hCLOCK引起rho激酶介导的内皮功能障碍和NF-κB-Mediated炎症反应

摘要

背景．人类昼夜节律运动输出周期蛋白Kaput (CLOCK)基因最初被发现是人类日常节律的调节器。这个看似无害的基因后来被发现与多种人类恶性肿瘤相关，通过多种生化途径。我们的目的是在生化水平上进一步研究hCLOCK在缺氧-氧化应激反应系统中的作用。方法．在常氧和缺氧状态下测定Rho GTPases的表达水平。利用逆转录病毒shRNA载体系统、Rho抑制剂和ROS清除剂，通过分析hCLOCK、Rho GTPases和NF-的表达水平，评估hCLOCK对缺氧反应的影响κB通路效应器。最后，我们评估了体外ROS的产生和HUVECs试管的形成。结果．缺氧通过hCLOCK诱导ROS的产生。hCLOCK激活RhoA和NF-κB信号通路。相反，抑制hCLOCK则使这些通路失活。此外，抑制RhoA或降低ROS水平会减弱这些途径，但抑制RhoA不会导致ROS水平的降低。总体研究结果表明，缺氧增加了hCLOCK的表达，从而导致ROS的产生，然后激活RhoA和NF-κB通路。结论．我们的研究结果表明，缺氧状态通过hclock介导的ROS生成，以及随后RhoA和NF-的激活，诱导了血管氧化损伤和炎症κB通路。

1.介绍

正如其名称所示，人类昼夜节律运动输出周期蛋白Kaput (CLOCK)基因最初被发现是人类日常基本节律的调节器。人类昼夜节律包括多种生理活动，从宏观过程，如睡眠-觉醒周期和核心体温，到分子机制，如激素分泌、代谢和细胞周期定时[1，2]．这些最终都是由一个反馈回路系统控制的，有一个完善的模型描述了异源二聚体转录因子CLOCK和BMAL1、隐色素Cry1和Cry2以及周期调节基因Per1、Per2和Per3之间的相互作用[3.]．在这些基因中，CLOCK被描述为主控基因。然而，另一方面，一些研究表明，节律基因表达并不需要CLOCK蛋白，而是节律基因强大的峰值表达水平[4- - - - - -6]．

生物钟的影响范围进一步扩大，因为昼夜节律的中断和昼夜节律基因的缺陷已知与人类恶性肿瘤有关。最近的研究已经描述了hCLOCK在脑、乳腺、结直肠、肾、肝细胞和子宫内膜癌中的癌前效应[7- - - - - -11]．尽管它的名字看似无辜，但hCLOCK通过多种途径调控凋亡、细胞增殖、激素受体表达和缺氧反应。

癌症进展中的缺氧反应以前已经被描述过，但还没有特别关注时钟的研究[12]．一般来说，细胞对缺氧、假缺氧或基因突变的反应是通过产生活性氧(ROS)引起DNA的氧化损伤。这些结果中的一些DNA修饰参与了各种癌症的起始[13，14]．有趣的是，癌细胞本身必须表达增加的抗氧化蛋白水平，以保护这些相同的ROS [15]．这在ROS和抗氧化水平之间引入了一种微妙的平衡，癌细胞需要精确地管理这种平衡，以发展和生存。因此，必须相应地调整抗肿瘤治疗策略。还需要进一步研究hCLOCK与氧化损伤和炎症反应之间的关系。

过去十年的研究发现了Rho GTPases和核因子之间的新的分子联系κB (NF -κB)炎症的途径[16]．Rho GTPases是20种蛋白质的集合，最著名的是RhoA、Rac和Cdc42，它们广泛存在于细胞内，介导细胞的扩散、粘附和运动。ROCK1是Rho GTPases的主要下游效应体，特别是RhoA。这些Rho GTPases受gtpase激活蛋白(gap)、鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEFs)和鸟嘌呤核苷酸解离抑制剂(GDIs)的调控。NF -κB通路是一种参与多种生理过程的信号级联，最显著的是它与肿瘤抑制通路的紧密结合、促炎功能、慢性炎症以及在免疫稳态中的作用[17- - - - - -20.]．NF-的诱导器κB通路，如肿瘤坏死因子(TNF)，白细胞介素(IL)，以及病毒和细菌产物如脂多糖(LPS)，已被证明诱导toll样受体(TLR)信号传导和细胞应激，如DNA损伤和缺氧[19]．激活NF-κ发现Rho GTPases通过B途径增加炎症介质IL-1、胶原酶-1的表达[21]、肿瘤坏死因子α (TNF-α)[22并产生炎症抑制因子p120连环蛋白的突变版本[23]．Rho GTPases已被证明能抑制NF-κ在某些情况下，当被脂多糖(LPS)和干扰素(IFN-)激活时，B通路也是如此γ)，破坏中枢神经系统炎症的精确稳态[24]．

hCLOCK和Rho GTPase/NF-在炎症和肿瘤机制之间的交集κ因此，B在未来的治疗策略中具有重要的应用潜力。我们的目的是在生化水平上进一步研究hCLOCK在缺氧反应和氧化应激中的作用。

2.材料和方法

2．1．化学物质

Rho抑制剂允许对Rho途径的具体研究，并揭示产生ROS的替代途径。活性氧清除剂可以很容易地控制活性氧浓度。细胞渗透性Rho抑制剂C-3转移酶(CT-04)购自美国Cytoskeleton公司(Denver, CO, USA)，溶解于DMSO中制成20μg / mL股票的解决方案。在分析前用稀释的CT-04溶液处理细胞24小时。Tiron(4,5-二羟基-1,3-苯二磺酸二钠盐，Sigma, St. Louis, MO, USA)是一种活性氧清除剂，溶解在二甲基亚砜(DMSO，最终浓度小于0.1%)中，制成100mm的原液。在分析前，用稀释的Tiron溶液处理细胞12小时。

2．2．细胞培养与处理

人脐静脉内皮细胞(HUVECs)购自American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)，保存在EGM-2 BulletKit (Lonza, Basel, Switzerland)中，包含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100μ克/毫升链霉素。

使用Xvivo Closed孵育系统(Xvivo System 300 C, BioSpherix, Lacona, New York, USA)，在不同的腔室中准确维持不同的氧张力。细胞在37°C、5% CO的环境中生长₂室内空气/ 95%。在常规细胞培养中培养24小时后，将细胞分为不同的室，不同的氧控制时间，然后采集细胞，测量ROS水平和管形成，并进行Western blotting。

2．3.逆转录病毒载体的制备

逆转录病毒将hCLOCK导入HUVECs，作为阴性对照细胞和混乱对照细胞的载体。

利用pGV186逆转录病毒载体(GeneChem Co.， Ltd.， Shanghai, China)进行逆转录病毒转导，生成稳定的过表达hCLOCK的转染子(GenBank登录号:NM_004898)。作为对照，也产生了一个单独表达绿色荧光蛋白的逆转录病毒载体。

利用pGV113逆转录病毒载体(GeneChem Co.， Ltd.， Shanghai, China)构建了靶向hCLOCK的短发夹RNA (shRNA)序列。以类似的方式制作作为对照的杂乱shRNA表达载体(SCR)。

２.４.RhoA活化的测定

根据Cao等人所描述的方法，使用RhoA activation Assay Biochem Kit (Cytoskeleton, Denver, CO, USA)，通过在细胞裂解液中加载RhoA蛋白来评估RhoA激活。25]，通过与含有谷胱甘肽- s -转移酶(GST)和Rhotekin rho结合域(GST- rbd)的融合蛋白亲和沉淀，Western blot检测细胞中gtp结合RhoA。简单地说，用Bradford蛋白测定法(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)提取细胞总蛋白并进行定量。然后用25μ将颜色鲜艳的谷胱甘肽亲和珠与GST-RBD偶联，以拉低gtp结合形式的RhoA。采用抗RhoA抗体的标准Western blot方法定量分析RhoA激活情况。

2．5．活性氧(ROS)水平的测量

活性氧(ROS)是一个术语，包括各种活性分子和自由基从分子氧。使用2 '，7 ' -二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA, 5μM, Invitrogen公司，美国纽约格兰德岛)。DCFH-DA是一种非极性非荧光染料，当被细胞内ROS氧化时，被细胞酯酶以剂量依赖的方式转化为极性、高荧光的DCF。在488 nm的激发波长和525 nm的发射波长下，用分光光度计(Leica，海德堡，德国)测量DCFH的荧光强度。

2．6．Tube-Formation化验

HUVECs中的管形成是一种完善的体外血管生成重组试验。抑制管形成的化合物可用于各种炎症或肿瘤疾病状态。在正常缺氧组和低氧混乱对照组(SCR)和shclock转导组之间的HUVECs中评估管形成。HUVECs (2 × 10⁴pgv113 -扰乱对照(SCR)或pGV113-shRNA-hCLOCK (shCLOCK)转导到24孔板的基质凝胶涂层孔中。8小时后使用徕卡DFC290数码显微镜相机(徕卡相机AG, Wetzlar，德国)拍摄照片。

2.7。免疫印迹分析

hCLOCK、RhoA、Rac1、IL-6、ROCK1、COX2、Phospho-NF-的相对表达量κB p65,β-actin采用标准方法Western blotting测定。抗rac1 (ab15880)和抗hclock (ab98948)抗体购自Abcam公司(Cambridge, MA, USA)。Anti-IL-6抗体(21865-1-AP)购自Proteintech公司(Chicago, IL, USA)。抗rock1(# 4035)，抗cox2(# 4842)，抗phospho - nf -κB p65 (Ser536， # 3033)抗体购自Cellsignal公司(Beverly, MA, USA)。反β-actin抗体(sc-47778)购自Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)。RhoA的频带强度归一化为总RhoA的频带强度。其他蛋白的带强度归一化为细胞结构蛋白的带强度β肌动蛋白。

2.8。统计分析

所有报告的结果代表了在三个重复中进行的至少三个实验的平均值±SD。组间统计比较采用双尾法-测试比较两个变量。如果，则认为差异具有统计学意义．

3.结果

3．1.缺氧状态下hCLOCK和RhoA表达水平升高

我们通过Western blot检测了24小时内缺氧状态对HUVECs中hCLOCK和Rho GTPases RhoA和Rac1表达水平的影响。在缺氧环境中，Rac1和hCLOCK的相对水平均在12小时和24小时时间点显著增加(图)1(一)）.此外，RhoA GTPase水平也随着缺氧暴露时间的延长而增加，当归一化至总RhoA (T-RhoA)时(图)1 (b)）.这些发现表明hCLOCK和RhoA都参与了缺氧反应，并构成了本研究其余部分的基础。

3．2．缺氧通过hCLOCK诱导ROS生成，抑制HUVEC管的形成

然后，我们通过量化ROS的产生和HUVEC管的形成来再次确认缺氧反应。如前所述，在常氧条件下，对照HUVEC组用对照逆转录病毒载体转导，作为比较ROS水平的基线。两个缺氧HUVEC组分别用扰乱(SCR)和hCLOCK敲低(shCLOCK)逆转录病毒载体转导。用DCFH分析测定相对ROS水平(图)2 (b)）.用数码显微镜照相机观察管的形成过程。通过shCLOCK转导抑制hCLOCK的效果如图所示2(一个)和2 (d)．在缺氧环境下与扰乱的逆转录病毒载体(SCR)进行转导后，DCFH分析显示，与常氧对照相比，HUVECs的相对ROS水平显著增加(,图2 (b)）.这组患者的输卵管形成明显减少(,图2 (c)）.然而，有趣的是，hCLOCK基因敲除逆转录病毒载体(shCLOCK)介导的缺氧环境中细胞的相对ROS水平导致ROS水平明显低于SCR组(,图2 (b))，但仍高于控制水平。相对管形成明显高于SCR组(,图2 (c)）.这些发现直接表明hCLOCK参与ROS产生的途径以及更多的抑制管形成的生理措施。

3．3.hCLOCK激活RhoA和NF-κB HUVECs中的信号通路

我们对CLOCK激活RhoA和NF-的假设进行了初步测试κ通过过表达hCLOCK，观察下游蛋白水平。知道缺氧诱导ROS的产生，我们在缺氧条件下进行了以下所有实验。RhoA和NF-中关键蛋白的表达水平κ通过Western blot检测转染对照逆转录病毒载体或过表达hclo逆转录病毒载体的HUVEC组的B信号通路。观察hCLOCK本身的蛋白表达水平，确定合适的技术。COX-2, IL-6和p-P65是NF-的主要效应因子κ与对照组相比，在hclock过表达载体转导的HUVEC组中，B信号通路的表达显著上调(图)3(一个)）.同样，与对照组相比，在经过hcllock过表达载体转导的细胞组中，RhoA途径的关键蛋白ROCK1和RhoA显著上调(图)3(一个)和3 (b)）.这些发现证实了CLOCK参与了RhoA和NF-κB信号通路，肿瘤发生的关键通路，以及炎症反应。

3．4．抑制hCLOCK使RhoA和NF-失活κB HUVECs中的信号通路

然后，我们试图确认hCLOCK与RhoA和NF-之间的直接关系κB信号通路。通过抑制hCLOCK来评估这种反向关联。用hCLOCK (hCLOCK knockdown)载体转导HUVECs后，通过Western blot检测这些途径中相同关键蛋白的表达水平。然后将这些结果与被扰乱的对照逆转录病毒载体转导的HUVECs中的蛋白表达水平进行比较。

我们发现，与对照相比，之前检测的所有关键效应蛋白，COX-2、IL-6、p-P65、ROCK1和RhoA，都通过shCLOCK转导显著下调(图)3 (c)和3 (d))，从而确定hCLOCK直接参与RhoA和NF-的激活κB信号通路。

3．5．RhoA抑制可减弱hcllock诱导的p-P65、ROCK1、IL-6和COX-2的表达，但不抑制ROS的产生

随后，我们针对RhoA信号通路来识别下游效应物是否被RhoA本身的抑制所抑制。我们检测了hclo过表达载体转导的HUVECs，暴露于细胞通透性Rho抑制剂C-3转移酶(CT-04)或空白溶液。对照组hclock过表达组表达较高水平的RhoA和NF-κB通路效应。然而，当过hcllock表达的HUVECs暴露于Rho抑制剂(CT-04)溶液时，所有之前过表达的效应蛋白均被下调(图)4(一)）.这些发现证明了抑制hCLOCK可以减弱RhoA和NF-的产生κB通路效应因子COX-2、IL-6、p-P65和ROCK1。然后，我们试图研究hCLOCK对ROS产生的影响。

过表达hclo的细胞组暴露于空白溶液中产生的ROS是对照组的2.5倍()，如预期的那样(图4 (b)）.然而，有趣的是，hclo过表达的细胞组暴露于Rho抑制剂(CT-04)下，与不受抑制的细胞组相比，产生了相似数量的ROS(图)4 (b)）.这一有趣的结果表明，抑制RhoA会减弱RhoA和NF-κB通路效应，它实际上并不抑制ROS的产生。这表明，ROS可能在RhoA上游的整个信号通路中有一席之地，或者有一个单独的通路。

3.6。hclo诱导的RhoA和NF-κB通路在ROS清道夫的存在下被抑制

为了回答之前实验提出的问题，我们决定以ROS为靶点，揭示其在缺氧反应中的作用。我们使用一种ROS清除剂Tiron来降低细胞ROS水平，并检测其对下游蛋白质的影响。本实验共分为三组:(1)经对照GFP载体转导的HUVECs经对照液处理;(2)经hcllock过表达载体转导的HUVECs经对照液处理;(3)经hcllock过表达载体转导的HUVECs经Tiron溶液处理。与之前的实验类似，用对照组溶液处理过hcl -过表达组表达了COX-2、IL-6、p-P65、RhoA和ROCK1水平的升高(图)5(一个)和5 (b)）.然而，当过表达hcllock的HUVECs被Tiron溶液处理时，它们表达的所有这些下游效应蛋白水平都降低了。我们发现降低ROS水平会抑制RhoA和NF-κB途径，而抑制RhoA则在不显著改变ROS水平的情况下抑制这些相同的途径，进一步阐明了hcllock诱导的缺氧反应途径。我们已经确定缺氧增加了hCLOCK的表达，从而导致ROS的产生，然后激活RhoA和NF-κB通路(图6）.

4.讨论

我们在此描述了hclo诱导的缺氧反应途径，它导致Rho GTPase和NF-κB介导内皮炎症反应。具体而言，本研究发现(1)缺氧状态下hCLOCK和RhoA的表达水平升高，(2)缺氧通过hCLOCK诱导ROS产生，抑制HUVEC管的形成，(3)hCLOCK激活RhoA和NF-κ(4)抑制hCLOCK使RhoA和NF-失活κ(5)抑制RhoA可减弱hcllock诱导的p-P65、ROCK1、IL-6和COX-2的表达，但不会抑制ROS的产生;(6)hcllock诱导的RhoA和NF-κB通路在ROS清除剂存在时被抑制。简单地说，缺氧增加了hCLOCK的表达，从而导致ROS的产生，然后激活RhoA和NF-κB通路。

我们在先前将hCLOCK与缺氧反应以及缺氧和炎症反应与肿瘤发生联系起来的几个领域的研究基础上，研究了这些特定的途径。此外，Rho GTPases和NF-κB通路都与炎症反应有关。我们试图找到这些途径之间的交集。

我们的初步实验证实了hclo诱导的缺氧反应途径的初步联系，即缺氧条件会增加hCLOCK和RhoA水平。所有进一步的实验都是在缺氧条件下进行的。低氧反应的途径是无数的，虽然hCLOCK以前没有明确的特征。

hCLOCK在ROS产生中的生化作用以前没有被描述过。通过使用shCLOCK逆转录病毒载体敲除hCLOCK，我们证实了ROS产生的缺氧反应是由hCLOCK介导的。这导致了ROS水平的显著下降。这些发现表明，尽管hCLOCK可能不是产生ROS的唯一介质，但它发挥了主要作用，因此是未来研究或治疗的潜在靶点。

先前的研究表明Rho GTPases和NF-之间存在联系κB途径和炎症反应，然后我们将注意力转向这些途径中的效应体。RhoA途径的主要效应子RhoA和ROCK1，以及NF-途径的主要效应子COX-2、IL-6和p-P65κB通路，被hCLOCK发现上调。这两种途径的效应因子随着hCLOCK的下调、RhoA的抑制或ROS水平的降低而下调。

我们使用的活性氧清除剂Tiron也能结合金属，包括铁、铜、铀、钒、铍和铬;因此，可以想象脱靶效应可能干扰了我们的研究[26]．在这些金属中，只有铁和铜可以合理地用于HUVECs。铜以前已被证明能激活NF-κB通路;然而，它通过产生ROS来实现这一点，类似于hCLOCK [27]．我们专门针对hCLOCK的shCLOCK敲除导致了这一通路的抑制，这表明铜和hCLOCK这两种诱导剂在诱导ROS产生方面具有相似但独立的作用。

RhoA和NF-κ在人类生物学的伟大世界中，B通路各有其深刻的影响范围，并在缺氧炎症反应中与hCLOCK结合在一起。迄今为止，研究已经在一个复杂的生化途径链的多个环节上进行，最终将调控因子如hCLOCK与炎症和肿瘤发生联系起来。我们对hclo诱导的缺氧反应的新特性有助于完成这条链。

综上所述，hCLOCK可诱导Rho GTPase介导的内皮功能障碍和NF-κB介导的炎症反应。这项研究为缺氧反应提供了新的见解，我们希望这些发现可能有助于进一步阐明炎症和肿瘤发生的复杂生物学的某些方面。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

唐晓、郭大乔对本文贡献相同。

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