文摘
背景。本研究的目的是调查是否(-)-epigallocatechin-3-gallate (EGCG)可以防止UA-induced炎症的影响人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)和体外的参与机制。方法。HUVEC受到尿酸(UA)有或没有EGCG治疗。rt - pcr和西方印迹进行确定炎症标记物的水平。抗氧化活性评价是通过测量回收活性氧(ROS)。功能作用的研究在HUVEC notch 1线使用RNA干扰进行分析。结果。UA显著增加il - 6的表达,ICAM-1, TNF -α,MCP-1 ROS在HUVEC的生产。与此同时,notch 1的表达及其下游效应显著增加。使用核,抑制notch 1信号明显阻碍了炎性细胞因子的表达在UA治疗。有趣的是,EGCG抑制炎性细胞因子的表达和ROS的生成。免疫印迹分析notch 1表明,EGCG显著降低炎性细胞因子的表达通过notch 1信号通路。结论。总之,我们的研究结果表明,notch 1 UA-induced炎症反应中起着重要作用,EGCG notch 1的差别,对这些可能是一个有效的方法来减少炎症和氧化应激诱导UA。
1。介绍
高尿酸血据报道增加痛风的风险,肾脏疾病,心血管疾病,如高血压和动脉粥样硬化(1]。尽管它的病因尚不清楚,高尿酸血可以夸张UA的生产二次,高细胞代谢条件或低肾排泄患者的肾功能损害(2,3]。组织积累UA导致水晶矿床的形成,引发内皮功能障碍和炎症反应的开始2,4]。炎症中扮演着某种角色的发展各种疾病如高血压、动脉粥样硬化和糖尿病(5- - - - - -11]。有用的局部治疗高尿酸血是有限的。
证据证实了Notch信号起到关键作用在炎症反应参与心血管疾病的发病机制12- - - - - -14]。配体和受体已报告增加受损心肌和血管15- - - - - -17]。然而,人们很少知道UA水平和notch 1的表达之间的联系。
儿茶素是一种黄烷醇来源于绿茶提取物(一种),最近一直在探索疾病疗法由于其抗氧化、抗炎、抗癌作用[18- - - - - -21]。以前的研究已经表明EGCG-mediated心脏保护对H2O2一种蛋白激酶/ GSK-3全身的氧化应激β/信号窖蛋白在体外和体内22]。此外,EGCG能抑制细胞色素c的释放和激活pro-caspase-3提高香烟烟雾诱发心肌功能障碍(23]。EGCG增加生产没有通过磷脂酰肌醇(PI) 3-kinase / Akt-medicating内皮一氧化氮合酶(以挪士)血管内皮细胞,增强胰岛素敏感性,改善内皮功能(24,25]。最近的研究表明,EGCG调节Notch信号抑制结肠癌细胞的增殖(26]。然而,EGCG的作用的影响高尿酸血一直悬而未决。
在这项研究中,我们评估,治疗UA的HUVEC激活炎症反应和氧化应激。接下来,我们检查了notch 1至关重要的潜在机制,揭示UA-induced炎症反应和氧化应激。进一步的实验表明,EGCG介导血管内皮细胞保护UA-induced炎症反应和氧化应激通过切口途径,至少部分。
2。材料和方法
2.1。材料
UA和EGCG从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。EGCG原液制备无菌双重蒸馏水在20毫米。UA是溶解在去离子水和过滤是免费的晶体(通过偏光显微镜)。
2.2。细胞培养和细胞转染
人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)从写明ATCC购买(罗克维尔市,医学博士,美国)。HUVEC是生长在EGM-2子弹工具包(Lonza、巴塞尔、瑞士)含青霉素G(100单位/毫升;Sigma-Aldrich)和硫酸链霉素(100μg / mL;Sigma-Aldrich)在37°C在湿润的气氛中5%的有限公司2。HUVEC培养了UA (8 mg / dL)对另一个与或没有EGCG预处理后24小时(20μ米)。
小干扰RNA (siRNA)针对notch 1(编号1 - 3)和炒siRNA设计和购买从GenePharma有限公司有限公司(上海,中国)。有效补充(上)两个RNA序列工器5′-GCACGCGGAUUAAUUUGCAdTdT-3′, 5′-UGCAAAUUAAUCCGCGUGCdTdT-3′。notch 1的全部cDNA克隆pcDNA3.1向量(表达载体)和DNA测序证实了。短暂的沉默,5×105/毫升细胞被播种到60毫米盘和转染notch 1核(50 nmol / L)使用Lipofectamine 2000(英杰公司公司,卡尔斯巴德、钙、美国)根据制造商的协议。中被完全培养基和孵化取代37°C 48小时前进一步分析。免疫印迹的转染效果进行了评价。
2.3。通过荧光分光光度法测量细胞内ROS生产
确定HUVEC的ROS水平受UA的存在或EGCG,化学发光分析是评估使用CellROX绿色试剂(技术)。检查的HUVEC被播种到24-well盘子和处理各种处理。CellROX绿色试剂孵化在浓度为10μmol / L和混合大力为1小时37°C。荧光的CellROX测量用激光扫描共焦显微镜(徕卡,TCS SP2, Bensheim,德国)的激发波长488 nm和510 nm排放过滤器。semiquantified ROS被表示为相对荧光单位(RFU)和所有的实验都是在重复,重复三次。
2.4。RNA提取和实时定量PCR(存在)
从细胞总RNA提取使用试剂盒(英杰公司集团)后,制造商的协议。互补脱氧核糖核酸合成使用500 ng Transcriptor总RNA的合成第一链cDNA工具包(罗氏,曼海姆,德国)。由此产生的第一链cDNA放大在最后20卷μ包含10 L pmol每个引物的一步SYBR PrimeScript rt - pcr工具包II(豆类、应用科学、日本)。用于PCR扩增的寡核苷酸引物由上海Sangon合成技术,Inc . (Sangon,中国),列出如下:底漆:Hes1正向引物:5′-CCTGTCATCCCCGTCTACAC-3′,反向引物:5′-CACATGGAGTCCGCCGTAA-3′;MCP-1正向引物:5′-CAGCCAGATGCAATCAATGCC-3′,反向引物:5′-TGGAATCCTGAACCCACTTCT-3′;NF -κB,正向引物:5′-GAAGCACGAATGACAGAGGC-3′,反向引物:5′-GCTTGGCGGATTAGCTCTTTT-3′;ICAM-1正向引物:5′-TTGGGCATAGAGACCCCGTT-3′,反向引物:5′-TGGAATCCTGAACCCACTTCT-3′;肿瘤坏死因子-α正向引物:5′-CCTCTCTCTAATCAGCCCTCTG-3′,反向引物:5′-GAGGACCTGGGAGTAGATGAG-3′;GAPDH正向引物:5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′,反向引物:5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。熔解曲线分析每个引物的使用,和每个显示一个峰值表明每个引物的特异性检测。所有值计算使用三角洲Ct方法和表达变化相对于3 -磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的表达。变性的扩增条件40周期为1分钟在94°C,退火30年代的60°C。
2.5。免疫印迹分析
细胞溶解产物与冰冷的PBS和准备使用冲洗裂解缓冲卫有1%,1%诺乃清洁剂p 40, 0.1%十二烷基硫酸钠(SDS)和1%脱氧胆酸盐和蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏)。蛋白质浓度由布拉德福德决定分析工具包(Bio-Rad)和等量的蛋白质是使用Bio-Rad 12% sds - page分离装置。2小时的膜被封锁后5%脱脂牛奶在室温温带蛋白质转移到PVDF膜(美国微孔,Billerica的)。蛋白质与以下主要抗体:孵化il - 6和TNF -α(美国默克密理博,贝德福德,MA), ICAM-1, Hes5和MCP-1(美国Abcam,剑桥,质量),Hes1(美国位于马里兰州Rockville OriGene技术),Hey1和Hey2(美国Proteintech集团、芝加哥、IL),和phospho-p65(美国CST、芝加哥、IL)。Anti-GAPDH抗体(Bioworld,南京,中国)作为加载控制在所有西方墨迹。二级抗体,anti-mouse anti-rabbit免疫球蛋白结合辣根过氧化物酶,得到从康晨(上海,中国)。最后,蛋白质乐队可视化使用西方Supersignal毫微微衬底(美国皮尔斯,罗克福德,IL)。
2.6。统计分析
结果意味着±SD。微分的统计意义的发现是统计评估使用GraphPad StatMate软件(GraphPad软件公司,圣地亚哥,CA)。统计学意义为对比组决定使用学生的成对双尾t以及或方差分析(方差分析)。一个< 0.05被认为是具有统计学意义的价值。
3所示。结果与讨论
3.1。结果
3.1.1。高尿酸水平在HUVEC诱发炎症反应和氧化应激
先前的研究表明,高尿酸血与高血压、系统性炎症,和心血管疾病由内皮功能障碍和病理血管重建27]。探讨UA对HUVEC的影响,我们通过免疫印迹检测炎症趋化因子的表达。UA il - 6的表达明显增加,ICAM-1 MCP-1, TNF -α在一个集中的8 mg / dL(图1(一)在HUVEC)。最近的研究表明,炎症反应诱导生成活性氧(ROS)在内皮细胞NADPH oxidase-dependent方式(28]。然后我们进一步调查UA的活性氧产量的影响。如图1 (b)UA显著增加HUVEC的活性氧产量(倍,)。
(一)
(b)
3.1.2。高尿酸水平上调NOTCH 1表达和激活NOTCH信号
在炎症反应(Upregulation notch 1扮演了重要的角色13,29日]。调查是否受UA notch 1,我们检查了通过引入UA notch 1表达。提出了图2(一个),UA诱导细胞内notch 1水平剂量依赖性的方式,和最大刺激达到8 mg / dL ()。notch 1的表达引起UA也是时间,显著高于控制的8小时,24小时后达到顶峰的刺激(;图2 (b))。进一步检查切口的激活信号UA治疗后,Hes1, Hes5, Hey1, Hey2蛋白质表达被免疫印迹分析评估。如图2 (c),UA Hes1的蛋白质含量增加,Hes5, Hey1,但不是HUVEC的Hey2(数据没有显示)。这些数据表明,缺口信号通路参与了UA诱导的损害。
(一)
(b)
(c)
3.1.3。切口沉默限制UA-Induced炎症反应和氧化应激
我们曾报道,UA导致炎症趋化因子mRNA表达增加,如MCP-1 ICAM-1 P65, TNF -α。接下来,进一步调查是否NOTCH信号通路的激活参与UA-induced炎性反应,我们与Notch-1-specific siRNA转染细胞和免疫印迹分析证实有效的可拆卸的NOTCH 1(图3(一个))。通过核减少差别如预期的那样,对这些基因的mRNA水平的il - 6, MCP-1 ICAM-1 P65, TNF -α(数据3 (b)- - - - - -3 (f))。来证实这些结果,我们也分析了蛋白质含量的差别,发现对这些notch 1表达导致p-P65表达降低,Hes1, il - 6, MCP-1 ICAM-1, TNF -α,这是由UA(图3 (g))。此外,我们检查了ROS生产notch 1击倒时,我们的研究结果表明,notch 1沉默相比显著降低活性氧的生产控制在HUVEC(图3 (h))。这些结果清楚地表明,notch 1在UA-induced炎症反应中起着至关重要的作用和氧化应激。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
3.1.4。EGCG减弱UA的效果
研究表明,EGCG在抗氧化和抗炎作用中扮演一个重要的角色在多个生理过程(19,20.,25]。评估UA EGCG对HUVEC损伤的生物活动,我们发现了蛋白质的il - 6水平,MCP-1 ICAM-1, TNF -αnotch 1、Hes1 Hes5, Hey1和结果表明,EGCG可以显著抑制炎症趋化因子的表达(图4(一))。此外,与以前的结果一致,我们发现预孵化与EGCG显著抑制ROS生产UA引起的。因此,这些数据表明,EGCG有效减少炎症反应和氧化应激,因此可能会帮助患者高尿酸血。
(一)
(b)
3.1.5。过度的notch 1保护HUVEC EGCG的减少
进一步调查是否EGCG调节Notch-1-mediated炎症反应和氧化应激,我们用pcDNA3.1-Notch-1质粒转染细胞。免疫印迹分析表明,notch 1表达的蛋白质水平显著增加在HUVEC控制向量相比,转染细胞(图5(a))。此外,证明notch 1的超表达可以抑制EGCG减少下游蛋白质,我们进行免疫印迹分析。正如我们所料,蛋白质水平的il - 6, MCP-1 ICAM-1, TNF -αnotch 1, Hes1, Hes5逆转后notch 1超表达(图5(b))。与上面的结果一致,没有显著差异HUVEC转染与notch 1有或没有EGCG(图5(c))。总之,我们的结果表明,EGCG监管UA-induced细胞损伤部分是通过中介NOTCH信号通路。
3.2。讨论
以前,我们展示了EGCG的心脏保护与通过NF - UA引起的炎性病变κB信号通路。在当前的研究中,我们进一步研究了UA的影响,EGCG在HUVEC炎症反应和氧化应激。我们发现notch 1参与UA-induced炎症反应和氧化应激。此外,我们发现与EGCG预处理明显减少notch 1和其下游基因的表达。当我们在写作本文,Jatuworapruk等人报道,EGCG可以适度降低血清尿酸(SUA)水平和显著升高血清抗氧化能力在健康个体30.]。这些结果,首次提供了一个机械的高水平的UA之间的联系和儿茶素的抗氧化和抗炎作用。
最近的研究表明,高尿酸血的特点是高血清尿酸水平与高血压,痛风,系统性炎症、心血管疾病介导的内皮功能障碍和病理血管重建(1,2,13,27]。在目前的研究中,治疗UA的HUVEC,我们发现UA显著增加炎症细胞因子和活性氧的生产。最近的证据表明,缺口信号在心血管疾病的炎症中发挥了重要作用[31日]。然而,在HUVEC的角色等级信号不被看好。然后我们关注UA notch 1表达的影响。我们的研究结果表明,UA激活notch 1剂量和时间的方式。切口Hes1目标基因,Hes5、Hey1 Hey2进一步确定在蛋白质水平和Hes1的表达,Hes5, Hey1,但不是Hey2,显著增加。进一步评估UA-induced炎症反应和氧化应激参与了NOTCH信号,我们击倒NOTCH 1核表达。notch 1抑制下游基因的表达显著减少notch 1和炎症趋化因子mRNA和蛋白水平。我们的研究结果表明,UA的影响在HUVEC导致炎症反应和氧化应激参与改变notch 1和其下游基因的表达。
先前的研究表明,EGCG强有力的抗氧化性能和游离基清除剂19,24,25]。陈等人报道,EGCG能够保护H9c2鼠cardiomyoblasts对H2O2通过一种蛋白激酶/ GSK-3全身的氧化应激β/β连环蛋白和小窝信号32]。它提醒我们是否EGCG能减少炎症趋化因子的表达和ROS的生成。正如我们所料,EGCG预处理减少炎症趋化因子的表达和阻止活性氧的释放。最近的研究表明,EGCG抑制了Notch信号抑制结肠癌细胞的增殖(26),以确定是否EGCG抑制炎症反应的分子机制和HUVEC细胞氧化应激参与了NOTCH信号蛋白。支持这一点,过度的notch 1减毒的作用EGCG和增强炎症趋化因子的表达和活性氧的释放。这项研究的结果可以用于高尿酸血以提高患者的生活质量。
4所示。结论
总之,我们目前的研究结果表明EGCG抑制UA-induced炎症反应和氧化应激通过notch 1减缓炎症趋化因子和活性氧的生产。然而,需要进一步的调查来确定真正的体内效应。
信息披露
资金来源没有参与研究设计、数据收集、分析和解释,报告的写作,或者决定提交投稿。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
承认
这项工作得到了国家自然科学基金(国家自然科学基金委81100603花叶)。