1。介绍
最新进展在生化工具凸显了铜在生物体的非凡的一系列功能(
1]。铜需要绑定到双特异性增殖蛋白激酶激酶1
MEK1和促进增殖作用蛋白激酶
MAPK信号和肿瘤发生v-raf小鼠肉瘤病毒致癌基因同族体B
BRAF在乳腺肿瘤(
2]。然而,尽管我们铜生物学知识的巨大扩张,发生在过去的几十年里,我们只是刚刚开始解开复杂的角色的过渡金属细胞过程和细胞周期的调控。
铜是一种重要的微量元素及其细胞内浓度是被严格控制的。细胞内铜metallochaperones和分布起着基本的作用在调节细胞生长,改变基因表达(由于氧化鸟苷和腺苷残留物在核酸或转录因子或生长因子的变化活动)(
3]。癌症的发展的一个关键因素是血管生成,从而赋予连续提供的营养,生长因子,和信号代理恶性组织(
4- - - - - -
7]。肿瘤的血管生成反应刺激血浆铜蓝蛋白、血浆Cu-carrier [
6,
8,
9]。尽管这些研究肿瘤和癌细胞强烈建议铜中扮演着重要的角色在细胞生长和增殖,对潜在的分子机制。同时,铜参与氧化还原反应,生成细胞内活性氧(ROS),主要由芬顿反应,和一些报道指出铜之间的关系,ROS生产,和癌症发展(
10,
11),最近铜代谢的作用抵抗癌细胞顺铂(
12- - - - - -
14]。细胞的氧化还原状态是影响体内平衡的活性物种,因为ROS可能作为第二信使在通路与细胞增殖相关的规定,分化和细胞凋亡
15,
16]。基于这些发现,一些研究表明,铜水平升高,增加氧化应激可用于选择性癌症治疗(
17,
18];然而,Cu-stimulation在细胞增殖的影响及其与ROS的关系需要被阐明,尤其在nontumoral细胞。
本研究的目的是阐明铜的连接与正常上皮细胞细胞周期激活和确定这种离子的机理,作为CuSO提供4,刺激乳腺上皮细胞的细胞周期
在体外。为此,铜吸收、与细胞周期调控相关基因的表达,和活性氧的水平生产和相关的氧化过程进行评估Cu-treated乳腺上皮MCF10A nontumoral细胞。
2。方法
2.1。化学物质
除非另有说明,化学物质来源于Sigma-Aldrich(美国),均为分析纯:解决方案准备使用Milli-Q水(美国Billerica微孔)。
2.2。细胞培养
手机媒体准备DNAse - 0.22, RNAse-free水和过滤
μ滤膜(美国Billerica Millex全球之声,SLGV033RS,微孔)之前使用。细胞培养使用无菌操作,一次性nonpyrogenic塑料制品,并保持在37°C的氛围中5%的股份有限公司2在空气相对湿度为80%。人类乳腺上皮细胞MCF-10A(写明ATCC)培养1:1 (v / v)的混合物杜尔贝科修改鹰的介质(Gibco DMEM, 12100046,沃尔瑟姆,美国)和火腿的F12营养混合物(Gibco HamF12, 21700 - 075年,沃尔瑟姆,美国)补充5%灭活马血清(16050 - 130,Gibco沃尔瑟姆,美国)10
μg / mL胰岛素(美国沃尔瑟姆PHC9624, Gibco), 0.020
μg / mL人类表皮生长因子(EGF、PHG0311 Gibco,沃尔瑟姆,美国),0.5
μg / mL氢化可的松(H0888,西格玛奥德里奇,圣路易斯,美国),0.10
μg / mL胆汁毒素(C8052,西格玛奥德里奇,圣路易斯,美国),100 U /毫升青霉素,100
μg / mL链霉素(P4333,西格玛奥德里奇,圣路易斯,美国)。细胞经常使胰蛋白酶化和接种到板的密度4×104细胞/厘米2。每个月,细胞培养在缺乏抗生素用于控制目的和受到常规化验使用MycoAlert支原体检测设备(美国Walkersville LT07, Lonza)。
2.3。细胞增殖检测
MCF-10A细胞孵化24-well板块在4×10的密度4cell /厘米2在上述条件下24小时的时期。整除CuSO刚做好的解决方案4分别添加到培养基(不到总量的1%),以达到最终的浓度在25.0 - -1000范围
μM,板块进一步孵化24 - 48 h。后续实验获得的结果的基础上进行了孵化细胞CuSO治疗4在最后的50浓度
μ米(
n
=
5
)和控制细胞unsupplemented媒介。通常,细胞被镀在介质的密度4×104细胞/厘米2给层的大约50 - 60%的细胞融合和培养48 h。孵化后,细胞使胰蛋白酶化,用磷酸缓冲盐(氯化钠PBS: 137毫米和2.7毫米氯化钾在10毫米磷酸盐缓冲pH值7.4),用台盼蓝染色(T8154,西格玛奥德里奇,圣路易斯,美国),并使用纽鲍尔的光学显微镜下计数室(
19]。
2.4。隔离的RNA,互补脱氧核糖核酸的合成,实时PCR
MCF10A细胞被镀和孵化CuSO的存在与否4(50
μ米,
n
=
6
)均质在1毫升试剂盒试剂(英杰公司15596 - 026年,沃尔瑟姆,美国)和总RNA提取根据制造商的协议。后用电吹风,RNA在diethylpyrocarbonate-treated resuspended水(西格玛奥德里奇DEPC, 40718年,圣路易斯,美国)从吸光度和浓度决定在260海里。残余DNA被使用DNase我(美国通用电气医疗集团生命科学E2215Y)制造商的协议。对于每一个逆转录反应,4
μ克总RNA和1
μL益生元(dT) (
11- - - - - -
17)引物(0.5
μg / gydF4y2Ba
μL;英杰公司、美国沃尔瑟姆)和孵化10分钟65°C。混合物被冷冻在冰上,混合着4
μL 5 x第一链缓冲区,2
μL 0.1德勤(美国沃尔瑟姆R0861,热科学)1
μL dATP, dTTP、dCTP dGTP(每10毫米,AM8200表达载体,沃尔瑟姆,美国),1
μL(上标三世逆转录酶(200 U;18080 - 044
,表达载体,沃尔瑟姆、美国)和无菌水20的最后一卷
μL,孵化60分钟50°C和随后的加热灭活70°C 15分钟。实时PCR进行了使用Corbett生命科学Rotor-Gene 6000热循环(试剂盒)与特定的引物对人类细胞周期蛋白D1(转发:5′-TGGGTCTGT GCATTTCTGGTT-3′,相反:5′-GCTGGAA ACATGCCGGTTAC-3′)和细胞周期蛋白B1(转发:5′-AGGAACTCGAAAATTAATGCT GAAA-3′,相反:5′-CCGTAGGAACGCGC TTTG-3′)。作为内部控制,3 -磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因表达决心与特定的引物(转发:5′-CCACCCATGGC AAATTCC-3′,相反:5′-TGGGATTTCCATT GATGACAAG-3′)。PCR检测使用以下程序进行:移行预防2分钟50°C和初始激活10分钟95°C,紧随其后的是两步骑自行车10秒钟在95°C(变性)和1分钟60°C(退火/扩展)。解离曲线PCR产品通过加热样品从60到95°C为了评估引物特异性。
2.5。PCR分析数据
目标基因的相对表达水平进行评估使用比较循环阈值方法所描述的Medhurst et al。
20.]。一个值为
C
T
确定的几何区域中检测到的荧光半对数放大图,代表了PCR循环数的荧光检测到高于任意阈值的基础上建立基线数据的可变性在第一次15周期。
2.6。固体抽样在石墨炉原子吸收光谱(石墨炉)
实验参数获得卡瓦略做Lago et al。
21)和新的开发方法与干细胞(
20.]。简而言之,一个模型ZEEnit 600(德国耶拿分析仪器公司)原子吸收光谱仪,配有横向加热石墨雾化器,逆2 -和3-field模式和横向塞曼效应背景校正器,手动取样配件,和空心阴极铜灯,是用来确定细胞内铜浓度。Pyrolytically涂层加热石墨管和Pyrolytically涂布boat-type固体采样平台了。氩(99.998% v / v;液化空气集团、Maua Brasil)作为保护和净化气体。所有测量是基于集成的吸光度值获得的帮助下Windows NT软件。
2.7。铜含量的测定培养的细胞
MCF10A细胞被镀和孵化CuSO的存在与否4(50.0
μ米)如上所述使胰蛋白酶化和贴壁细胞的总和,与磷酸盐缓冲盐水洗五次(PBS: 2.7毫米137毫米氯化钠和氯化钾在10毫米磷酸盐缓冲pH值7.4)包含1.0毫米EDTA为了消除残余铜(II)、干燥器干燥1周。实验一式三份或五倍的使用的表面积75或150厘米2。对石墨炉测定铜、程序从卡瓦略Lago et al。(
21]。
2.8。提取的核
核MCF10A细胞孵化的CuSO的存在与否4(50.0
μ米)如上所述分离使用出版的过程(
22,
23]。简单地说,细胞接种密度的4×104cell /厘米2到文化瓶包含适当的媒介(150厘米2文化的表面积)和孵化48小时37°C的氛围中5%的股份有限公司2在空气相对湿度为80%。实验一式四份。孵化后,细胞使胰蛋白酶化和贴壁细胞结合,用PBS洗净、离心机(250 - 300 g×10分钟4°C)和颗粒在2毫升的裂解缓冲(resuspended MgCl氯化钠10毫米,3毫米2,0.5% Tergitol NP-40在10毫米三羟甲基氨基甲烷缓冲液pH值7.5)和留在冰5分钟。细胞随后离心机(500×g, 5分钟,4°C)和颗粒resuspended 2毫升的裂解缓冲和recentrifuged。颗粒从第二个离心(包含提取核)在烤箱干30°C,随后分析了石墨炉。核中提取的纯度测定免疫印迹分析使用兔子antihistone H3 n端和兔子反铜/锌SOD1的多克隆抗体。
2.9。代的细胞内活性氧
MCF10A细胞被镀和孵化CuSO的存在与否4(50.0
μ米)治疗与胰蛋白酶/ EDTA (Gibco 1毫米,25200 - 056年,沃尔瑟姆,美国)的解决方案,与PBS洗了三次,悬浮在50.0
μ米的解决方案
oxidation-sensitivenonfluorescent探针2′,7′二乙酸-dichlorodihydrofluorescein (DCFH D6883,西格玛奥德里奇,圣路易斯,美国)(
24,
25]。在37°C孵化后45分钟(
19),这些细胞被洗了三次PBS和胞内荧光测定的水平立即通过流式细胞术在530海里使用Cytomics FC 500 MPL(贝克曼库尔特)仪器
26,
27]。化验进行至少一式五份,> 20000可行的细胞从每个样本进行了分析测定,在任意单位的荧光。
2.10。测定谷胱甘肽(GSSG比率
MCF10A细胞被镀和孵化CuSO的存在与否4(50.0
μ米)如上所述使胰蛋白酶化和贴壁细胞的总和,与冷PBS洗了三次,离心机(1500×g, 3分钟,4°C)。这些细胞被resuspended在400年
μL冷水和细胞溶解的冻结在干冰和乙醇的混合10分钟。解冻后,蛋白质沉淀了100年
μL 10%磺基水杨酸(西格玛奥德里奇,390275年圣路易斯,美国)和离心机(4000×g 5分钟4°C)。蛋白质浓度颗粒决定,谷胱甘肽的水平和GSSG上层的评估使用马丁的协议等。
28]。谷胱甘肽量化,分析混合物含有100
μL(浮层,790年
μL 0.1钠磷酸盐缓冲剂的含有0.05% EDTA在pH值为7.0,100年
μL 5 6毫米,5′-dithiobis (2-nitrobenzoic酸)(DTNB D8130,西格玛奥德里奇,圣路易斯,美国)溶解在谷胱甘肽测定缓冲区(唠叨;包含6.3毫米125毫米磷酸钠EDTA),和10
μL谷胱甘肽还原酶(55 U /毫升,G3664西格玛奥德里奇,圣路易斯,美国)。100年GSSG量化,分析混合组成
μL(浮层,190年
μL 0.5磷酸盐缓冲剂的pH值6.8,700
μ0.3毫米NADPH的L (N5130,西格玛奥德里奇,圣路易斯,美国),准备在唠叨,10
μL(谷胱甘肽还原酶(55 U /毫升)。吸光度的变化的反应速率估计在412 nm 3分钟后在25°C(谷胱甘肽)或340海里后16分钟30°C (GSSG) (
28- - - - - -
30.]。谷胱甘肽参考标准测量的准确性DTNB (D8130,西格玛奥德里奇,圣路易斯,美国),使用13600的吸光度的摩尔消光系数412海里(
31日]。GSSG被测量标准化的衰落NADPH在谷胱甘肽还原酶的存在,考虑NADPH的摩尔消光系数在340 nm和6270 1摩尔的NADPH转换1摩尔GSSG 2摩尔谷胱甘肽(
32]。
2.11。免疫印迹分析
MCF10A细胞被镀和孵化CuSO的存在与否4(50.0
μ米)如上所述治疗与胰蛋白酶/ EDTA (Gibco 1毫米,25200 - 056年,沃尔瑟姆,美国)的解决方案,与PBS洗了三次,150年resuspended
μL•瑞帕缓冲区(150毫米氯化钠5毫米EDTA 1毫米二硫苏糖醇,1% Triton x - 100 (X100,西格玛奥德里奇,圣路易斯,美国),0.5%钠脱氧胆酸盐(西格玛奥德里奇,30970年圣路易斯,美国),和0.1% SDS (L3771,西格玛奥德里奇,圣路易斯,美国)在50 mM三pH值7.5)含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒对哺乳动物细胞(P8340,西格玛奥德里奇,圣路易斯,美国),和离心机(14000 g×20分钟)。上层清液和颗粒转移到埃普多夫管和储存在−80°C,直到被要求进行分析。蛋白质浓度测定根据洛瑞的方法(
33]使用牛血清白蛋白(A2153,西格玛奥德里奇,圣路易斯,美国)作为标准,提取和sds - page和在硝化纤维膜涂抹(10600001,通用电气医疗集团生命科学,纽约,美国)与相同加载的蛋白质被内部质量控制的印迹证实
α微管蛋白(T9026西格玛奥德里奇,圣路易斯,美国)。膜被封锁在屏蔽解决方案包括1小时5% nonfat-dried牛奶(美国圣路易斯M7409,西格玛奥德里奇)和0.0025%的叠氮化钠(V000494,西格玛奥德里奇,圣路易斯,美国)的可溶性TBS-T(150毫米氯化钠,50毫米三羟甲基氨基甲烷在液pH值7.5和0.05% Tween-20)和TBS-T洗两次。抗体的主要工作是鼠标anticyclin依赖激酶2 (anti-CDK2克隆意思是P9OH-1 sc - 51578;圣克鲁斯生物技术、德国海德堡)和鼠标反
α微管蛋白(DM1A;圣克鲁斯生物技术、德国海德堡)单克隆抗体或兔子antihistone H3 n端(H0164,西格玛奥德里奇,圣路易斯,美国)和兔反铜/锌超氧化物歧化酶1(美国Billerica AB5480,微孔)多克隆抗体。后形成的特定的蛋白质复合物治疗与特定的二级抗体(anti-mouse或anti-rabbit IgG-peroxidase共轭,A4416或A0545西格玛奥德里奇,圣路易斯,美国)被发现使用西方SuperSignal Pico化学发光底物(34080年,热科学、沃尔瑟姆,美国)。
2.12。统计分析
所有的实验都重复至少5次(除注明),结果表示为平均值±标准差。方差分析(方差分析)Bonferroni调整被用来评估之间的差异显著性水平为手段
p
<
0.05
。实时PCR实验值获得每个细胞谱系都进入到一个双向方差分析随着时间因素和治疗,和两两比较进行使用图基HSD测试设置的意义
p
<
0.05
。
3所示。结果
3.1。生存能力< inline-formula > < mml:数学xmlns: mml = " http://www.w3.org/1998/Math/MathML " id = " M6 " > < mml: mrow > < mml: mi > e < / mml: mi > < / mml: mrow > < / mml:数学> < / inline-formula >测试和测量细胞内铜水平
铜的影响异常的nontumor线MCF10A最初使用台盼蓝排斥试验评估。浓度的基础上研究(图
1),扩散MCF10A没有观察到浓度高于75.0
μM CuSO4经过24小时的潜伏期(图
1(一)),但细胞生存能力显著降低后48小时(图
1 (b))当铜水平等于或大于200.0
μm .我们没有观察到不同的细胞增殖和细胞死亡当比较治疗和治疗细胞24小时后,
10.83
±
0.14
×
10
5
可行的细胞/毫升
与
11.91
±
0.76
(
p
=
7.32
×
10
- - - - - -
2
)25
μM Cu,或
与
11
。
50
±
0.43
(
p
=
6.46
×
10
- - - - - -
2
)50
μM Cu,或
与
12
。
83年
±
0.76
(
p
=
61.12
×
10
- - - - - -
2
)75年
μM Cu,或
与
11
。
83年
±
0.38
(
p
=
1.32
×
10
- - - - - -
2
)100年
μM Cu,或
与
12
。
75年
±
0.43
(
p
=
1.19
×
10
- - - - - -
3
)200年
μM Cu,或
与
11.67
±
1.15
(
p
=
2.82
×
10
- - - - - -
1
)1000年
μM Cu(图
1(一))。类似铜孵化的48小时内我们没有观察细胞增殖的差异或细胞死亡细胞,当比较治疗和治疗
17.33
±
1.37
×
10
5
可行的细胞/毫升
与
16.08
±
0.76
(
p
=
2.41
×
10
- - - - - -
1
)25
μM Cu,或
与
16
。
25
±
0.91
(
p
=
3.17
×
10
- - - - - -
1
)50
μM Cu,或
与
17
。
33
±
1.28
(
p
=
1
)75年
μM Cu,或
与
15
。
83年
±
1.89
(
p
=
3.29
×
10
- - - - - -
1
)100年
μM Cu,或
与
11
。
83年
±
0.80
(
p
=
3.94
×
10
- - - - - -
3
)200年
μM Cu,或
与
10.25
±
0.75
(
p
=
1.44
×
10
- - - - - -
3
)1000年
μM Cu(图
1 (b))。由于对MCF10A nonproliferative影响,50.0的浓度
μM CuSO4选择在整个研究。
铜治疗和上皮MCF10A细胞的增殖。与CuSO MCF10A细胞治疗424小时(a)和(b) 48小时内,而未经处理的细胞被用作控制。可行的细胞数与锥虫蓝染色后。数据代表平均值±标准偏差(
n
=
5
)。Cu-treated和未经处理的细胞之间的显著差异是由星号表示(
p
∗
<
0.05
)。
![]()
![]()
的铜吸收介质与CuSO补充4被置于整个评估干MCF10A细胞GFAA [
34]。有趣的是,MCF10A细胞内化铜(II)。当控制相比,细胞孵化与50
μ米的CuSO4显示较高的铜(II)水平4小时后,
3.07
±
0.10
μg / g
与
16.76
±
1.63
μg / g (
p
=
1.51
×
10
3
),分别(图
2(一个))。12小时后,未经处理的差异和治疗细胞增加,考虑到各自的价值观
2.91
±
0.14
μg / g
与
29.61
±
2.46
μg / g (
p
=
1.99
×
10
- - - - - -
4
,图
2(一个))。我们也观察到细胞内铜浓度的差异相比治疗和治疗细胞24小时后,
5.36
±
0.13
μg / g
与
83.73
±
2.89
(
p
=
4.61
×
10
- - - - - -
5
),48小时
4.76
±
0.09
μg / g
与
275.12
±
15.62
(
p
=
5.03
×
10
- - - - - -
4
),分别(图
2(一个))。之后,细胞核被孤立的处理和未经处理的细胞和净化被测量的相对数量只核蛋白质组蛋白H3和主要胞质蛋白免疫印迹(图草皮
2 (b))。毕竟这些程序,利用透露,事实上铜进入MCF10A核,基于铜浓度的值确定的核控制和处理细胞,
2.36
±
0.20
μg / g
与
14.55
±
3.01
μg / g (
p
=
6.03
×
10
- - - - - -
3
,图
2 (c))。
铜的吸收时,由固体sampling-graphite炉原子吸收光谱法。(a)浓度在整个细胞中铜的MCF10A处理50
μM CuSO4未经处理的细胞,在48小时的时期。当控制相比,细胞孵化与50
μ米的CuSO4显示较高的铜(II)水平4后,24和48小时。(b)细胞核提取的纯度nontumor MCF10A细胞被免疫印迹分析验证。兔子antihistone H3 n端和兔反铜/ Zn-superoxide歧化酶1多克隆抗体被用来检测相应的蛋白质的胞质及核分数。(c)中的铜浓度控制和细胞的核处理50
μM CuSO448小时后。Cu-treated和未经处理的细胞之间的显著差异是由星号表示(
p
∗
<
0.01
,
p
∗
∗
<
0.001
)。
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![]()
![]()
3.2。细胞周期蛋白D1的实时PCR分析,在上皮细胞系MCF10A B1
为了评估的机制铜(II)盐在人类上皮细胞刺激细胞增殖,我们调查了监管的基因参与细胞周期进程。特定的引物设计和可靠性验证的基础上放大块用连续稀释cDNA(1, 1/3, 1/9, 1/27),线性回归分析,离解融化曲线。通过这些过程,我们验证特定的引物为人类细胞周期蛋白D1(数据而设计的
3(一个)- - - - - -
3 (c))和细胞周期蛋白B1(数字
3 (d)- - - - - -
3 (f)GAPDH)以及(数字
3 (g)- - - - - -
3(我))作为内部控制。实时PCR表明MCF10A细胞接触到50
μ米的CuSO4感应触发upregulation的细胞周期蛋白D1(0.297倍;23%;
p
=
1.31
×
10
- - - - - -
2
,图
3 (j))和细胞周期蛋白B1(1.236倍感应;136%;
p
=
2.96
×
10
- - - - - -
6
,图
3 (k)48小时后)基因表达。西方的屁股获得使用鼠标anticyclin依赖激酶2 (anti-CDK2)和鼠标反
α微管蛋白(内部标准)作为主要抗体显示CDK2表达水平调节MCF10A在存在铜后48小时(图
4)。
实时PCR显示铜刺激温和upregulation MCF10A细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白B1基因的细胞。细胞周期蛋白基因的表达在细胞治疗50
μM CuSO4。结果绘制和规范化对各自的未经处理的细胞。的特异性引物对人类3 -磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH),细胞周期蛋白D1,细胞周期蛋白B1被实时PCR验证。放大图、线性回归和离解融化曲线(a - c)细胞周期蛋白D1, (d-f)细胞周期蛋白B1, (g-h) GAPDH获得连续稀释的cDNA (1, 1/3, 1/9, 1/27)。(j)表达的细胞周期蛋白D1 Cu-treated MCF10A细胞。未经处理的和Cu-treated细胞之间的显著差异是由星号表示(
p
∗
<
0.05
,
p
∗
∗
<
0.001
)。
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免疫印迹显示,细胞周期蛋白依赖性激酶2的表达水平(CDK2)是调节在铜暴露MCF10A细胞。(一)CDK2蛋白质含量在细胞治疗50
μM CuSO4和比较
α微管蛋白(代表西方的屁股
n
=
3
)。100年,在每个时间点
μg细胞总蛋白质的溶解产物被加载到每个车道CDK2的检测。
α微管蛋白作为加载控制,每个车道的微(表示为酒吧)计算使用图像软件。(b)相比,控制,治疗后细胞显示增强CDK2水平12小时。数据表示为任意单位和代表的平均数±标准差
n
=
3
独立的实验中,
p
∗
∗
<
0.001
。
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![]()
3.3。分析了正常MCF10A细胞ROS的生成
细胞内活性氧的生成,在形式的过氧化氢和oxygen-derived碳酸羟基和自由基,通过细胞被暴露于铜(II)估计使用membrane-permeable nonfluorescent细胞探针DCFH,在氧化形式(2′,7′二氯荧光黄;贴现是荧光
26,
35- - - - - -
37]。图
5(一个)显示了DCF荧光变化,流式细胞仪测量520海里,在接触DCFH-treated MCF10细胞到50
μM CuSO4。早在6个小时,在未经处理的MCF10A细胞荧光强度明显高于观察相比,铜(II)处理细胞,
69.85
±
5.40
%
与
42.62
±
2.79
% (
p
=
1.09
×
10
- - - - - -
4
)。我们还观察到荧光强度下降比较控制细胞治疗后12小时,
71.57
±
1.86
%
与
35.75
±
2.55
% (
p
=
4.81
×
10
- - - - - -
7
),以及24小时后,
82.60
±
4.02
%
与
42.67
±
1.73
% (
p
=
1.74
×
10
- - - - - -
6
)。荧光强度的变化之间的控制和治疗细胞持续48小时后,
86.20
±
1.79
%
与
45.25
±
1.40
% (
p
=
3.05
×
10
- - - - - -
8
),分别(图
5 (b))。
Cu-treated MCF10A少细胞产生活性氧(ROS)比未经处理的同行。细胞内活性氧的生成,细胞暴露于铜(II)、估计使用membrane-permeable nonfluorescent细胞探针DCFH。(a)图代表的典型分布细胞的数量根据DCF的水平,控制和治疗细胞引起50的
μM CuSO4在特定的时间点,由流式细胞术。(b)相比,控制,治疗细胞显示DCF水平降低6小时后,12小时、24小时、48小时。未经处理的和Cu-treated细胞之间的显著差异是由星号表示(
p
∗
<
0.01
)。
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3.4。量化的细胞内谷胱甘肽的水平
为了澄清的影响铜入口MCF10A细胞,细胞中的谷胱甘肽(GSSG比率一直暴露在铜(II) 48小时测定所显示Estrela et al。
38]。我们测量的总谷胱甘肽在细胞水平,确保这个内源性抗氧化剂的水平并没有改变在铜治疗。控制和Cu-treated细胞表现出谷胱甘肽的总体水平
7.35
±
0.76
和
8.19
±
0.21
(
p
=
0.1375
),分别表示没有显著的变化总谷胱甘肽(GSSG谷胱甘肽+,图
6(一))。细胞的MCF10A孵化控制介质上48小时内谷胱甘肽(GSSG比展出
3.20
±
0.05
(图
6 (b))。包含CuSO4在中增加
5.72
±
0.86
(
p
=
0.00896
谷胱甘肽(GSSG比率。
铜治疗改变MCF10A细胞的氧化还原电势。(一)总谷胱甘肽在控制和50
μM CuSO4细胞治疗后48小时的潜伏期。(b)的比例减少到氧化谷胱甘肽(GSH / GSSG) 48小时后的孵化。未经处理的和Cu-treated细胞之间的显著差异是由星号表示(
p
∗
<
0.01
)。
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4所示。讨论
铜配合物能诱导细胞凋亡在肿瘤细胞细胞器的破坏(
19,
39,
40),而这一过程可能会产生误解的自由金属过剩的实际效果正常细胞的细胞周期。在目前的研究中,培养基与自由盐CuSO补充4为了研究自由的影响细胞内铜正常上皮MCF10A细胞的增殖
在体外。的具体选择免费的铜离子和它的浓度是基于最近报道的结果卡瓦略Lago et al。(
21]。同时,恶性肿瘤细胞通常具有氧化物种的含量增加,自然有助于增强细胞凋亡(
41的氧化剂水平较低),而良性的MCF10A应该有助于抵抗Cu-stimulated细胞死亡。
通过细胞周期的不同阶段发展是由特定的细胞周期蛋白和CDKs的组合。以外的细胞周期蛋白和CDKs可以参与过程的细胞增殖,报道为代表的细胞周期蛋白的表达和细胞周期之间的联系再入导致氧化应激引发的细胞凋亡在神经变性过程(
42]。
在目前的研究中,正常MCF10A细胞细胞周期蛋白D1和B1显示轻微upregulation铜。有趣的是,我们观察到细胞周期蛋白B1是调节内部的铜浓度超过100
μg / g细胞,细胞周期蛋白D1调节铜浓度范围内时150−275
μg / g细胞。MCF10A细胞允许进入内部的铜等金属的浓度足够引起细胞周期蛋白mRNA的特定upregulation水平升高。事实上,铜是MCF10A的细胞核中发现,表明这种离子可能引起基因表达的变化,包括与细胞周期进展有关。恶性肿瘤细胞通常具有氧化物种的含量增加,自然有助于增强扩散(
41的氧化剂水平较低),而良性的MCF10A应该有助于抵抗Cu-stimulated我们观察细胞增殖。
氧化还原循环控制哺乳动物细胞周期的概念通过细胞内抗氧化的调制/氧化剂物种,特别是thiol-containing分子如谷胱甘肽,在文献中已经收到多考虑(审查
15])。在癌细胞中,谷胱甘肽(GSSG比率已被证明影响细胞周期的规定,诱变机制、DNA合成、增长、和耐多药和辐射电阻,谷胱甘肽水平通常高于肿瘤组织与正常组织相比(
38,
43]。在目前的研究中,我们观察到内化的铜、CuSO治疗引起的4,减少ROS水平和增加了谷胱甘肽(GSSG比率。铜电阻也一直观察癌症铂耐药(
44]。的铜(II)溶于肿瘤哺乳动物细胞MCF7导致细胞的增殖明显增加由于铜吸收和扰动的氧化还原状态
45]。
如果我们比较细胞增殖的程度,与细胞周期调控相关基因的表达,和活性氧的水平生产和相关的氧化过程,与等效copper-treated乳腺上皮细胞系代谢率,即肿瘤细胞MCF7 [
45)和上皮MCF10A nontumor细胞,我们可以观察到不同细胞之间的行为。观察到copper-stimulated肿瘤细胞扩散并不是与细胞周期蛋白upregulation或增加胞质浓度的金属,而是与增强活性氧产生和脂质过氧化水平升高,这一改变地形的细胞膜(
45]。相比之下,我们观察到在这个工作,铜不刺激nontumorigenic上皮MCF10A细胞的增殖,虽然增强细胞内金属的吸收是伴随着温和的细胞周期蛋白D1的过度和B1,和增加的比例减少到氧化谷胱甘肽(GSH / GSSG)。
基于我们的研究结果,我们建议正常乳腺细胞响应水平的提高细胞内铜通过触发细胞周期蛋白mRNA表达和提高内源性抗氧化剂谷胱甘肽的浓度。反过来,增加水平的抗氧化剂防止异常活性氧的形成,这可能导致氧化应激和细胞死亡。最后,我们的结果指向蛋白参与细胞周期细胞周期蛋白和CDK2作为小说如铜相互作用的目标。更详细的调查对于我们理解其分子机制将重要铜代谢的正常细胞。我们观察到,增强细胞内铜的吸收和积累是紧随其后的是超表达的细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白B1,增加的比率降低到氧化谷胱甘肽(GSH / GSSG),但是没有ROS生产。文中给出的结果提供新的见解的分子之间的联系铜过剩和细胞周期的控制,因此,氧化还原平衡变化的机理和活性氧积累调节细胞增殖。