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氧化医学与细胞寿命
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氧化医学与细胞寿命/2015/文章

研究文章|开放访问

体积 2015 |文章的ID 162876 | https://doi.org/10.1155/2015/162876

Nathália Villa dos Santos, Andreza Cândido Matias, Guilherme Shigueto Vilar Higa, Alexandre Hiroaki Kihara, Giselle Cerchiaro， ＂乳腺上皮细胞的铜吸收激活细胞周期菌素并触发抗氧化反应"，氧化医学与细胞寿命， 卷。2015， 文章的ID162876， 11. 页面， 2015． https://doi.org/10.1155/2015/162876

乳腺上皮细胞的铜吸收激活细胞周期菌素并触发抗氧化反应

Nathália Villa dos Santos，1 Andreza坎Matias，1 Guilherme Shigueto Vilar Higa，2 亚历山大Kihara给总裁中西宏明，2 和 吉塞尔Cerchiaro1

1ABC联邦ABC大学自然科学和人文科学中心（UFABC），SP，SP，巴西09210-170 SantoAndré

2美国ABC联邦大学(UFABC)数学、计算和认知中心，09210-170 Santo André， SP，巴西

学术编辑器:约瑟夫·a·Adeyemi
收到了 2015年3月10
接受 2015年6月14日
发表 2015年10月25日

摘要

铜对肿瘤细胞的毒理学作用在过去的几十年里得到了广泛的研究，认为铜离子可能引发肿瘤细胞的抗增殖作用在体外．然而，在正常细胞中，高暴露游离铜的毒理学效应尚不清楚。在这项工作中，我们评估了铜处理的乳腺上皮MCF10A非肿瘤细胞中铜的摄取、细胞周期调控相关基因的表达、ROS的产生和相关氧化过程的水平。我们已经证明，Cu添加剂与细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白B1以及细胞周期蛋白依赖性激酶2 (CDK2)的激活有关。这些非肿瘤细胞通过增加细胞内还原性谷胱甘肽(GSH)水平、减少活性氧(ROS)的生成和细胞周期进程中的积累来响应cu诱导的氧化平衡变化，从而防止细胞异常增殖或死亡。综上所述，我们的发现揭示了一种作用，它有助于防止正常细胞受到含铜离子药物化疗作用的可能损害。

1.介绍

生化工具的最新进展突出了铜在生物体内的非凡功能[1］．铜是与双特异性丝裂原激活蛋白激酶激酶1结合所必需的MEK1促丝裂原活化蛋白激酶MAPKv-raf小鼠肉瘤病毒致癌基因同源物B的信号传导和肿瘤发生BRAF在乳腺肿瘤中[2］．然而，尽管在过去的几十年里，我们对铜的生物学知识有了巨大的扩展，但我们只是刚刚开始揭示这种过渡金属在细胞过程和细胞周期调节中的作用的复杂性。

铜是人体必需的微量元素，其细胞内浓度受到严格控制。在细胞内，Cu通过金属伴侣分布，在调节细胞生长、改变基因表达(由于核酸中鸟苷和腺苷残基的氧化或转录因子/生长因子活性的变化)中起着重要作用[3.］．肿瘤发展的一个关键因素是血管生成，它使营养物质、生长因子和信号剂持续供应到恶性组织[4- - - - - -7］．这种肿瘤中的血管生成反应是由血浆铜载体铜蓝蛋白刺激的[6，8，9］．虽然这些具有癌细胞和肿瘤的研究强烈建议Cu在细胞生长和增殖中发挥着重要作用，但对于底层的分子机制而言，知之甚少。此外，Cu参与产生细胞内反应性氧（ROS）的氧化还原反应，主要通过Fenton反应，以及铜，ROS生产和癌症发展之间的一些报告点[10.，11.]，以及最近铜代谢在癌细胞对顺铂耐药中的作用[12.- - - - - -14.］．细胞的氧化还原状态受反应性物种的稳态的影响，因为ROS可以作为次要信使在调节与细胞增殖，分化和细胞凋亡相关的途径中[15.，16.］．基于这些发现，一些研究表明，提高Cu水平和增加氧化应激可能用于选择性癌症治疗[17.，18.];然而，铜刺激对细胞增殖的影响及其与ROS的关系还需要进一步阐明，特别是在非肿瘤细胞中。

本研究的目的是澄清铜在正常上皮细胞中与细胞周期激活的关系，并确定这种离子作为CuSO供应的机制4，刺激乳腺上皮细胞的细胞周期在体外．为此，我们评估了经铜处理的乳腺上皮MCF10A非肿瘤细胞中铜的摄取、细胞周期调控相关基因的表达、ROS的产生和相关氧化过程的水平。

2.方法

2．1.化学物质

除非另有说明，化学试剂均来自Sigma-Aldrich(美国)，且为分析级:溶液采用milliq水(Millipore, Billerica，美国)配制。

２.２.细胞培养

用不含DNAse和rnase的水制备细胞培养基，通过0.22过滤μm过滤膜(milllex GV, SLGV033RS, Millipore, Billerica, USA)。细胞培养使用无菌一次性非热致塑料器皿操作，并保持在37°C的5% CO的气氛中2在相对湿度80%的空气中。人乳腺上皮细胞MCF-10A (ATCC)在Dulbecco 's Modified Eagle 's Medium (DMEM, 12100046, Gibco, Waltham, USA)和Ham 's F12营养混合物(HamF12, 21700-075, Gibco, Waltham, USA)中以1:1 (v/v)的比例混合培养，并添加5%灭活马血清(16050-130,Gibco, Waltham, USA) 10μg/mL胰岛素(PHC9624, Gibco，美国)，0.020μg/mL人表皮生长因子(EGF, PHG0311, Gibco, Waltham, USA)， 0.5μG / ml氢化酶（H0888，Sigma Aldrich，St.Louis，USA），0.10 μg/mL胆毒素(C8052, Sigma Aldrich, St. Louis, USA)， 100 U/mL青霉素，100μg/mL链霉素(P4333, Sigma Aldrich，圣路易斯，美国)。细胞按常规胰酶接种于4 × 10密度的培养皿上4细胞/厘米2．每个月，在没有抗生素的情况下培养细胞以进行控制，并使用MycoAlert支原体检测试剂盒(LT07, Lonza, Walkersville, USA)进行常规检测。

２.３.细胞增殖检测

MCF-10A细胞以4 × 10的密度孵育于24孔板中4cell /厘米2在上述条件下的24小时。新制备的CuSO溶液的等量4分别加入培养基(小于总体积的1%)，以达到最终浓度范围为25.0-1000μM，再孵育24-48 h。在此基础上，将处理过的细胞培养到CuSO中进行后续实验4最终浓度为50μ米( ）和对照细胞在未填充的介质上。通常，将细胞以4×10的密度覆盖到介质上4细胞/厘米2给予约50-60%细胞汇合的单层细胞，并孵育48小时。孵育后，胰蛋白酶化细胞，用磷酸盐缓冲盐水洗涤(PBS: 137 mM NaCl和2.7 mM KCl在pH 7.4的10 mM磷酸盐缓冲液中)，用台班蓝染色(T8154, Sigma Aldrich, St. Louis, USA)，并在光学显微镜下使用Neubauer氏室计数[19.］．

２.４.RNA的分离、cDNA的合成及实时荧光定量PCR

MCF10A细胞在有或无CuSO条件下被培养4(50μ米, )在1 mL TRIzol试剂(15596-026,Invitrogen公司，美国沃尔瑟姆公司)中均质，并按照制造商的协议提取总RNA。空气干燥后，RNA重悬在二乙基碳酸酯处理水(DEPC, 40718, Sigma Aldrich, St. Louis, USA)中，浓度由260 nm的吸光度测定。按照制造商的协议，使用DNase I (E2215Y, GE Healthcare Life Sciences, USA)去除残留DNA。每个逆转录反应，4μg总RNA与1μL益生元(dT) (11.- - - - - -17.)引物(0.5μg / gydF4y2BaμL;Invitrogen公司，沃尔瑟姆公司，美国)，在65°C孵育10分钟。然后将混合物放在冰上冷却，与4混合μ5倍第一链缓冲器的L, 2μL为0.1米DTT（R0861，Thermo Scientific，Waltham，USA）1 μL DATP，DTTP，DCTP和DGTP（每10毫米，AM8200，Invitrogen，Waltham，USA），1 μl上标III逆转录酶（200 u; 18080-044，Invitrogen公司，沃尔瑟姆，美国)，无菌水到最后20卷μL，在50℃下孵育60分钟，随后通过在70℃下加热15分钟而灭活。使用Corbett Life Science Scient-Gene 6000热循环仪（QIAGEN）进行实时PCR，具有用于人微型D1的特异性引物（前进：5'-TGGGTCTGT GCattTCTGGTT-3'，反向：5'-GCTGGAA ACATGCCGCGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG_A）和Cyclin B1（前进：5'-AggaactcgaaAtaAtgct GaaA-3'，反向：5'-CCGTAGGAACGCGC TTTG-3'）。作为内部对照，用特异性引物测定甘氨联醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因表达（前进：5'-CCACCACATGGC AAATTCC-3'，反向：5'-TGGGATTTCCATT GATGACAAG-3'）。使用以下程序进行PCR测定：在50℃下进行预防2分钟，并在95℃下初始活化10分钟，然后在95℃（变性）下进行两秒钟，60分钟°C（退火/延伸）。通过从60至95℃加热样品以评估引物特异性，获得PCR产物的解离曲线。

2．5．PCR数据分析

使用Medhurst等人所描述的比较周期阈值法评估靶基因的相对表达水平[20.］．一个值为 是由半对数扩增图几何区域内检测到的荧光确定的，代表PCR循环数，在此循环数时，荧光高于基于前15个周期基线数据的可变性而建立的任意阈值。

2.6。石墨炉原子吸收光谱法(GFAAS)固体取样

从Carvalho做Lago等人获得实验参数。[21.]及新发展的干燥细胞方法[20.］．简单地说，使用ZEEnit 600 (Analytik Jena)型原子吸收光谱仪，配备横向加热石墨雾化器，反向和横向2-和3场模式塞曼效应背景校正器，手动取样附件和空心铜阴极灯，来测定细胞内的铜浓度。热解包覆的加热石墨管和热解包覆的船型固体取样平台被广泛使用。氩(99.998% v / v;液化空气，Mauá，巴西)作为保护和净化气体。所有测量都是基于在Windows NT软件的帮助下获得的综合吸光度值。

2.7。培养细胞中铜含量的测定

MCF10A细胞在有或无CuSO条件下被培养4(50.0μ米)如上所述使胰蛋白酶化和贴壁细胞的总和,与磷酸盐缓冲盐水洗五次(PBS: 2.7毫米137毫米氯化钠和氯化钾在10毫米磷酸盐缓冲pH值7.4)包含1.0毫米EDTA为了消除残余铜(II)、干燥器干燥1周。实验是用表面积为75或150厘米的平板在三次或五次中进行的2．对于石墨炉原子吸收光谱法测定铜，采用Carvalho Do Lago等人的方法[21.］．

2.8。提取的核

来自MCF10A细胞的核，这些细胞已在CuSO存在或不存在下培养4(50.0μM)使用已公布的程序分离出上述的[22.，23.］．简单地说，以4 × 10的密度接种细胞4cell /厘米2放入装有适当培养基(150厘米)的培养瓶中2在37°C、5% CO的环境中培养48小时2在相对湿度80%的空气中。实验进行了四次。孵育后，胰蛋白酶化细胞并将贴壁细胞结合，用PBS洗涤，离心(250-300 ×g, 10分钟，4℃)，并在2ml裂解缓冲液(10 mM NaCl, 3 mM MgCl)中重悬2在pH 7.5的10mm Tris缓冲液中加入0.5%特吉醇NP-40)，冷藏5分钟。随后细胞离心(500 ×g, 5分钟，4°C)，颗粒在2ml裂解缓冲液中重悬并再离心。第二次离心得到的颗粒(包含提取的核)在30°C的烘箱中干燥，随后通过石墨炉原子吸收光谱分析。采用兔抗组蛋白H3 n端和兔抗人Cu/Zn SOD1多克隆抗体进行Western blot分析，确定提取的细胞核纯度。

2.9。细胞内活性氧的生成

MCF10A细胞在有或无CuSO条件下被培养4(50.0μM)用胰蛋白酶/EDTA (1 mM, 25200-056, Gibco, Waltham, USA)溶液处理，PBS洗涤3次，悬浮在50.0μM的解oxidation-sensitive非荧光探针2 '，7 ' -二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH, D6883, Sigma Aldrich, St. Louis, USA) [24.，25.］．37℃孵育45分钟[19.]，用PBS冲洗细胞三次，使用Cytomics FC 500 MPL (Beckman Coulter)仪器在530 nm处立即用流式细胞仪测定细胞内荧光水平[26.，27.］．实验至少进行五倍，每个样本的>2万个活细胞在每个实验中以任意荧光单位进行分析。

2.10。GSH/GSSG比值的测定

MCF10A细胞在有或无CuSO条件下被培养4(50.0μ如上所述，如上所述，将胰蛋白酶化和粘附细胞合并，用冷PBS洗涤三次，并离心（1500×G，3分钟，4℃）。将细胞重新悬浮于400 μL，然后在干冰和乙醇的混合物中冷冻10分钟。解冻后，用100μL 10%磺基水杨酸(390275,Sigma Aldrich, St. Louis, USA)，并离心(4000 ×g, 5分钟，4°C)。测定颗粒中的蛋白质浓度，并采用Martín等的方法评估上清液中GSH和GSSG的水平。[28.］．对于GSH定量，测定混合物包含100个 μL上清液，790μL 0.1 M含0.05% EDTA的磷酸钠缓冲液，pH 7.0, 100μL 6 mM 5,5 ' -二硫代二苯(2-硝基苯甲酸)(DTNB, D8130, Sigma Aldrich, St. Louis, USA)溶解在谷胱甘肽测定缓冲液(GAB;含6.3 mM EDTA的125 mM磷酸钠)μ谷胱甘肽还原酶(55 U/mL, G3664, Sigma Aldrich, St. Louis, USA)。对于GSSG的定量，试验混合物包括100μ上清液的L, 190μL 0.5 M磷酸盐缓冲液，pH 6.8, 700μL 0.3 mM NADPH (N5130, Sigma Aldrich, St. Louis, USA)，在GAB中制备，10μ谷胱甘肽还原酶(55 U/mL)。反应速率由25°C (GSH)条件下3分钟后412 nm的吸光度变化估算，或由30°C条件下16分钟后340 nm的吸光度变化估算[28.- - - - - -30.］．用DTNB (D8130, Sigma Aldrich, St. Louis, USA)测量GSH参比标准品的准确性，摩尔消光系数为13,600，吸光度为412 nm [31.］．考虑到NADPH在340 nm时的摩尔消光系数为6270，且1 mol NADPH将1 mol GSSG转化为2 mol GSH，通过测量NADPH在谷胱甘肽还原酶存在下的下降，将GSSG标准化[32.］．

2.11。免疫印迹分析

MCF10A细胞在有或无CuSO条件下被培养4(50.0μ用胰蛋白酶/EDTA (1 mM, 25200-056, Gibco, Waltham, USA)溶液处理，用PBS洗涤3次，150重悬μl RIPA缓冲液（150 mm NaCl，5 mm EDTA，1mM Dithiothreitol，1％Triton X-100（X100，Sigma Aldrich，St.Louis，USA），0.5％脱氧核酸钠（30970，Sigma Aldrich，St.Louis，美国圣路易斯））和0.1％SDS（L3771，Sigma Aldrich，Sigma Aldrich，St.Louis，美国）在pH 7.5的pH7.5中）含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒用于哺乳动物细胞（P8340，Sigma Aldrich，St.Louis，USA）和离心（14000 ×g, 20 min). Supernatants and pellets were transferred to Eppendorf tubes and stored at −80°C until being required for analysis. Protein concentrations were determined according to the method of Lowry [33.]使用牛血清白蛋白（A2153，Sigma Aldrich，St.Louis，USA）作为标准，提取到SDS-PAGE并涂上硝化纤维素膜（10600001，GE Healthcare Life Sciences，New York，USA），具有相同的装载通过内部质量控制印迹确认蛋白质α-Tubulin（T9026，Sigma Aldrich，St.Louis，USA）。在包含5％的非脱脂牛奶（M7409，Sigma Aldrich，St.Louis，USA）和0.0025％叠氮化钠（V000494，Sigma Aldrich，Sigma Aldrich，St.Louis，USA）中，膜被封闭溶液中封闭1小时。溶解于TBS-T中（150mM NaCl，50mM Tris，在pH 7.5，0.05％Tween-20），并用TBS-T洗涤两次。所用的主要抗体是小鼠抗湿藻素依赖性激酶2（抗CDK2克隆P34 P9OH-1 SC-51578; Santa Cruz Biotechnology，海德堡，德国）和小鼠反α微管蛋白(DM1A;Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Germany)单克隆抗体或兔抗组蛋白H3 n端(H0164, Sigma Aldrich, St. Louis, USA)和兔抗人Cu/Zn超氧化物歧化酶1 (AB5480, Millipore, Billerica, USA)多克隆抗体。使用SuperSignal West Pico化学发光底物(34080,Thermo Scientific, Waltham, USA)检测特异性二抗(抗小鼠或抗兔igg -过氧化物酶结合物，A4416或A0545, Sigma Aldrich, St. Louis, USA)处理后形成的特异性蛋白复合物。

2.12。统计分析

所有实验均至少重复5次(另有说明除外)，实验结果以平均值±标准差表示。采用Bonferroni校正的方差分析(ANOVA)来评价在显著性水平设置为的平均值之间的差异 ．对于real-time PCR实验，将每个细胞系获得的值与时间和处理因素进行双向方差分析，并使用Tukey HSD检验进行两两比较，显著性水平设置为 ．

结果

3.1。可行性 细胞内铜水平的测试和测量

采用台盼蓝排除试验初步评价Cu对非肿瘤细胞系MCF10A的活性影响。基于浓度依赖性研究(图1)， MCF10A在浓度高于75.0时未见增殖μM CuSO424小时孵化后（图1(一))，但48小时后细胞活力显著降低(图1 (b))，当铜含量等于或大于200.0时μM.在24小时后比较未处理和处理的细胞时，我们没有观察细胞增殖或细胞死亡的差异， 可行的细胞/毫升与 （ ) 25μM Cu,或与 （ ) 50μM Cu,或与 （ ) 75年μM Cu,或与 （ ) 100年μM Cu,或与 （ ) 200年μM Cu,或与 （ ) 1000年μM Cu(图1(一)）.类似地，对于48小时的Cu孵育，在比较未处理和处理的细胞时，我们没有观察细胞增殖或细胞死亡的差异， 可行的细胞/毫升与 （ ) 25μM Cu,或与 （ ) 50μM Cu,或与 （ ) 75年μM Cu,或与 （ ) 100年μM Cu,或与 （ ) 200年μM Cu,或与 （ ) 1000年μM Cu(图1 (b)）.由于对MCF10A无增殖作用，浓度为50.0μM CuSO4在整个研究中被选择。

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图1
Cu治疗与上皮MCF10A细胞的增殖。用Cuso处理MCF10A细胞4对于（a）24小时和（b）48小时，而未处理的细胞用作对照。用台盼蓝染色后计算活细胞。数据代表平均值±标准偏差（ ）.Cu处理和未处理细胞之间的显着差异由星号表示（ ）.

从含CuSO的培养基中摄取铜4将整个干燥的MCF10A细胞置于GFAA中进行评估[34.］．有趣的是，MCF10A细胞能够将Cu（II）内化。与对照组相比，50μ米的CuSO44小时后铜(II)水平升高， μg / g与 μg / g ( ）分别（图2（a））.12小时后，考虑到各自的值，未处理和处理的细胞之间的差异增加了 μg / g与 μg / g ( ,图2（a））.我们还观察了24小时后未处理和处理的细胞内铜浓度的差异， μg / g与 （ )和48小时 μg / g与 （ ）分别（图2（a））.随后，分别从处理和未处理的细胞中分离细胞核，并通过Western blot测量核蛋白组蛋白H3和主要胞质蛋白SOD的相对含量来验证纯化(图)2（b））.在所有这些步骤之后，GFAAS显示，实际上Cu进入了MCF10A核，根据对照和处理细胞的核中Cu浓度的值， μg / g与 μg / g ( ,图2 (c)）.

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图2
用固体进样-石墨炉原子吸收光谱法测定了这段时间内铜的吸收。(a) 50处理MCF10A全细胞中的Cu浓度μM CuSO4在未经处理的细胞中，在48小时内。与对照组相比，50μ米的CuSO44、24、48小时后，Cu(II)水平升高。(b) Western blot分析验证非肿瘤MCF10A细胞细胞核的纯度。用兔抗组蛋白H3 n端和兔抗人Cu/ zn超氧化物歧化酶1多克隆抗体检测胞质和核部分的相应蛋白。(c)对照组和50处理细胞的细胞核中铜的浓度μM CuSO448小时后。Cu处理和未处理细胞之间的显着差异由星号表示（ ， ）.
３．２．MCF10A上皮细胞系细胞周期蛋白D1和B1的实时PCR分析

为了评估Cu(II)盐刺激人类上皮细胞增殖的机制，我们研究了参与细胞周期进程的基因的调控。根据序列稀释cDNA(1,1 /3, 1/9, 1/27)的扩增图，进行线性回归分析，解离熔融曲线，设计特异性引物，验证其可靠性。通过这些步骤，我们验证了为人细胞周期蛋白D1设计的特异性引物(图)3(一个)- - - - - -3 (c))和cyclin B1(图3 (d)- - - - - -3 (f))以及GAPDH(图3 (g)- - - - - -3（i）)作为内部控制。实时荧光定量PCR显示MCF10A细胞暴露于50μ米的CuSO4触发周细胞周期蛋白D1的上调（0.297倍诱导; 23％; ,图3（j））和细胞周期蛋白B1（1.236倍诱导; 136％; ,图3（k）)基因表达。使用小鼠抗环素依赖性激酶2(抗cdk2)和小鼠抗α微管蛋白(内标)作为一抗显示，MCF10A细胞在Cu存在48小时后CDK2表达水平上调(图)4）.

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图3
Real-time PCR显示，Cu刺激MCF10A细胞cyclin D1和cyclin B1基因轻度上调。细胞周期蛋白基因在50μM CuSO4．结果绘制并相对于各种未处理的细胞归一化。通过实时PCR验证了人甘油醛3-磷酸三磷酸脱氢酶（GAPDH），细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白B1的引物的特异性。Amplification plots, linear regression, and dissociation melting curves for (a–c) cyclin D1, (d–f) cyclin B1, and (g-h) GAPDH obtained with serial dilutions of cDNA (1, 1/3, 1/9, and 1/27). (j) Expression of cyclin D1 in Cu-treated MCF10A cells. Significant differences between untreated and Cu-treated cells are indicated by asterisks ( ， ）.
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图4
Western blot结果显示MCF10A细胞中细胞周期蛋白依赖性激酶2 (Cyclin-Dependent Kinase 2, CDK2)的表达水平在Cu暴露过程中上调。(a) 50处理后细胞的CDK2蛋白水平μM CuSO4和比较α-微管蛋白(来自 ）.在每个时间点，100μg蛋白从总细胞裂解液装载到每个通道上检测CDK2。α-微管蛋白作为加载控制，使用Image J软件计算每个车道(以条表示)的密度。(b)与对照组相比，处理过的细胞在12小时后显示CDK2水平增加。数据以任意单位表示，表示的平均值±标准差 独立的实验中, ．
3.3。普通MCF10A细胞中ROS生成的分析

利用膜透性非荧光细胞探针DCFH估计了暴露于Cu(II)的细胞内以过氧化氢和氧衍生的羟基和碳酸盐自由基形式产生的细胞内ROS, DCFH以氧化形式存在(2 '，7 ' -二氯荧光素;DCF)是荧光的[26.，35.- - - - - -37.］．数字5(一个)显示dcfh处理的MCF10细胞暴露至50时，DCF荧光的变化，通过流式细胞仪在520 nm处测量μM CuSO4．早在6小时，未处理的MCF10A细胞的荧光强度就明显高于Cu(II)处理的细胞， ％与 % ( ）.在12小时后，我们还观察到对照细胞的荧光强度降低， ％与 % ( )，以及24小时后， ％与 % ( ）.在48小时后，对照和处理细胞之间的荧光强度的变化持续存在， ％与 % ( ）分别（图5 (b)）.

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（b）
图5
cu处理的MCF10A细胞产生的活性氧(ROS)比未处理的细胞少。细胞内ROS的生成，即细胞暴露于Cu(II)，使用膜透性非荧光细胞探针DCFH进行估计。(a)根据DCF水平的典型细胞数分布图，在对照组和处理细胞中由50诱导μM CuSO4在特定的时间点，由流式细胞术测定。(b)与对照组相比，处理过的细胞在6小时、12小时、24小时和48小时后显示DCF水平降低。未处理细胞与铜处理细胞之间的显著差异用星号表示( ）.
3．4．细胞内谷胱甘肽水平的量化

为了阐明Cu入射在MCF10a细胞中的影响，如estrela等人所示，确定暴露于Cu（II）的细胞中的GSH / GSSG比例48小时。[38.］．我们测定了细胞内总谷胱甘肽水平，以确保这种内源性抗氧化剂的水平在铜处理期间没有改变。对照和铜处理细胞的谷胱甘肽总水平 和 （ )，表明总谷胱甘肽(GSH + GSSG，图6（a））.MCF10A细胞在对照培养基上培养48h后，GSH/GSSG比值为 (图6（b））.包含Cuso.4在培养基中增加到 （ ）GSH / GSSG比率。

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图6
Cu处理改变MCF10A细胞的氧化还原电位。(a)对照组谷胱甘肽总量为50μM CuSO4处理过的细胞经过48小时的孵育(b) 48小时培养后还原至氧化谷胱甘肽(GSH/GSSG)的比率。未处理细胞与铜处理细胞之间的显著差异用星号表示( ）.

4.讨论

铜络合物可引起癌细胞的凋亡，这是细胞器受损的结果[19.，39.，40，这一过程可能导致对游离金属过量对正常细胞细胞周期实际影响的误解。在本研究中，培养基中添加游离盐CuSO4为了探讨游离细胞内Cu对正上皮MCF10A细胞增殖的影响在体外．游离Cu离子及其浓度的具体选择是基于Carvalho Do Lago等人最近报道的结果[21.］．此外，恶性细胞通常具有增加水平的氧化剂物种，有助于自然地增强凋亡[41]，而非恶性的MCF10A较低的氧化水平应该有助于它们抵抗铜刺激的细胞死亡。

细胞周期的不同阶段的进展是由细胞周期蛋白和CDKs的特定组合调节的。细胞周期蛋白和CDKs可以参与除细胞增殖以外的其他过程，正如在氧化应激触发的神经退行性过程中，细胞周期蛋白表达和细胞周期再进入导致凋亡的相关报道所证明的[42］．

在本研究中，正常的MCF10A细胞暴露于Cu后cyclin D1和B1表达轻度上调。有趣的是，我们发现当Cu的内部浓度超过100时，cyclin B1的表达上调μ当Cu浓度在150-275范围内时，上调Cyclin D1的G / G细胞 μg / g细胞。MCF10A细胞允许Cu的入口，使得金属的内浓度充分升高，以引起细胞周期胰蛋白酶mRNA水平的特异性上调。实际上，在MCF10A细胞的细胞核中检测到Cu，表明该离子可以触发基因表达的变化，包括与细胞周期进展有关的那些。恶性细胞通常具有增加的氧化物种水平，这些氧化物种对增殖的增强有助于增强[41]，而非恶性的MCF10A较低的氧化水平应该有助于它们抵抗铜刺激的细胞增殖。

氧化还原循环通过调节细胞内的抗氧化剂/氧化剂物种(特别是含硫醇的分子，如谷胱甘肽)来控制哺乳动物细胞周期的概念在文献中得到了广泛的考虑。15.])。在癌细胞中，谷胱甘肽/谷胱甘肽比例已被证明影响细胞周期的调节、诱变机制、DNA合成、生长以及多药和辐射抗性，而且肿瘤组织中谷胱甘肽水平通常高于正常组织[38.，43］．在本研究中，我们观察到铜的内化，由CuSO处理诱导4，降低ROS水平，增加GSH/GSSG比值。在对癌症的铂耐药中也观察到铜耐药[44］．暴露于肿瘤哺乳动物细胞MCF7中的可溶Cu(II)导致细胞增殖明显增加，这是由于Cu的摄取和氧化还原状态的干扰[45］．

如果我们比较具有同等代谢率的铜处理乳腺上皮细胞系，即MCF7肿瘤细胞的细胞增殖程度、细胞周期调控相关基因的表达、ROS产生及相关氧化过程的水平[45]和上皮性MCF10A非肿瘤细胞，我们可以观察到细胞之间的不同行为。观察到的铜刺激肿瘤细胞增殖与细胞周期蛋白上调或增加的金属胞浆浓度无关，而是与增强的ROS生成和提高的脂质过氧化水平有关，这导致了细胞膜形貌的改变[45］．相比之下,我们观察到在这个工作,铜不刺激nontumorigenic上皮MCF10A细胞的增殖,虽然增强细胞内金属的吸收是伴随着温和的细胞周期蛋白D1的过度和B1,和增加的比例减少到氧化谷胱甘肽(GSH / GSSG)。

基于我们的研究结果，我们认为正常乳腺细胞通过触发细胞周期蛋白mRNA的表达和提高内源性抗氧化剂GSH的浓度来响应细胞内铜水平的增加。反过来，增加抗氧化剂水平可以防止异常ROS的形成，这可能导致氧化应激和细胞死亡。最后，我们的发现指出，细胞周期蛋白和CDK2等参与细胞周期的蛋白是铜相互作用的新靶点。进一步深入研究其分子机制对了解铜在正常细胞中的代谢具有重要意义。我们在这里观察到，细胞内铜摄取和积累增强后，细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白B1过表达，还原性与氧化性谷胱甘肽(GSH/GSSG)的比例增加，但不产生ROS。本文的结果为Cu过量与细胞周期控制之间的分子联系以及氧化还原平衡和ROS积累的变化调节细胞增殖的机制提供了新的见解。

利益冲突

两位作者宣称没有相互竞争的经济利益。

作者的贡献

Nathália Villa dos Santos和Andreza Cândido Matias对这项工作做出了同样的贡献。

致谢

这项工作得到了São Paulo Foundation Research (FAPESP)和巴西国家技术和科学发展委员会(CNPq)的支持。

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