活性氧是人类间充质干细胞开始扩散所需静止后退出

文摘

本研究关注的参与活性氧(ROS)间充质干细胞的过程中“醒来”,静止后进入细胞周期。使用人类子宫内膜间质干细胞(eMSCs),我们表明,细胞内基底ROS水平与细胞的增殖状态呈正相关的文化。我们的实验在G eMSCs同步₀阶段的细胞周期显示瞬时增加ROS水平在静止退出刺激后细胞增殖。增加eMSC之前登记的s阶段进入细胞周期,消除这个增加抗氧化剂(Tempol N-acetyl-L-cysteine,白藜芦醇)阻止了G₁s期过渡。同样,一个细胞周期阻滞,导致从实验观察抗氧化剂治疗同步人类间充质干细胞来源于脂肪组织。因此,我们表明,生理相关的ROS水平所需的启动人类间充质干细胞增殖和低水平的ROS由于抗氧化治疗可以阻止干细胞自我更新。

1。介绍

组织干细胞(SCs)成年有机体的未分化的细胞,维持自我更新能力和分化成成熟的子代细胞的能力的组织。SCs已确定在许多器官(大肠、小肠、胃、乳腺癌、皮肤、胰腺等)和组织(骨髓、脂肪、脐血、骨骼肌,等等)(1,2]。一些SCs已经被证明是一种体内生理组织更新和再生(3- - - - - -7),而其他人则展示了到目前为止他们的多功能和体外自我更新能力8]。在活体中,SCs可能仍处于静止状态的时间太长,进入细胞周期,以应对当地信号的损失和其他再生需求(9),或者可以增殖积极在正常稳态(1]。

SCs的自我更新的过程,类似于其他体细胞,精心策划的细胞周期调控分子,细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK) [10]。这些“领头羊”是由各种各样的辅助支持的演员,“如蛋白质和小分子调节细胞周期蛋白和CDK复合物的生产或活动。它已被证明11,12],活性氧(ROS)本条例是必不可少的组成部分在人类和小鼠成纤维细胞,以及不同类型的癌细胞。ROS的角色在SC自我更新最近也证明(13]。例如,造血干细胞数量较低的ROS地位被证明静SCs的许多特点,而细胞ROS水平更高与更增生性的SCs池(14]。同样,增殖、自我更新的神经SCs被证明保持高活性氧状态和药物或基因操作,减少细胞ROS水平干扰SC函数体外和体内(15]。此外,最近,它已经令人信服地表明,肺干细胞细胞内通量从低到中度ROS水平需要干细胞自我更新支持组织修复的过程(16]。

间充质干细胞(msc)是成人SCs来源于间充质组织,如骨髓、脂肪,牙髓,羊水,脐带血液、胎盘,骨骼肌,胰腺,子宫内膜2,17]。由于MSC能力组织损伤后炎症网站,分化成不同的间充质细胞,分泌多种生物活性分子,和执行免疫调节功能,这些细胞产生大量的再生医学领域的兴趣(17]。msc的广泛的体外扩张的能力,允许收集所需的体内治疗的细胞数量。同时,还有缺乏知识的基本MSC的生物学特性,包括活性氧的作用在MSC的命运。

目前,在msc ROS函数的两个主要方面进行了讨论。第一个担忧ROS的破坏性影响,被认为是msc老化的主要因素18]。这个假设是基于msc可以扩展有效的观察在缺氧条件下体外,同时保留multipotency [19)和外源性H₂O₂诱导msc过早衰老的20.,21]。另一方面,细胞内ROS已被证明参与msc命运的规定(22),例如,在分化(23人类msc[]和压力诱导过早衰老24]。在目前的研究中,我们证实了ROS的msc的生理作用是不会受到不利影响。我们的研究集中在积极作用的ROS MSC自我更新和关注的参与活性氧MSC“醒来”的过程中,对静止退出进入细胞周期。我们表明,瞬态ROS水平的增加同步msc是观察在入口前的静止退出细胞周期的s阶段,消除细胞G增加抗氧化剂的块₁s期过渡。在实验中我们主要用于人类子宫内膜msc (eMSCs) [25,26];但是我们的主要结论是支持的结果对人类脂肪msc (adMSCs)。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

人类子宫内膜间质干细胞来自脱屑子宫内膜的经血从健康的捐赠者使用中描述的方法26]。脂肪间充质干细胞分离从脂肪组织健康的捐赠者按照描述的过程(27]。msc被种植在DMEM / F12培养基补充10%胎牛血清,penicillin-streptomycin谷酰胺,1%和1%。msc从3到10通道被维持在37°C调湿室有限公司为5%₂在75厘米²培养瓶和亚文化每周两次。msc在G同步₀阶段的细胞周期为24小时血清饥饿血清刺激细胞增殖以10%紧随其后。在某些情况下,msc被接触抑制同步在高密度(40000细胞/厘米²)其次是金属堆焊低密度(5000细胞/厘米²)。

2.2。抗氧化治疗

我们使用三种抗氧化剂来改变细胞内ROS水平同步的msc的文化。N-Acetyl-L-cysteine thiol-containing (NAC)是一种广泛使用的抗氧化,减少谷胱甘肽的前体(5 - 20毫米最终浓度范围)。Tempol是超氧化物歧化酶模拟和自由基清除剂/旋转陷阱(1 - 2毫米最终浓度范围)。白藜芦醇是多酚植物抗毒素(20 - 40μ米决赛浓度范围)。所有的抗氧化剂被添加到生长介质在不同时间点细胞增殖活化后,立即表示,孵化。

2.3。ROS化验

细胞内ROS水平的测量我们使用redox-sensitive探针2′,7′二乙酸-dichlorodihydrofluorescein (H2DCF-DA,表达载体,d - 399)以及它的羧酸盐模拟5 (6)-carboxy-2′, 7′二乙酸-dichlorodihydrofluorescein (carboxy-H2DCF-DA,表达载体,c - 400)与额外的负电荷,阻碍其泄漏的细胞。Carboxy-H2DCF-DA染色导致低荧光信号和更好的细胞内保留与H2DCF-DA相比但显示定性相似的结果。H2DCF-DA和carboxy-H2DCF-DA溶解在DMSO溶液获得10毫米前股票的解决方案,进一步稀释使用。孵化了eMSCs 10μ米染色在PBS溶液在黑暗中为30分钟37°C,然后收获trypsin-EDTA解决方案,悬浮在新鲜培养基,并立即通过流式细胞术分析。比较独立的实验结论,ROS水平表达任意单位,在那里光纤是一种测量信号,然后呢是一个自发荧光背景信号。

2.4。细胞周期分析

贴壁细胞和PBS冲洗,收获使用trypsin-EDTA解决方案,悬浮在PBS。200年为细胞周期分析μ克/毫升的皂苷(美国纽约丙烯酰胺),250年μg / mL核糖核酸酶A(σ,圣路易斯,密苏里州,美国,R4642),和50μ克/毫升propidium碘(美国σ)添加到每个样品管。孵化60分钟后在室温下样品被流式细胞术分析。细胞周期分析使用WinMDI 2.8和ModFit LT软件(软件真实的房子,Topsham,我,美国)。

2.5。流式细胞术分析

细胞荧光测量使用流式细胞分析仪(becton dickinson, Epics-XL)配备一个氩激光(488海里)。细胞被检测到的大小和粒度使用FSC / SSC和细胞碎片被封闭了。平均荧光强度从10000个细胞。

2.6。免疫荧光

细胞生长在盖玻片和4%福尔马林固定在PBS, permeabilized Triton x - 100, 0.1%孵化1%牛血清白蛋白40分钟块非特异性结合,处理的主要鼠单克隆抗体ki - 67 (Abcam) 1 h,洗Tween-20 PBS / 0.1%,处理二次抗体1 h, Tween-20洗了PBS / 0.1%,与1复染色μ克/毫升DAPI。盖玻片是安装有2%没食子酸丙酯和可视化Axiovert 200显微镜下(德国卡尔蔡司)配备一个徕卡DFC 420 c相机(德国)。

2.7。统计分析

所有实验至少重复3次。数据显示为±SD,当表示。所有FC直方图和显微镜图像显示在整个论文对应于最具代表性的实验。统计学意义是评价以及,被认为是重要的。的线性相关程度由皮尔森积差相关系数估计。

3所示。结果

异步eMSC文化的实验表明,之间存在着正相关细胞增殖状态和基底细胞内ROS水平(图1)。在一组实验中,这些细胞被镀在不同播种密度、细胞周期分布和ROS水平测量48 h后。低密度的细胞表现出更高的增殖状态和更高的ROS水平相比,高密度的文化。在另一个批处理的实验中,我们测量eMSCs周期分布的动态变化和ROS水平在第一次细胞播种后3天。再次,增殖细胞的百分比之间的正相关和ROS水平被观察到。我们计算皮尔逊相关系数()表明ROS水平之间的关系的强度,G细胞分数₀/ G₁,S, G₂/ M期细胞周期,发现最高的系数(0.99)s阶段的实验数据1(一)和1 (b))。相应地,ROS水平的依赖细胞的百分比s阶段是线性的(数据1 (c)和1 (d))。如图1的主要部分,与细胞增殖ROS水平紧密相关。

阐明细胞内活性氧的作用的起始eMSCs扩散在静止退出我们在G eMSCs文化同步使用₀阶段的细胞周期血清饥饿或接触抑制。激活的细胞增殖后血清添加或金属堆焊的细胞在低密度,我们测量细胞周期的动态变化和ROS水平在第一个24小时。使用同步方法我们得到了类似的结果。图2展示了细胞周期的进化(图2(一个)和活性氧水平的动态数据2 (b)和2 (c))刺激后细胞增殖。ROS水平的依赖poststimulation时间(图2 (c))显示瞬时增加细胞内ROS在DNA合成的开始。的NAC(浓度范围5 - 20毫米)在不同时间点细胞中细胞增殖的刺激之后,但是在s阶段开始之前,阻止细胞s阶段过渡,是证明从细胞周期分布测量后24小时内激活的细胞增殖(图3(一个)(左)的一部分。同时,NAC治疗后实现细胞并不影响过渡到s阶段eMSC周期分布(图3(一个),对部分)。我们检查了NAC对ROS水平的影响开始前后s阶段的同步eMSCs文化,发现NAC治疗减少细胞内ROS水平浓度的方式(图3 (b)),这种减少几乎等于NAC添加时立即刺激细胞增殖和16小时后(图3 (c))。除了其他的抗氧化剂,Tempol(1 - 2毫米)和白藜芦醇(20 - 40μ米),s阶段开始前的细胞中也逮捕了eMSCs G₀/ G₁阶段的细胞周期(图4(一)),类似的效果与同步实验中观察到的文化adMSCs来源于脂肪组织(图4 (b))。msc的两种类型的可行性,进行流式细胞仪使用propidium碘染色后24小时孵化与抗氧化剂,不影响抗氧化治疗(数据未显示)。

检查antioxidant-arrested细胞是否退出静止,我们使用ki - 67表达测定。ki - 67是一种扩散标记蛋白在细胞核表达G₁,S, G₂/ M期细胞周期和缺席静止细胞的细胞核28]。eMSCs逮捕的状态与Tempol ki - 67抗体绑定了测定16小时后激活的细胞增殖。此时,控制细胞治疗与Tempol启动DNA合成,而Tempol-treated细胞仍在G被捕₀/ G₁细胞周期的阶段,从细胞周期分布动态证据,提出了数字2(一个)和4(一)。我们发现antioxidant-arrested细胞表达ki - 67(图5(b)),在控制细胞(图非常相似5(c))退出静止和大部分表示ki - 67。相反,serum-deprived细胞没有任何ki - 67抗体绑定(图5(a))。这些数据表明eMSCs对待Tempol细胞刺激后立即退出了静止状态和被捕的G₁阶段的细胞周期。

4所示。讨论

在前一节中给出的实验结果证明对ROS的参与在MSC自我更新和确认的过程中活性氧的作用在MSC的命运并不局限的破坏性影响。很明显,调制的ROS通量需要启动的MSC增殖。低水平的活性氧与静止msc、而增加了增殖ROS水平是典型的文化。抗氧化治疗可以防止s阶段的起始同步的细胞培养的MSC循环,阻止细胞G₁阶段。类似的效果已被观察到在造血14,神经15)、肺(16干细胞,在成纤维细胞和肿瘤细胞29日- - - - - -31日]。基于这些观察结果,我们建议ROS不SC自我更新一些独特的作用,但是,相反,是一个因素,调节各种细胞分裂增殖。这个假设将证实或否认之后,研究人员确定整个级联的信号转导通路,负责ROS-assisted增殖。现在几段路径中指定不同的细胞。ROS-depended神经干细胞的增殖与转译后的氧化相关抑癌基因PTEN的失活,一个负监管机构PI3K信号通路(15]。调制的ROS通量在肺干细胞激活核转录因子erythroid-2-related因子2所示(Nrf2),反过来,激活了Notch通路刺激细胞自我更新(16]。在人类和小鼠成纤维细胞以及在人类癌症干细胞,ROS-dependent后期促进复杂(APC)蛋白质的性质证明了控制DNA合成的起始(31日]。至于内源性活性氧的来源调制,氮氧化物蛋白质家族的活动在神经干细胞15),以及成纤维细胞(MnSOD活动32),被评为ROS-regulative因素是至关重要的。这些信号通路的不同部分,是否喜欢马赛克碎片的全貌,将聚集在一起组成的一般方案ROS-mediated信号转导负责细胞自我更新将显示时间。

5。结论

总之,我们已经表明,基底ROS水平呈正相关异步MSC的增殖状态的文化,临时增加的ROS水平同步MSC先于s阶段的起始细胞的周期,这消除增加抗氧化剂块G₁s期过渡和禁止MSC自我更新。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢博士谢尔盖诉Anisimov协作。o . Lyublinskaya博士,丫。鲍里索夫,n . Pugovkina承认支持RFBR(批准号14-04-01903)。大肠Burova博士和a . Borodkina格兰特没有支持。14-14-00718俄罗斯科学基金会。教授n Nikolsky谢谢俄罗斯科学院的项目”分子和细胞生物学。”o . Lyublinskaya博士,n . Pugovkina诉Zenin博士,a . Shatrova博士和博士i Smirnova格兰特没有支持的一部分。14-50-00068俄罗斯科学基金会。

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