼吸功能。通过与多个转录因子的互动,PGC-1α提高线粒体的氧化磷酸化和触发器的协调表达能力核mitochondrial-encoded基因驾车,线粒体生物起源(17]。

实际上,两个不同的类转录水平的调控蛋白控制线粒体生物起源在哺乳动物系统。第一节课包括转录因子线粒体转录因子(Tfam)和线粒体转录因子B (mtTFB)亚型TFB1M TFB2M,从发散沉重,light-strand启动子的转录,直接在线粒体内D-loop监管区域。第二组核基因的转录因子作用于绝大多数的产品都需要呼吸链表达和生物学功能。其中包括核呼吸因子NRF1和NRF2(18]。因为我们主要观察线粒体呼吸功能的性能在这个研究中,我们更多的重视NRF1和NRF2。

在这个研究中,表达的水平PGC-1α,NRF1,NRF2信使rna调节后立即与对照组相比是锻炼;然而,PGC-1α,NRF1,NRF2蛋白质减少1.6倍、14.6%和52%,分别。mRNA和蛋白表达水平之间的矛盾可能表明力竭运动导致线粒体蛋白质合成生物起源或装配流程功能障碍。的差别,对这些NRF1和NRF2蛋白质也参与线粒体呼吸功能失调的合成复杂的子单元,导致减少线粒体呼吸功能(19,20.]。因此,减少PGC-1α及其下游转录因子nrf缺乏蛋白质造成心肌氧化能力和能源生产(1]。这些结果表明,详尽的锻炼是一个强烈的压力,它损害线粒体呼吸功能负责能源生产通过下调线粒体生物起源关键管理因素PGC-1α- - - - - -NRF1/NRF2信号通路。压力的持续时间将恶化能源生产和能源需求之间的不平衡来满足心肌的收缩功能,这将导致不可逆转的心肌损伤和能源失败。相比之下,萨尔组特别高剂量组显著调节治疗PGC-1α,NRF1,NRF2,这表明萨尔可以改善上调线粒体能量代谢的生物起源监管者和缓解剧烈运动引起的心肌损伤。

迄今为止,研究已经检查的变化PGC-1α他的心在各种运动模型。博塔携手et al。3报道称,短期和中强度运动调节PGC-1α。为期五周的高强度运动训练导致增加了41.5%PGC-1α信使rna表达水平(21]。这些有争议的结果可能取决于运动强度。

在这项研究中,萨尔显著降低血清心肌损伤酶的水平,减轻心肌超微结构损伤,提高线粒体的活性ETS复合体I, II,第四,增加表达线粒体生物起源的关键因素PGC-1α,NRF1,NRF2。所有的这些发现表明萨尔可以保护心脏免受详尽的运动性损伤通过改善线粒体呼吸功能和线粒体的生物转化。

总之,详尽的运动可以引起心脏损伤,包括结构性损伤,酶异常,呼吸功能下降,线粒体的差别,对这些基因的生物转化。这些不适应的特征的积累发起一个恶性循环,会进一步导致心肌代谢障碍,从而导致心肌损伤和心脏衰竭。萨尔,的一个主要从中药有效成分的提取r . crenulata,似乎保护详尽的运动诱发的心肌损伤,改善呼吸功能,上调线粒体生物起源。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项研究支持由中国自然科学基金会(没有。81173585)和中国的河北省自然科学基金(没有。C2014104010)。

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