GC-Rich诱发氧化应激细胞外DNA, DNA双链断裂和DNA损伤反应在人类脂肪间充质干细胞

文摘

背景。免费细胞DNA (cfDNA)在健康人的血液循环和各种疾病患者。在其GC-content CfDNA大大丰富与人类基因组DNA。主要研究结果。暴露haMSCs GC-DNA诱发短期氧化应激(确定H2DCFH-DA)和结果单-和双链DNA断裂(彗星试验γH2AX焦点)。结果在细胞显著增加修复基因的表达(乳腺癌易感基因1增殖细胞核抗原(流式细胞仪))(rt - pcr)和凋亡基因(BCL2(rt - pcr和流式细胞仪)BCL2A1,BCL2L1、BIRC3和BIRC2(rt - pcr))。的作用下GC-DNA线粒体增加的潜力。在这里,我们表明,DNA GC-rich细胞外刺激脂肪细胞分化的人类脂肪间充质干细胞(haMSCs)。接触GC-DNA导致RNA水平的增加PPARG2和LPL(rt - pcr)、脂肪酸结合蛋白水平的FABP4(流式细胞仪分析)和脂肪(油红O)的水平。结论。GC-rich cfDNA池的碎片可能会引起氧化应激和DNA损伤反应并影响人类脂肪间充质干细胞分化方向的间充质干细胞。这样的反应可能是肥胖或骨质疏松症的原因之一。

1。介绍

在1940年代,人们发现哺乳动物的DNA不仅是在细胞核中,但也在外周血循环(1](DNA,游离循环DNA,和血浆/血清DNA)。此外,DNA总是出现在细胞培养基(细胞外DNA (ecDNA))。有两个基本假设的血浆/血清cfDNA产地:核酸形成的细胞外的细胞死亡和/或活跃分泌cfDNA的活细胞(2,3]。强烈的兴趣cfDNA与使用它的可能性的目的各种癌症的诊断;胎儿发育的检测的干扰;对于干扰因素的风险评估,包括电离和紫外线辐射4- - - - - -6]。

目前,作者的注意力被吸引不仅使用cfDNA为疾病的早期标志和病理条件下,还要学习各种潜在的生物功能的cfDNA [6- - - - - -8]。在病理条件下,由于影响基因组的危险,许多cfDNA参数,如血浆浓度和内容不同的DNA序列在cfDNA,都改变了。作为cfDNA的一部分,GC-rich基因组序列往往积累。在cfDNA GC-content发现达到74.8%(平均为53.7%),而核GC-content只有38% (9,10]。早些时候,我们发现增加的内容片段的转录区域核糖体在cfDNA重复(rDNA) (11,12]。众所周知,GC-pairs rDNA多达80%的一些地区。cfDNA浓缩与核糖体重复几次与基因组核糖体重复内容相比通常发生在慢性病理伴随着强化细胞死亡(缺血性心脏病和风湿性关节炎)11- - - - - -13),以及由于慢性(电离辐射)[外部有害的影响14]。

人类脂肪组织(haMSCs)间充质干细胞是多能祖细胞,可以分化成多种细胞类型。haMSCs响应GC-rich序列内容的变更ecDNA培养基。GC-rich DNA分子作为配体所示的toll样受体家族,即TLR9识别。所有的配体TLR9识别包含CpG图案。TLR9识别的配体的内容直接取决于GC-content DNA DNA。TLR9识别刺激导致转录因子的激活NF-kB并产生肿瘤坏死因子α和白细胞介素6 (15]。众所周知,NF-kB激活可能导致逮捕的脂肪形成的分化和刺激骨生成16]。相反,它是显示最近的改变总ecDNA浓度的培养基haMSC紧随其后的是生产活性氧(ROS),被认为是代理显著提高脂肪生成(17]。haMSC方向分化的问题后改变ecDNA在环境介质的属性而言,是很重要的在活的有机体内响应干细胞的病理过程。此外,干细胞用于治疗目的的介绍进入病人的身体。作为一个规则,在严重的情况下,浓度和cfDNA GC-content haMSC接受者的身体与健康对照组相比显著改变。因此,本研究的目的是分析影响正常的和GC-rich ecDNA碎片ROS水平,双链DNA断裂,DNA损伤反应,自发分化haMSCs脂肪细胞。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

间充质干细胞(haHaMSCs)从脂肪组织中获得的病人接受外科手术。获得间质细胞,切碎的脂肪组织与胶原酶消化如前所述[17]。前面描述Immunophenotype和其他特点,收集细胞(17]。HaMSCs(2278)被种植在湿润的气氛中有5%的公司₂在空气中在AmnioMax 37°C C - 100基础培养基(Gibco),包含AmnioMax C - 100的补充。在治疗之前,细胞分裂不超过四次。Fluorescence-activated细胞分类分析(流式细胞仪)已经表明,培养HaMSCs并表达MHC分子(主要组织相容性复合体)(HLA-ABC +)和粘附分子(CD44 + CD54(低),CD90 +、CD106 + CD29 + CD49b(低),和CD105);然而,这些细胞为阴性造血标记(CD34、CD45、HLA-DR)和CD117标志(17]。存在的诱导物(包脂肪形成的分化、干细胞技术有限公司),这些细胞进行分化成脂肪细胞。HaMSCs被培养的DNA样本在湿润的气氛中公司为5%₂在空气中在37°C。伦理批准使用haMSCs从区域委员会获得了医疗卫生研究伦理(批准文号5)。

2.2。DNA探针

GC-DNA:线性化质粒DNA(10 197个基点)包含rDNA序列(5836个基点,73% GC)克隆成EcoRI pBR322向量的网站4361个基点(53% GC)长。克隆rDNA片段覆盖位置从515−5321人类rDNA根据HSU13369,资源库。线性化向量pBR322作为控制。所有DNA样本受到同一lipopolysaccharide-removing净化过程,包括治疗Triton x - 114紧随其后的是凝胶过滤HW_85 [15]。基因组DNA (gDNA ~ 38 - 40% GC)隔绝haMSCs酚提取方法。

2.3。rt - pcr分析

从培养细胞总rna分离使用黄色解决套件(Clonogen,圣彼得堡,俄罗斯)和DNAse对待我(Sileks,莫斯科,俄罗斯)。RNA是量化Quant_iTTM RiboGreen RNA试剂(MoBiTec)发光光谱仪LS 55(英国PerkinElmer)及其浓度归一化细胞的数量用于RNA隔离。使用执行反向转录MMLV-RT (Sileks、俄罗斯)的标准协议。个人mrna的相对丰度是由存在化验使用SYBRGreen PCR MasterMix(应用生物系统公司)和StepOnePlus仪器(应用生物系统公司)。RNA的含量化验在至少三个独立实验的简历为2%。真沸点后被用作参考基因的稳定表达的实验验证haMSCs使用真沸点,GAPDH和AKTB选择池。以下引物被命令在Sintol(俄罗斯):乳腺癌易感基因1(F: GGCTATCCTCTCAGAGTGACATTTTA, R: GCTTTATCAGGTTATGTTGCATGGT);BCL2(F: TTTGGAAATCCGACCACTAA, R: AAAGAAATGCAAGTGAATGA);BCL2A1(Bfl-1 / A1) (F: TACAGGCTGGCTCAGGACTAT R: CGCAACATTTTGTAGCACTCTG)BCL2L1(BCL-X) (F: CGACGAGTTTGAACTGCGGTA R: GGGATGTCAGGTCACTGAATG)BIRC2(F: GAATCTGGTTTCAGCTAGTCTGG;R: GGTGGGAGATAATGAATGTGCAA)BIRC3(c-IAP1) (F: AAGCTACCTCTCAGCCTACTTT R: CCACTGTTTTCTGTACCCGGA)NOX4(F: TTGGGGCTAGGATTGTGTCTA;R: GAGTGTTCGGCACATGGGTA);LPL(F: ACAAGAGAGAACCAGACTCCAA;R: GGTAGTTAAACTCCTCCTCC)PPARG2(F: ACCAAAGTGCAATCAAAGTGGA, R: GGCTTATTGTAGAGCTGAGTCT);真沸点(参考基因)(F: GCC CGA AAC GCCGAA答,R: 20 TGG TTC GTG GCT CTC T)。

2.4。流式细胞术

ki - 67的流式细胞仪测量PCNA、BCL2, FABP4,γH2AX, haMSCs Versene溶液中清洗,然后用0.25%胰蛋白酶控制光学显微镜。细胞转移到埃普多夫管和清洗DMEM培养基,然后离心,resuspended PBS。细胞被固定在3% PFA 10分钟37°C,用PBS洗净,然后用0.1% permeabilized Triton x - 100在PBS(σ)在室温下15分钟。PCNA, FABP4 BCL2分析使用特定抗体(美国eBioscience)和FITC山羊anti-mouse免疫球蛋白(我们生物,美国)。γH2AX和ki - 67进行了分析使用γH2AX-specific和ki - 67特定抗体用FITC标记(我们生物,美国)。量化的背景荧光,我们染色的部分细胞与二级FITC-conjugated抗体。细胞进行了分析使用CyFlow空间(Partec、德国);每个实验至少重复三次。细胞被封闭的亚种群CyFlow推荐的软件。

膜联蛋白V绑定化验:治疗后dna,细胞被胰蛋白酶化分离,清点,颗粒状(1000 r.p.m。5分钟)。细胞颗粒在膜联蛋白V洗一次PBS和一次绑定缓冲(10毫米玫瑰,pH值7.4,140毫米氯化钠,CaCl和2.5毫米₂)。细胞被膜联蛋白处理V-FITC在黑暗中在室温下15分钟。细胞荧光CyFlow空间进行了分析。

2.5。荧光显微镜

细胞图像获得使用AxioScope A1显微镜(卡尔蔡司)。疣状如前所述执行(16]。PBS的细胞被洗,固定在玻璃3%甲醛溶液在4°C,持续15分钟。眼镜被冷PBS洗两次5分钟和PBS Triton x - 100 1 0.1%时间10分钟,沾染了适合-γH2AX抗体(生物、美国)在室温下1 h在PBS Triton x - 100年的0.02%。后来我们添加了10分钟罗丹明phalloidin 0.4 U /毫升的浓度在PBS Triton x - 100年的0.02%。然后洗了三次细胞通过PBS和分析相同的字段准备的激发波长520 - 550纳米(红色荧光)和激发波长488 nm(绿色荧光)。每个准备至少100字段进行了分析。我们计算染色细胞的数量的四种类型:(1)没有明确点,(2)没有清晰的斑点的小和高数(但显然可解析),(3)数量非常高的信号(汇合的彩色区域),并与有丝分裂原子核(4)。执行的评估不具体的吸附与FITC-labelled鼠标的使用免疫球蛋白(我们生物,美国)。

2.6。活性氧的检测化验

实验进行幻灯片的玻璃瓶或96 -孔板(Nunclon,德国)。在治疗之前,细胞生长subconfluency。DNA治疗后,这些细胞被孵化37°C。检测活性氧产量,细胞治疗10μM H2DCFH-DA(分子探针/表达载体、钙、美国)。细胞分析了以下方法:(1)总荧光分析在96孔板格式,= 488海里= 528 nm (EnSpire设备、芬兰);(2)流式细胞术分析(Partec,德国)。H2DCFH-DA染色细胞在versene溶液清洗,然后用0.25%胰蛋白酶。胰蛋白酶化水平控制的光学显微镜观察。细胞转移到埃普多夫管199年洗与媒体,然后离心,resuspended 1 x PBS。分析了十万个细胞用流式细胞仪FL1激光;每个实验至少重复3次。

2.7。脂肪形成的分化

HaMSCs被播种到幻灯片的玻璃瓶,成长为subconfluency(~ 80%)和暴露于DNA样本50 ng / mL的浓度。在一周的DNA样本的培养基是刷新。在第14天,脂肪生成量化修复细胞4% PFA和0.3%油红O染色溶液(浓度、明斯特、德国)和CytoGreen(表达载体)。细胞图像获得使用AxioScope A1显微镜(卡尔蔡司)。控制(−)DNA样本没有添加到培养基;控制(+)-细胞培养在中可靠地诱导脂肪生成(“干细胞技术有限公司”)。分化实验重复三次。

2.8。统计数据

所有报告结果复制至少三次作为独立的生物复制。数据显示的平均数据和标准偏差(SD)。的意义使用非参数Mann-Whitney观察到的差异进行了分析U测试。值< 0.05被认为是显著и标记的数据。数据分析与StatPlus2007专业软件(http://www.analystsoft.com)。

3所示。结果

本研究使用subconfluent执行haMSCs获得捐赠国和CD标记表达的特征。haMSCs使用(第2278行)的详细描述了在我们以前的工作(17]。未经处理的MSC培养基含有内源性细胞外DNA (ecDNA)。平均浓度的内生ecDNA haMSCs介质ng / mL [15,17]。在大多数实验,集中添加50 ng / mL的DNA探针作为标准。两个主要类型的使用DNA的准备工作:(1)基因组DNA (gDNA)与低GC-content (~ 38 - 40%)。这个DNA是分散的短片段用有限水解DNAse 1和(2)与高GC-content DNA。第二种类型包括plasmid-vector pBR322 GC(53%)和GC-DNA质粒,其中包含pBR322向量和一个插入,GC-rich片段的转录区域人类核糖体的重复(rDNA)长5836 bp (GC) 73%。图1显示CpG-motifs的分布,构成TLR9识别的配体,在pBR322 plasmid-vector和质粒GC-DNA内。TLR9识别的配体应该是GC-rich DNA的生物活性的主要原因(12- - - - - -15]。图1还介绍了CpG-content人类核糖体的转录区域内重复,积累作为cfDNA在健康人的血浆,尤其是一些慢性疾病患者11- - - - - -14]。相比之下,图中还介绍了CpG-motifs分布在一个随机选择的序列长度相同的基因组DNA的转录区域人类核糖体的重复。此外,图1显示Gn-motifs的分布(在相同的DNA片段。Gn-motifs很有趣因为鸟苷中包含他们非常oxidation-proned [18]。因此,区域的DNA可能发生氧化。氧化DNA具有生物活性表达和诱导氧化应激在干细胞(17]。gDNA样本和GC-DNA含有DNA片段的长度约等于:~ 11 kb。

3.1。增加ecDNA浓度提升haMSCs ROS水平

细胞中活性氧含量的变化来响应更改总ecDNA浓度进行了研究使用流式细胞仪分析(图2(一个))。ROS水平评估使用H2DCFH-DA (10μ米)。添加染料是在孵化后的20分钟的细胞dna的一段时间,如图。测量进行了gDNA和GC-DNA (20 ng / mL,图2(一个))。几乎立即(在第一个5分钟)添加DNA探针中之后,急剧增加的ROS水平观察细胞(图2(一个)(B))。比gDNA GC-DNA诱发更强的反应。ROS水平haMSC添加GC-DNA之后是约等于ROS水平的H₂O₂氧化剂在0.2毫米。效果观察孵化前15分钟内的细胞和DNA探针或H₂O₂并进一步阻塞(图2(一个)(C))。30分钟后,细胞ROS水平处理GC-DNA或H₂O₂减少低于控制。信号下降可以被关联到一个真正的减少ROS水平的综合抗氧化反应的结果或染料渗漏通过细胞膜受损ROS。DCF泄漏的可能性的证据是外观,与时间的推移,清白的细胞的一小部分人口haMSCs治疗H₂O₂(图2(一个)(A和B))。以防haMSCs DNA探针的影响,没有观察到新兴的清白的细胞。

流式细胞仪数据被独立证实荧光读者数据。HaMSCs暴露在10 - 150 ng / mL的gDNA, pBR322, GC-DNA。ROS水平评估使用H2DCFH-DA (10μ米)后立即添加DNA探针。在实例中,图2 (b)(一)介绍了数据的影响DNA探针在haMSCs 20 ng / mL。所有的DNA样本刺激增加2 - 3重haMSCs产生的活性氧的水平。GC-DNA在更大程度上刺激ROS合成超过gDNA和pBR322。H₂O₂一般荧光强度明显增加,这印证了上述的假设染料渗漏的细胞,可能,因为膜破损。图2 (b)(B)显示了DCF信号的依赖增加了DNA探针的浓度。最大信号观察当GC-DNA探针被添加的浓度20 ng / mL。最大区别GC-DNA和观察gDNA探针50 ng / mL的浓度。

因此,大幅增加ecDNA浓度的几次会伴随着一个快速但短haMSCs ROS数量的上升。GC-DNA比gDNA和pBR322活性氧诱导物更强。GC-DNA的作用与0.2毫米的效果可比H₂O₂,但没有破坏细胞膜发生。高细胞ROS水平可能导致细胞的DNA的氧化。DNA氧化的著名的后果之一是单-和双链DNA的积累(SSBs和双边带)。

3.2。接触gDNA和GC-DNA诱发细胞的DNA链的休息时间

量化双边带gDNA或GC-DNA haMSCs暴露,我们使用一个共同的双边带的可视化技术,免疫染色组蛋白的抗体γH2AX,磷酸化丝氨酸- 139。众所周知,这种形式的H2AX迅速积累在DNA位点侧翼争端解决机构网站(19]。HaMSCs沾FITC-conjugated ser - 139磷酸化抗体组蛋白γH2AX图所示3。ROS破裂的主要后果之一是肌动蛋白聚合/解聚的过程(20.]。肌动蛋白的聚合形式的可视化(f -肌动蛋白)γH2AX,我们使用的共轭falloidin与罗丹明(21]。图3(一个)还表明,f -肌动蛋白的量与控制接触gDNA或GC-DNA后显著增加,这种蛋白质的染色强度/细胞被控制的多细胞。肌动蛋白stress-fiber形成一般发生后ROS破裂(22]。

在控制样本,%的细胞染色FITC-conjugated ser - 139磷酸化抗体组蛋白γH2AX。任何类型的DNA后添加到培养基中,细胞的比例γH2AX表达增加(图4(一))早在30分钟后,但是,3小时后,它会减少。减少对GC-DNA更加突出。因此,海拔ecDNA浓度导致短期增加细胞的数量和清晰的伽马集中表明增加细胞的数量与双链DNA断裂,部分,以防gDNA GC-DNA到达,分别有15%和19%的整个haMSCs池。

使用流式细胞仪,两个封闭的区域,R1和R2,研究(图3 (b)(A))。细胞内门R1 FL1最大(γH2AX);这是解释为多个双边带。门R2包含与低水平的细胞γH2AX和没有双边带。在控制,R1碎片使平均%的人口。这一部分包括细胞数量的升高γH2AX标记。这些细胞的数量增加2倍多早在20分钟后增加任何DNA浓度的介质,而开始减少1.5小时后添加DNA探针(图3 (b)(B))。GC-DNA面前,降低比较突出,,2.5小时后添加GC-DNA介质,R1一部分细胞的数量减少2倍相比,控制。因此,虽然ecDNA培养基浓度增加,的总量γH2AX组临时增加的部分细胞。可以观察到的影响不超过2 - 3小时后DNA是添加到培养基中。

因为有些作品最近发表的报道,甚至明确伽马集中并不总是对应于DNA断裂(23,24),我们使用另一种方法检测证实伽玛焦点数据染色质断裂。这种技术叫做DNA“彗星”试验,允许检测受损DNA在某个单独的细胞。我们采用彗星试验在碱性条件下电泳(图3 (c))。这项技术使测试完全单和核DNA双链断裂。实验进行了GC-DNA(图3 (c)(A))。作为参考的影响,确定后跟DNA断裂,使用电离辐射的剂量10 cGy。haMSC池由细胞(图4类型3 (c)(A))。1型细胞(他们90%以上的控制细胞池)不包含DNA断裂。2型细胞含有少量的DNA断裂。3型细胞,DNA是高度分散的,和4型细胞是细胞发生细胞凋亡(参考人口的不到1%)和极高的DNA碎片。图3 (c)(B)细胞总数的分数显示数据变化与不同程度的DNA断裂(类型2 - 4)发生后添加GC-DNA辐射介质或之后。GC-DNA,前30分钟内的实验中我们观察到细胞的形成,主要是,2型包含少量的休息。的人口被辐照细胞,在曝光后30分钟,大多数细胞类型的3。三小时后,部分细胞含有DNA断裂来减少和聚合参考水平。

我们分析了信使rna表达水平变化编码细胞DNA修复相关蛋白质BRCA1。在三个小时后添加GC-DNA haMSCs, BRCA1基因的mRNA水平显示(图增加7倍3 (d))。基因治疗与gDNA pBR322,也倾向于增加信使核糖核酸的生物合成,1.5 - 2倍。

因此,我们建立了一个崛起ecDNA浓度的培养基haMSCs伴随着新创核DNA断裂,可能是由于ROS破裂。DNA断裂阻止细胞周期。反过来,这可能影响haMSCs分异过程的脂肪细胞(25]。出于这个原因,我们研究了影响DNA探针添加在火腿细胞的细胞周期。

3.3。接触gDNA和GC-DNA没有显著影响细胞周期

评估增殖细胞的比例,这些细胞被固定的,沾FITC-labeled ki - 67抗体(26),进行流式细胞术分析。在图4(一)(A, B),可以看到结果的流式细胞仪对细胞种群种植在gDNA和GC-DNA (50 ng / mL, 0.5和3 h)。gDNA在30分钟内诱发的细胞的数量减少表达ki - 67。添加gDNA早在3小时后,标记水平方法参考价值。GC-DNA几乎没有影响ki - 67 +细胞的数量。

进行了类似的分析细胞增殖核抗原(PCNA) [27]。细胞被暴露于50 ng / mL gDNA GC-DNA, PCNA蛋白在细胞水平的增加与控制(图4 (b)(A, B))。有趣的是,当细胞增殖细胞核抗原在细胞水平的增加已经暴露于gDNA,因此,生产整体照片大大不同于ki - 67染色(图6(一))。

因为两个扩散标记显示不同的结果有关的变化水平细胞的增殖活动ecDNA浓度增加后,一个额外的考试的三个基因的表达参与了细胞周期调节。

众所周知,细胞周期启动激活细胞周期蛋白D1蛋白编码的合成CCND1基因。细胞周期蛋白D1启动细胞周期G1期和调节起着关键作用的细胞从G1 S期(28]。CCND1基因的表达水平阶段的转录调控。在haMSC接触gDNA片段,略微降低的水平CCND1基因表达发生在20分钟后向培养基中添加DNA片段(图4 (c))。GC-DNA诱发1.4倍提高CCND1基因表达在1小时后接触的开始。在24小时内CCND1基因表达水平haMSC平均增加1.2 - -1.5倍暴露在gDNA pBR322和当暴露于GC-DNA(图2.2倍4 (c))。

我们也分析了变化的表达两个细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂,参与细胞周期的调控。CDKN2编码p16蛋白,扰乱细胞周期蛋白D1 CDK(绑定的29日,30.]。另一种蛋白质,p21,指WAF / Kip CDKI家人和编码CDKN1A基因。p21的激酶抑制剂产生负面影响的活动cyclin-depended激酶(CDK2)复合物在细胞周期G1期和cyclin-depended激酶(CDK1)复合物在G2期细胞周期的28]。这种基因的表达是由p53蛋白。提高了CDKN1A基因表达可能导致G1-arrest。CDKN2和CDKN1A基因表达在haMSCs被发现增加了1.6 - -1.9倍的第一个小时内gDNA曝光。GC-DNA和pBR322没有显著影响CDKN2基因表达和CDKN1A(图4 (c))。

数据收集在图4表明,gDNA后第一个小时内被添加到培养基haMSC,暂时阻断细胞周期(减少ki - 67蛋白质含量,降低mRNACCND1,并提出大量的信使rnaCDKN2和CDKN1A)。相反,GC-DNA无关紧要的诱导增殖。

不调和的PCNA染色(图中观察到的变化4 (b)(图)和ki - 674(一))暴露后gDNA和GC-DNA可以解释为转移核过程对DNA修复(31日,32]。重要的是,PCNA参与DNA复制和DNA修复。此外,PCNA展示了作为生物标记的DNA修复DNA聚合酶-持续因素δ切除后修复DNA缺口受损的DNA链。

表达的增加γH2AX组蛋白一起,没有细胞周期阻滞,尽管ROS生成和双链断裂后GC-DNA曝光表明感应的快速和有效的DNA损伤反应(DDR) GC-DNA碎片。haMSCs存在这样的反应,这导致他们的更高的抗DNA损伤,早些时候证明(33,34]。在DDR,确定DNA修复基因的表达和影响基因增加细胞的生存。我们分析可能的DDR细胞孵化gDNA和GC-DNA介质的存在。

3.4。接触gDNA或GC-DNA支持细胞的生存

量化细胞凋亡早期,我们用FITC共轭膜联蛋白V(图5(一个))和流式细胞仪。经过三个小时的曝光gDNA或者GC-DNA,在对待文化中凋亡细胞的比例下降到低于平均水平的3和5次haMSCs控制。

在三个小时内添加GC-DNA haMSC培养基后,信使rna水平BCL2,BCL2A1(Bfl-1 / A1),BCL2L1(BCL-X),BIRC3(c-IAP1),BIRC2增加(图3 - 7倍5 (b))。gDNA或pBR322治疗,这些基因也会增加他们的信使核糖核酸的生物合成,1.5 - -2.5倍。经过长期增长的DNA探针,增加抗凋亡基因的表达水平BCL2,BCL2A1,BCL2L1,BIRC2保留在GC-DNA pBR322,然后呢BCL2A1表达式仍然在gDNA升高。

高水平的信使rnaBCL2在14日长孵化后haMSC pBR322或GC-DNA与BCL2蛋白质本身的数量的增加,使用流式细胞仪检测(图5 (c))。两个DNA探针诱导增加细胞的比率非常高水平的这种抗凋亡蛋白的表达(图5 (c)(一))细胞池中。接触GC-DNA的效果明显比的作用更加突出pBR322或gDNA(图5 (c))。

经过长期培养的haMSC的DNA探针的抗凋亡蛋白的表达水平下降。然而我们发现增加proapoptotic蛋白质的基因的表达伯灵顿(图5 (b))。

3.5。在haMSCs GC-DNA诱发脂肪形成的分化

我们孵化haMSCs存在3种不同的DNA探针(gDNA、GC-DNA pBR322)的浓度在14天50 ng / mL,使用标准的培养基,没有differentiation-inducing因素补充道。7天内的培养基是换成第二次加法DNA探针在同一浓度。消极的控制,细胞没有DNA探针添加使用,使用,积极控制,细胞培养的中包含标准脂肪形成的differentiation-inducing因素(干细胞技术有限公司)。实验开始后的14天,我们直观地记录了相当大的变化形态的细胞培养的GC-DNA(图6(一))。细胞含有小类脂颗粒积累haMSC人口特征。这些细胞它毗邻其他细胞没有不同形态的控制。在gDNA pBR322探针,细胞通常没有显示出相当大的区别在形态学方面的控制。然而,也有一些单个细胞,包括小类脂颗粒。

证明脂肪形成的分化,细胞被沾油红O(图6 (b))。3 DNA样本,GC-DNA样本只有诱导形成的大量可染色的类脂颗粒haMSC人口。我们应用额外的标记脂肪形成的确证haMSCs GC-DNA的存在。PPARG转录因子称为differentiation-inducing代理,表达的增加脂肪生成过程中(35,36]。GC-DNA的刺激增加了10倍PPARG2haMSCs mRNA水平(图6 (c))实验开始后的一个星期,而gDNA在相同条件下不产生任何高度表达的基因。随着海拔的表达PPARG2,GC-DNA在中增加了LPL几倍的RNA蛋白质,增加preadipocytes和脂肪细胞的表达(36]。

14天后GC-DNA haMSCs添加到培养基,我们记录的蛋白质编码的数量急剧增加FABP4基因的细胞。脂肪酸结合蛋白(FABP4)积累是评估使用流式细胞仪(图6 (d))。大约90%的细胞,与GC-DNA孵化,表示这个标记大量(门R,图6 (d))。控制haMSCs,仅仅10%的细胞表达了大量的这种蛋白质。gDNA和pBR322探针刺激额外的(控制)的引用FABP4蛋白质合成的细胞的数量少于GC-DNA整个细胞群的(大约20%)(图6 (d)(B, C))。

额外的验证haMSCs脂肪形成的GC-DNA海拔线粒体潜在的存在,这是测试TMRM mitotracker(图7使用荧光显微镜和流式细胞仪分析)。正如前面发现的,msc线粒体的重量大大增加脂肪形成的分化过程中(37]。gDNA和pBR322探针诱导逆效应:降低线粒体的潜力。有趣的是,从开始的2周后haMSCs栽培,在所有的DNA探针在中,细胞群开始包含与扩大核大细胞染色检测水平的降低与mitotracker(图7 (b))。

因此,我们建立了GC-rich人类DNA序列(rDNA)作为细胞外的一部分DNA haMSCs培养基诱导分化的脂肪细胞,即使没有通常的adipogenesis-inducing因素。

4所示。讨论

我们工作的主要结果如下:GC-rich人类基因组DNA的片段,被添加到培养基haMSCs,唤起自发脂肪形成的这些细胞的分化。GC-rich碎片的来源诱导脂肪生成GC-DNA-carrying质粒,包含GC-rich插入,即人类rDNA的片段,pBR322细菌向量。haMSCs分化的脂肪细胞在模型GC-DNA的存在证实了使用几个独立的标准技术:形态学改变的细胞(图6(一)),细胞染色,油红O染色(图6 (b)),扩张的RNA PPARG转录因子和标记蛋白质LPL(图6 (c)),并显著增加的内容FAPB4蛋白质在细胞(图6 (d))。

haMSCs栽培在GC-DNA面前时,我们观察到的其他影响,,根据发表作品,陪伴,甚至导致脂肪形成。例如,GC-DNA会导致线粒体的增加潜在的(图7)。这是早些时候证明线粒体活动增加是MSC分化成脂肪细胞的先决条件(37]。

此外,一个暴露在DNA片段添加到培养基中,无论GC-content,也诱导核DNA断裂(图3)。自发的DNA碎片最近观察到早期脂肪细胞承诺发生时(38]。这个DNA损伤是独立于自发或诱发细胞凋亡,可能是分化项目的一部分38]。脂肪形成的分化诱导的DNA断裂早期ecDNA碎片伴随着DNA修复的激活。三个事实点这种类型的细胞反应。的表达乳腺癌易感基因1基因(图3 (d))[39)和表达H2AX组蛋白的磷酸化形式(图3 (b))[19,39)增加。增殖细胞核抗原蛋白的数量(参与切除修复dna聚合酶的辅因子δ(31日])也增加的背景下,小改变ki - 67的数量,另一个增殖标记(图4)。因此,一个暴露在DNA片段后,我们观察到一个开发的DNA损伤反应(DDR)。DDR是一种程序,可以保护基因组完整性和抑制恶性转变。最近的研究表明,细胞分化的干细胞是DDR程序的影响下,也(25,33,34,40- - - - - -44]。GC-DNA诱导更有效比pBR322或gDNA DDR。GC-rich引起DNA核DNA断裂修复速度之快远远超过那些引起gDNA(图3),可能由于更可观的增加表达的蛋白质,参与修复过程(BRCA1(图3 (d))和PCNA(图4 (b)))。

在一起种植haMSC DNA片段添加到培养基我们观察减少细胞凋亡率(图5(一个))。最近,作者的45)建议转变之间的平衡proapoptotic在脂肪生成和凋亡分子导致更高的抗细胞凋亡。导致更高的电阻的haMSC在分化,细胞凋亡增加指出[BCL2基因的表现46]。在这项研究中,我们同样发现信使rna的含量显著增加BCL2haMSC这种蛋白质本身的,被种植在GC-DNA片段(人物的存在5 (b)和5 (c))。除了BCL2,其他抗凋亡基因的表达相同的家庭和那些BIRC家庭显著增加。haMSC长期培养后细胞gDNA和pBR322片段我们观察到的表达升高伯灵顿proapoptotic基因(图5 (b))。这种反应与大细胞的出现与损害线粒体在细胞池中。GC-DNA,这种反应是无关紧要的。

我们相信haMSC上述变化的主要原因是瞬态代ROS浓度的变化反应ecDNA培养基。许多研究人员点differentiation-inducing剂诱导活性氧生成的事实。活性氧调节脂肪细胞分化的间充质干细胞(47- - - - - -49]。建议增加细胞内ROS水平通过Nox4调节脂肪细胞分化在haMSCs [50]。gDNA、pBR322 GC-DNA诱导hAMSCs ROS水平的高度,和GC-DNA似乎更强比gDNA和pBR322 ROS生成的诱导因素。ROS生成机制刺激的添加ecDNA碎片仍然是未知的,需要独立的研究。有趣的是,hAMSCs ROS水平提高后几乎立即ecDNA浓度增加了。可以点建议DNA片段诱导活性氧产量与细胞膜结合的地方,表面上,通过改变活动氮氧化物家族的酶参与活性氧的生产。我们前面显示一个类似的机制研究DNA片段的行动在MCF-7癌细胞(51]。

应该注意的是,所有的三个DNA样本添加到培养基haMSC发起类似的反应在细胞(ROS破裂、DNA断裂和凋亡反应)。但细胞对治疗的反应的大小与ecDNA GC-DNA,更高,随着细菌向量,包含一个GC-rich片段转录区域的人类rDNA(图1)。因此,生物效应的GC-DNA haMSC不能完全由高GC-content和序列的存在解释说,是TLR9识别的配体。向量pBR322 GC-pairs(53%)包含相同的GpC-motifs, TLR9识别的配体,随着GC-DNA携带质粒,在尊重但不明确的活动与脂肪形成诱导浓度(50 ng / mL)使用。我们可以推测,人类中有特定GC-rich图案rDNA(和其他GC-rich人类基因组序列),确定绑定ecDNA细胞受体和确保DNA片段的渗透进入细胞。

可以建议一个猜测,这需要进一步的实验测试。正如之前我们发现的,人类DNA GC-rich地区不同于细菌GC-rich Gn序列的DNA通过非常高的内容(52)和图1。此外,Gn图案中的鸟苷是极易氧化8-oxo-guanosine (18,53]。是显示癌细胞序列包含氧化基地很容易穿透靠近细胞核和细胞质区域诱导活性氧的形成[急剧增加52]。据推测,高含量的容易氧化Gn的rDNA相比,pBR322向量衬底GC-DNA的高生物活性。gDNA无疑包括Gn,但其内容不高由于GC-pairs总含量低,在低浓度gDNA添加;他们对haMSCs施加无显著影响。rDNA内存在的配体,结合仍然不明活化受体,像著名的TLR9识别,也不应该被排除。

还需要进一步的研究来揭示了分子机械衬底GC-rich DNA作为脂肪形成的分化诱导物的作用。同时,未来的研究应该考虑到这一事实,在一些病理延长细胞凋亡的特征的情况下,循环DNA(游离DNA和cfDNA)富含GC-rich人类基因组序列的一小部分。特别是rDNA的内容可以增加10倍,更多的一些疾病,如风湿性关节炎或缺血性心脏病(11- - - - - -13]。在这种情况下,自己的身体的干细胞,以及haMSCs用于治疗,可以区分脂肪组织细胞。脂肪形成的haMSC改变的存在,GC-rich cfDNA肥胖和骨质疏松症可能是一个潜在的因素。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

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