N-[3-(Aminomethyl)benzyl]acetamidine (1400 W) as a Potential Immunomodulatory Agent

抽象的

本研究旨在研究NO、IL-12和TNF-之间的关系α.J774A.1的生产用LPS和IFN激活巨噬细胞γ.在N-[3-(氨甲基)苄基]乙脒(1400w)存在下。1400w是一种新型的高选择性诱导型一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, iNOS)抑制剂。我们将得到的数据与N^G-单甲基- l-精氨酸(L-NMMA)(非选择性NOS抑制剂)和L-N^G- （1-咪啶乙基）赖氨酸（L-NIL）（L-NIL）（INOS活性的相对选择性抑制剂）在该模型中的细胞上。调查外源性NO对IL-12和TNF的参与α.生产我们没有任何供体-S-亚硝基替肽（S-No-Cap）。最有效的不代的抑制剂为1400W。该化合物还显着增加IL-12 P40分泌并降低TNF-α.释放。L-NIL同时抑制NO和TNF-α.生产，但它没有改变IL-12 P40合成。L-NMMA对不代产生的影响比其他抑制剂较弱。而且，它减少了tnf-α.分泌略微但没有显着。IL-12 P40通过S-NO-帽以剂量依赖性方式抑制刺激细胞的产生，但对TNF的影响没有影响α.释放被观察到。1400w作为iNOS抑制剂和细胞因子释放修饰剂的潜力和选择性鼓励了治疗用途。

1.介绍

细胞因子是低分子量多肽，其引发炎症反应并定义所获得的免疫应答的幅度和性质。白细胞介素12（IL-12），肿瘤坏死因子α（TNF-α.）和干扰素γ（IFN-γ.）是三种炎症介质，对细胞因子平衡和免疫应答类型产生重大影响。此外，一氧化氮（NO）似乎参与了该调节[1，2]．IL-12（由两个亚基组成的异二聚体：p35和p40）诱导T辅助术（Th0）至Th1表型的承诺[3.，4]．没有建议抑制IL-12转录并充当关于Th1细胞发展的负反馈[5]．也tnf-α.似乎是从人​​巨噬细胞IL-12 p40的分泌的特异性抑制剂[6]．

IL-12，TNF-α.并且在激活各种免疫刺激后，巨噬细胞（如脂多糖（LPS）和细胞因子）在激活后，否则不会产生和释放。从L-精氨酸通过酶 - 没有合成酶（NOS）合成，其是组成型（内皮 - eNOS和神经元-NOS）或通过细菌产物和细胞因子诱导（INOS）[7，8]．高输出未激活巨噬细胞的产生是Inos表达的结果[9，10.]．已知几种NoS抑制剂;其中大多数是底物L-精氨酸的类似物[11.]．保存生理学重要的NoS功能可能需要使用同种型选择性抑制剂。N- [3-（氨基甲基）苄基]乙酰氨基（1400W）是慢性，紧密的结合和INOS的高选择性抑制剂[12.，13.]．

本研究的目的是探讨NO、IL-12和TNF-之间的关系α.J774A.1的生产用LPS和IFN激活巨噬细胞γ.在1400w的存在。我们将得到的数据与N^G-单甲基- l-精氨酸(L-NMMA)(非选择性NOS抑制剂)和L-N^G- （1-咪啶乙基）赖氨酸（L-NIL）（L-NIL）（INOS活性的相对选择性抑制剂）在该模型中的细胞上。调查外源性NO对IL-12和TNF的参与α.生产我们没有任何供体-S-亚硝基替肽（S-No-Cap）。

J774A.1细胞系用于我们的研究中，因为这种细胞是一种广泛使用的有用模型，用于研究一氧化氮（NO）合成的过程。在J774A.1中，单核细胞 - 巨噬细胞线没有产生LPS和IFN的存在显着增加γ.，或单独使用LPS [14.- - - - - -17.]．

2。材料和方法

2．1.试剂

1400 W，L-NIL，L-NMMA和S-No-Cap购自Calbiochem-Novabiochem Corporation（La Jolla，CA，USA）。LPS大肠杆菌血清型O127：B8和台盼蓝购自Sigma Chemical Company（美国圣路易斯，美国，美国）。重组鼠标IFN-γ.是从Genzyme Corporation（剑桥，马，美国）获得的。

2.2。细胞培养

小鼠巨噬细胞系J774A.1是从Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen und Zellkulturen（Braunschweig，德国）获得的。将细胞保持在5％CO的气氛中₂，在37°C的RPMI 1640媒体（Biowhittaker，MD，USA）补充有10％胎牛血清，2mM谷氨酰胺，100u / ml青霉素和100 μ.G / ml链霉素（Gibco BRL Life Technologies，佩斯利，英国）。将细胞在50cm中培养²塑料烧瓶（Nunc A / S，Roskilde，丹麦）。对于实验，细胞通过剧烈的移液而分离，并在离心后悬浮在新鲜培养基中。密度为1×10的巨噬细胞⁶ cells/mL were activated with a combination of LPS (100 ng/mL) and IFN-γ.（25 u / ml）18小时。孵育在iNOS抑制剂或S-NO-CAP的存在或不存在的24孔板（Nunc A / S，罗斯基勒，丹麦）来进行。

２.３.NO Generation by Stimulated J774A.1巨噬细胞

亚硝酸盐浓度作为否的稳定最终产物通过如前所述的比色GRIESS方法测量[18.]．简要介绍相同的细胞培养上清液和GRIESS试剂（0.5％磺胺胺，0.05％条目 - 酰胺二盐酸盐，在2.5％H中_3.宝₄)混合，室温孵育10 min。采用自动酶标仪Elx800 (BIO-TEK Instruments Inc.， Winooski, VT, USA)在550 nm处测定吸光度值。作为标准，亚硝酸钠被使用。数据表示为μ.每10米硝酸盐⁶细胞最初镀。

2.4。IL-12 P40生产

使用夹心ELISA在培养细胞上清液的细胞因子研究的浓度进行定量。小鼠IL-12 p40的免疫测定试剂盒，从R＆d系统（明尼阿波利斯，MN，USA）购买。ELISA用抗小鼠IL-12的p40随后四甲基联苯胺底物的辣根过氧化物酶缀合的抗体开发。The absorbance was read on a microplate reader Elx800 (BIO-TEK Instruments Inc., Winooski, VT, USA) at 450 nm. Recombinant murine IL-12 was used as a standard. This assay has a sensitivity of detection <4 pg/mL.

2.5。肿瘤坏死因子-α.生产

免疫反应性TNF-α.使用重组小鼠TNF的双抗体ELISA试剂盒估计细胞培养上清液中估计α.作为标准（R＆d系统，明尼阿波利斯，MN，USA），按照制造商的方案。The absorbance values were measured at 450 nm using the microplate reader Elx800 (BIO-TEK Instruments Inc., Winooski, VT, USA). The sensitivity of the assay was <5.1 pg/mL.

2.6。细胞活力的测定

细胞存活力通过台盼蓝染料排除法测定，并通过测量使用细胞毒性检测试剂盒（Boehringer Mannheim公司，曼海姆，德国）的胞质酶乳酸脱氢酶（LDH）的细胞泄漏生化评估。测量细胞培养上清液中的LDH活性作为由于NADH氧化而消耗的丙酮酸的量。使用微孔板读卡器ELX800（Bio-Tek Instruments Inc.，Winooski，VT，USA），在490nm处测定吸光度值。

2.7。的统计分析

在我们的研究中，每个实验都是用四份效果进行的，因为两份进行的两个独立实验（在每组中）。结果呈现为算术平均值和中位数。群体之间的统计差异是通过分析差异，然后是未配对的学生的差异确定t-测试和曼-惠特尼U测试，取决于结果与正态分布的相关性。平均值之间的差异被认为是有统计学意义的．统计数据第10版软件（Statsoft，Cracow，Poland）用于执行统计分析。

3.结果

通过台台蓝染色(数据未显示)和乳酸脱氢酶释放(图)测定，在所有进行的实验中，细胞活力均大于92%1）。在细胞培养物上清中的亚硝酸积累用于估计NO生成。亚硝酸盐，IL-12的p40和TNFα.在18小时后用LPS（100ng / ml）和IFN-的刺激后确定水平γ.（25u / ml）在InOS抑制剂的存在或不存在（对照）中。

未刺激的巨噬细胞释放的亚硝酸盐一个小但可检测量（μ.m），IL-12 P40（pg / mL)和肿瘤坏死因子-α.（ pg/mL) during 18 h incubation (data not shown). Upon activation cells producedμ.亚硝酸盐， pg/mL of IL-12 p40, and肿瘤坏死因子- pg / mLα.．

在接下来的实验中S-NO-CAP进行了研究其在细胞因子分泌的参与（图2）。没有产生200 μ.S-NO-第M个显著增加IL-12的p40和TNF-α.由未受刺激的细胞产生(和，resp。）。较低剂量的S-NO帽（50 μ.m）仅受到TNF-α.释放 （）。如所预期的，IL-12 p40的生产通过刺激细胞是强烈S-NO-CAP抑制，但对TNF-α无影响α.释放被观察到。

InOS抑制剂对NO，IL-12 P40和TNF-的影响α.通过激活的J774A.1生产巨噬细胞如图所示3.．用LPS（100ng / ml）和IFN-刺激细胞γ.（25u / ml）在1400 w的存在或缺席（控制）中的18小时（50 μ.m），l-nil（50 μ.m）或l-nmma（100 μ.m）。最有效的不代精抑制剂是1400 w（控制，）。该化合物也显着增加了IL-12 P40分泌（控制，)， TNF-降低α.释放 （控制，）。L-NIL同时抑制NO和TNF-α.生产，但它没有改变IL-12 P40合成。L-NMMA对不代产生的影响比其他抑制剂较弱。而且，它减少了tnf-α.分泌略(控制）但没有显着。

4。讨论

4.1。外源性NO的影响

在本研究中，一种外源性NO(由S-NO-Cap产生)影响巨噬细胞释放细胞因子。它显著抑制LPS/IFN-产生IL-12γ.诱导J774A.1巨噬细胞，这与Huang等人一致。的报告[5]，其中s -亚硝基-n -乙酰青霉胺产生的NO抑制IL-12蛋白的产生和IL-12 p40 mRNA的表达。NO没有改变TNF-α.在我们的受刺激细胞模型中合成。早些时候有报道说NO可能会增强[19.]并衰减TNF-α.生产 [20.]在不同的细胞系。更多的over, we showed that treatment of unstimulated J774A.1 cells with NO donor resulted in the increase of the basal levels of IL-12 and TNF-α.．NO通过抑制IL-12合成的反馈机制控制Th1细胞的发育[5]．我们的结果携带，证实了NO对细胞因子释放的调节效果。

4.2。NOS抑制剂的影响

个体NOS同种型的过度表达在各种疾病中起作用，包括脓肌休克，关节炎，哮喘，糖尿病，缺血再灌注损伤以及各种神经退行性疾病[8，9，21.]．在考虑其表达操纵时，需要了解各种同种型的物理位置和功能。不幸的是，非选择性NOS抑制剂也灭活了组成型同种型，其给药可能导致血压的显着和持续增加。

J774A.1的巨噬细胞没有生产主要归因于诱导诱导的合酶（INOS）活性，其由炎性细胞因子或细菌产品（如LPS）诱导。INOS已成为可靠的生物标志物，用于完全活化的巨噬细胞，而关于内皮（eNOS）和神经元（NNOS）和神经元（NNOS）一氧化氮合酶在巨噬细胞激活中的信息有限的信息是有限的[22.]．

1400w对细胞新型NOS抑制剂无毒，是迄今为止描述的最具选择性的iNOS亚型抑制剂[11.，12.，23.]．它分别比eNOS和NNO在纯化的人Inos in纯化的人Inos大于5000倍和200倍。12.]．用1400W在伊索尼亚的有效剂量治疗没有对基础全身血压的影响或加剧LPS对血管泄漏的早期效果，而用非选择性抑制剂N-NITRO-L-精氨酸甲酯（L-NAME）的处理引起的血压显着增加和早期血管泄漏的加剧[24.]．A beneficial action of 1400 W on the colonic injury using an experimental model of colitis in rats has been reported [25.，26.]．1400w治疗可减少中性粒细胞浸润、水肿形成和诱导急性结肠炎的急性炎症损伤[25.]．在lps引起的大鼠结肠血管损伤模型中，它是一种有效的抑制剂(比L-NMMA强150倍)[12.，24.]．L-NIL是一种相对选择性的iNOS抑制剂，可抑制血浆亚硝酸盐水平的增加和佐剂性关节炎相关的联合炎症。在剂量时观察到抑制作用，但似乎没有抑制eNOS，这是由对全身血压缺乏影响决定的[27.]．L-Nil比L-NMMA更有效地抑制完整的巨噬细胞抑制亚硝酸盐积累[28.]．Ruetten等人。表明Inos活性的选择性抑制剂可能会衰减由大鼠内毒血症引起的肝脏和胰腺功能障碍[29.]．

相当的证据表明，1400 W发挥抗炎活动，它与其抑制不代代的能力有关。另外，该抑制剂可以通过施容来改变宿主免疫应答的其他介质产生。事实上，我们表明1400 W减少了TNF-α.释放。肿瘤坏死因子-α.是一种原则促炎细胞因子，负责细胞内的各种信号传导事件，导致坏死或细胞凋亡。它产生发烧，炎症，组织破坏，和（在某些情况下）休克和死亡[30.]．更多的over, 1400 W potently increased a secretion of p40 subunit of IL-12. Interestingly, a p40 homodimer may function as an IL-12 antagonist by binding to the IL-12 receptor, but not by mediating a biologic response [31.]．抑制NO生成的能力为1400w > L-NIL > L-NMMA，而IL-12 p40和TNF-均无抑制作用α.生产遵循这种模式。这可能是因为过量的内源性NO干扰了IL-12的产生。例如，Suzuki等人[13.] suggest that IL-12 production in stimulated J774A.1 cells inhibited by 1400 W could be increased by limiting endogenous NO production.

1400w作为iNOS抑制剂和细胞因子释放修饰剂的潜力和选择性鼓励了治疗用途。然而，设计适当的干预策略还需要进一步的研究体外和体内．

利益冲突

提交人声明没有关于本文的出版物的利益冲突。

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