N碘化-n-Butyl氟哌啶醇改善心肌细胞缺氧/复氧损伤细胞外Calcium-Dependent和独立的机制

文摘

N-n-butyl氟哌啶醇碘(F₂)已被证明能够对抗心肌缺血/再灌注损伤通过阻断钙通道。本研究探讨ERK通路的生物功能的心肌细胞缺氧/复氧损伤的机制并澄清F₂改善心肌细胞缺氧/复氧损伤通过extracellular-calcium-dependent和独立ERK1/2-related通路。在extracellularcalcium-containing缺氧/复氧心肌细胞PKCα和ERK1/2被激活,Egr-1蛋白质水平和cTnI泄漏增加,和细胞生存能力下降。ERK1/2抑制剂抑制extracellular-calcium-containing-hypoxia / reoxygenation-induced Egr-1过度和心肌细胞损伤。PKCα抑制剂下调extracellularcalcium-containing-hypoxia / reoxygenation-induced p-ERK1/2和Egr-1表达式。F₂表达下调缺氧/ reoxygenation-induced p-PKC高程α、p-ERK1/2 Egr-1表达和抑制心肌细胞损伤。ERK1/2和PKCα催化剂与F₂的效果。ERK1/2 extracellular-calcium-free-hypoxia /复氧心肌细胞,激活,LDH和cTnI泄漏增加,和细胞生存能力下降。F₂和引起ERK1/2抑制剂extracellular-calcium-free-hypoxia / reoxygenation-induced ERK1/2激活和抑制心肌细胞损伤。引起ERK1/2活化剂F₂上面的效果。F₂没有影响心肌细胞营内容或PKA和Egr-1表达式。总之,ERK激活extracellular-calcium-containing和extracellular-calcium-free缺氧/复氧导致心肌细胞损伤。F₂可以改善心肌细胞缺氧/复氧损伤通过调节extracellular-calcium-dependent PKC吗α/ ERK1/2 Egr-1通路并通过extracellular-calcium-independent ERK1/2激活独立于营地/ PKA通路或Egr-1超表达。

1。介绍

加剧了组织和器官损伤的现象产生的缺血后恢复血流被称为缺血/再灌注(I / R)损伤。研究已经证明,这种现象发生在多种组织和器官如脑、心、肝、肺、肾、胃肠道、四肢,皮肤。心肌I / R损伤是一种病理生理现象常见缺血性心脏病和心脏手术之后。减少和消除这种损害已成为一个热点话题。

N-n-Butyl氟哌啶醇碘(F₂我们组)是一个新的化合物合成。之前的研究表明,F₂有保护作用在活的有机体内心肌I / R损伤在体外缺氧/复氧(H / R)损伤模型(1- - - - - -4]。我们的研究表明,F₂保护与得罪通过l型钙通道细胞内钙超载,抑制早期生长反应基因1 (Egr-1) mRNA和蛋白进行靶向治疗(2,5- - - - - -7]。进一步分析表明,F₂能够抑制Egr-1表达式通过抑制H / R-induced古典calcium-dependent PKC吗α易位/激活。然而,它也可以激活calcium-independent PKCε易位激活保护从维持心肌细胞H / R损伤(8]。此外,在心脏微血管内皮细胞,没有l型钙通道,F₂还对H / R损伤有保护作用[6,9- - - - - -11]。这些研究表明,F₂可以保护细胞免受I / R损伤通过calcium-dependent和独立的机制。然而,目前还不清楚哪些信号通路参与。

细胞外signal-regulated激酶(ERK1/2)途径,近年来引起了广泛关注,是第一个MAPK信号转导通路的家庭发现。它也是最广泛研究的信号转导通路(12]。不仅仅是参与调节多种细胞生理功能也起着重要的作用在多种疾病的发病机制。大量研究表明,ERK1/2信号通路密切相关心肌I / R和H / R损伤(13]。在I / R或H / R刺激,ERK1/2激活钙细胞核,磷酸化的丝氨酸和苏氨酸残基的转录因子,导致基因转录的激活和失活和随后的细胞功能的变化12- - - - - -14]。此外,据报道,两个Ca^{2 +}端依赖和独立的升降活动ERK通路是必要的水平足以影响基因表达(15]。探索ERK1/2在I / R和H / R损伤,我们第一次观察到的变化ERK1/2活动在心肌细胞H / R的存在和缺乏细胞外钙。基于这些结果,我们进一步调查是否F₂保护心肌细胞的H / R损伤可能发生通过其calcium-dependent PKC的监管α/ ERK1/2 / Egr-1信号通路。

营和Ca^{2 +}是主要的第二信使。他们不仅相声的下游信号分子,而且钙细胞内信号独立(16]。的cAMP-dependent PKA营地中是主要的下游分子信号通路。营/ PKA激活可以抑制ERK1/2 Rat-1细胞激活,NIH / 3 t3细胞,HEK293细胞,COS-7细胞(17- - - - - -19]。在PC12细胞和S49小鼠淋巴瘤细胞,营地/ PKA作为上游信号激活ERK1/2和影响细胞的功能20.,21]。在心肌细胞中,营地/ PKA信号通路也ERK1/2密切相关。被异丙肾上腺素激活后,β1基于“增大化现实”技术激活Gs / AC /营地/ PKA通路,因此激活ERK1/2,引起心肌细胞凋亡22,23]。这些结果表明,calcium-independent营地/ PKA ERK1/2通路可能与H / R-induced心肌损伤。因此,在这项研究中,我们同时关注是否calcium-independent F的机制₂保护与监管营地/ PKA / ERK1/2 / Egr-1途径。

2。材料和方法

2.1。文化主要心肌细胞

成人Sprague-Dawley老鼠(200 - 250克)是获得重要河流实验动物科技公司(中国,北京)。研究协议是医学动物保健和福利委员会批准汕头大学医学院和执行符合指南的护理和使用实验动物(NIH出版,1996)。主要培养心肌细胞的衰老与少量修改(如前所述2]。短暂,新生儿心室心肌细胞分离得到1 - 4-day-old Sprague-Dawley有0.1%胰蛋白酶的老鼠。分散的细胞被镀在m - 199含10%胎牛血清的培养基30分钟去除noncardiomyocytes。心肌细胞,代表90 - 95%的总坚持细胞,培养在中有0.1毫米5-bromodeoxyuridine第一4天孵化器有限公司为5%₂在37°C。实验4或5天的文化。

2.2。制备试剂和液体

F₂在我们的实验室合成。异搏定是购自上海禾丰制药(中国);ERK抑制剂PD98059购买从Promega(美国)和U0126从细胞信号技术(美国);ERK激活EGF是购自Pepprotech(美国);PKC -α抑制剂Go6976购买从普利茅斯会议(美国);PKC -α活化剂PMA、H89 PKA抑制剂和激活剂Forskolin买来σ(美国)。Anti-p-PKCα,anti-total PKCαanti-PKA,和鲁米诺化学发光试剂购自圣克鲁斯生物技术(美国);anti-p-ERK1/2, anti-total ERK1/2, anti-Egr-1从细胞信号技术购买(美国);反β肌动蛋白和辣根peroxidase-conjugated二级抗体购自武汉博士德生物技术有限公司(中国);所有其他的化学药品和试剂购自当地机构。对含钙缺氧的解决方案是由以下几点:137毫米氯化钠,氯化钾12毫米,0.49毫米MgCl₂h·6₂CaCl啊,0.9毫米₂,消息灵通的4毫米,乳酸钠和20毫米。Calcium-free缺氧的解决方案是由以下几点:137毫米氯化钠,氯化钾12毫米,0.49毫米MgCl₂·6小时₂玫瑰啊,1毫米EGTA 4毫米,乳酸钠和20毫米。钙缺乏再氧化的解决方案是正常培养基2毫米calcium-chelating EGTA补充道。

2.3。建立对含钙(正常细胞外钙)和Calcium-Free(缺乏细胞外钙)H / R模型和实验小组

培养心肌细胞被随机分组(图1)。calcium-containing-H / R模型建立与前面描述的两个小时缺氧而不是3小时缺氧(2]。F₂(1×10⁻⁶mol / L),版本(2×10⁻⁶mol / L)抑制剂(PD98059 (2×10⁻⁵mol / L), U0126 (2×10⁻⁵mol / L)和Go6976 (1×10⁻⁶mol / L)和活化剂(EGF (50 ng / mL)和PMA (1×10⁻⁷mol / L)是在正常中(预孵化),缺氧的解决方案,分别和/或再氧化介质。对含钙normoxia (CaCon)组实验前补充新鲜培养基,培养了3小时。

calcium-free-H / R模型建立了像以前一样只有calcium-free对含钙缺氧缺氧解决方案替代解决方案和正常calcium-free媒介的媒介。F₂抑制剂(PD98059 U0126和H89 (1×10⁻⁵mol / L)和活化剂(EGF和Forskolin (1×10⁻⁵mol / L)也如上所述。的calcium-free常氧控制(0 cacon)组补充calcium-free介质之前的实验,培养3小时。

2.4。免疫印迹分析

从培养细胞总蛋白提取准备使用含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒的细胞裂解缓冲(抑肽酶、亮抑酶肽抑肽素,和PMSF)。免疫印迹分析与一些修改(如前所述2]。蛋白质浓度测定用bicinchoninic酸测定(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。受到等量的总蛋白质sds - page(10%),其次是硝化纤维膜电泳转移。膜上的非特异性结合位点被封锁与三羟甲基氨基甲烷缓冲液含有5%脱脂奶粉1小时。膜与anti-p-PKC探测α,anti-total PKCα、anti-p-ERK1/2 anti-total ERK1/2、anti-Egr-1 anti-PKA和反β肌动蛋白抗体(1:5000稀释反β肌动蛋白1:1000稀释其他抗体)在一夜之间在4°C。的屁股然后洗了三次10和20毫米三分钟,150毫米氯化钠和0.1%渐变20 (TBST)和孵化与辣根peroxidase-conjugated二级抗体(1:5000)1小时。用免疫印迹检测免疫反应性的乐队进行了鲁米诺化学发光试剂。蛋白质的相对密度乐队量化使用Gel-pro光密度分析软件(美国媒体控制论)。

2.5。测量心肌肌钙蛋白I (cTnI)和条件培养液中乳酸脱氢酶(LDH)水平

cTnI和LDH的释放条件培养液中发现后再氧化。cTnI的水平测量使用一个ACS 180自动化学发光系统(拜耳公司,美国)two-site三明治免疫(拜耳公司,美国)。的LDH水平条件培养基测定使用测试套件(南京建成生物工程研究所,中国):

2.6。评估心肌细胞生存能力的细胞计数Kit-8 (CCK-8)比色测定

心肌细胞是镀在5×10⁴细胞/在96孔板。然后,4 - 5天后,细胞治疗如前所述。10μL CCK-8解决方案添加到100年μL再氧化溶液和细胞孵化额外1小时后再氧化。吸光度测量的标在450海里。

考虑

2.7。在培养的心肌细胞的水平

在培养的心肌细胞的浓度是由ELISA使用商用设备(瑞士恩佐生命科学International Inc .)根据制造商的指示。所有样品和标准在重复测量。短暂,心肌细胞0.1盐酸处理30分钟,然后收获。离心后,上清液储存在−30°C为以后分析。50毫升的标准和样本添加到96孔板涂有GxR IgG抗体。然后,cAMP-conjugated碱性磷酸酶和营地抗体被添加到所有井的序列。孵化后2小时在盘子里瓶在500 rpm,每个好洗了三次清洗缓冲然后孵化与基质溶液(对硝基苯磷酸盐)1小时。停止的反应是停在添加解决方案(磷酸三钠)。板在405 nm,营地的浓度是根据标准曲线计算。

2.8。统计分析

数据显示为均值±SEM。差异的重要性确定使用单向方差分析后由Student-Newman-Keuls测试。被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。F₂抑制Calcium-Containing-H / R-Induced ERK1/2激活,从而降低Egr-1蛋白质表达和cTnI泄漏和提高细胞在心肌细胞生存能力

3.1.1。F的影响₂Calcium-Containing-H / R-Induced ERK1/2激活和Egr-1蛋白表达

p-ERK1/2密度比总ERK1/2密度反映了ERK激活的程度。总ERK密度的比值β肌动蛋白密度反映了总ERK蛋白水平。Egr-1密度的比值β肌动蛋白密度反映了Egr-1蛋白质水平。在每个实验中,密度比CaCon组设置为100%,密度比其他团体在这里表示相对于CaCon水平。

如图2,p-ERK1/2 Egr-1表达水平明显高于CaH / R组比CaCon集团()。p-ERK1/2和Egr-1表达水平明显下降的儿童和青少年卫生与发育司/ R + F₂组、儿童和青少年卫生与发育司/ R + U0126组、儿童和青少年卫生与发育司/ R + PD98059集团和CaH / R +版本组比CaH / R组()。总没有区别ERK1/2蛋白表达在不同的组()。表皮生长因子被发现对抗F₂抑制H / R-induced upregulation p-ERK1/2和Egr-1表达但没有可辨别的影响总ERK1/2蛋白表达。表皮生长因子激活ERK1/2 normoxia但并不影响Egr-1表达式。这些结果表明,ERK1/2信号通路介导calcium-containing-H / R-induced upregulation Egr-1蛋白质。F₂抑制Egr-1表达式通过抑制ERK1/2信号通路。

3.1.2。的影响抑制ERK1/2激活Calcium-Containing-H / R-Induced cTnI泄漏,减少心肌细胞的细胞生存能力

cTnI内容培养心肌细胞上清液和细胞生存能力的风险高CaH / R组显著低于CaCon组()。F₂、维拉帕米和ERK1/2抑制剂U0126和PD98059显著降低cTnI内容和提高细胞生存能力)。发现ERK1/2活化剂EGF与F₂cTnI泄漏的抑制和改善细胞生存能力)。在常氧条件下,EGF对cTnI内容或没有影响细胞的生存能力(表1)。

3.1.3。F的监管作用₂Calcium-Containing-H / R-Induced PKC异常α/ ERK1/2 / Egr-1通路

PKC的α抑制剂Go6976和活化剂PMA是用来澄清F的影响₂在PKCα/ ERK1/2 / Egr-1信号通路。p-PKC的比率α密度与总PKCα密度是用来确定PKC的程度α激活,PKC总额的比率α密度β肌动蛋白密度是用来确定总PKCα蛋白表达水平。在每个实验中,密度比CaCon组设置为100%,密度比其他组表达水平相对于CaCon组(图3)。

PKCα活动在儿童和青少年卫生与发育司/ R组显著高于CaCon组()。PKCα活动显著低于CaH / R + F₂组、儿童和青少年卫生与发育司/ R + Go6976组,儿童和青少年卫生与发育司/ R +版本组比CaH / R组()。PKC的α活化剂PMA发现对抗F₂抑制calcium-containing-H / R-induced PKCα心肌细胞(图中激活3(一个))。p-ERK1/2(图3 (b))和Egr-1(图3 (c))作为p-PKC表现出同样的趋势α。总PKC没有显著差异α或总ERK蛋白表达()。根据normoxia, PMA PKC激活α和ERK1/2但没有刺激Egr-1蛋白表达。本研究表明,F₂抑制异常calcium-containing-H / R-induced PKC激活α/ ERK1/2 Egr-1信号通路。

3.2。F₂保护心肌细胞从Calcium-Free H / R损伤通过抑制ERK1/2激活

3.2.1之上。F的影响₂Calcium-Free-H / R-Induced ERK1/2和Egr-1表达与Egr-1 ERK1/2之间的关系

如图4ERK1/2活动明显高于0比0 cacon cah / R组集团()。ERK1/2激活显著低于0 cah / R + F₂组、0 cah / R + U0126组、和0 cah / R + PD98059组比0 cah / R组()。ERK1/2兴奋剂EGF发现对抗F₂抑制calcium-free-H / R-induced p-ERK1/2 upregulation在心肌细胞。之间没有区别总共ERK表达观察组()。这些结果表明,F₂可以对抗calcium-free-H / R-induced ERK1/2通路的激活心肌细胞异常。

无显著变化Egr-1蛋白表达之间的观察组()。在缺乏细胞外钙、H / R发现激活ERK1/2但没有影响Egr-1蛋白表达,表明没有油气上下游ERK1/2与Egr-1之间的相关性。F₂没有影响Egr-1蛋白表达在calcium-free H / R损伤条件下心肌细胞。

3.2.2。影响抑制ERK1/2激活Calcium-Free-H / R-Induced LDH泄漏和cTnI,降低细胞生存能力

在培养心肌细胞上清液LDH和cTnI水平显著提高,和细胞生存能力显著低于0比0 cacon cah / R组集团()。F₂和ERK1/2抑制剂U0126 PD98059被发现显著减少LDH和cTnI浓度和提高细胞生存能力)。发现ERK1/2活化剂EGF与F₂抑制LDH和cTnI泄漏和改善细胞生存能力)。在常氧条件下,发现EGF对LDH或cTnI水平没有影响或细胞生存能力(表2)。

3.2.3。阵营的角色/ PKA通路在F₂保护心肌细胞从Calcium-Free-H / R-Induced受伤

营/ PKA参与心肌细胞功能的调节在I / R作为上游信号分子激活ERK1/2信号通路(22]。像Ca^{2 +}营地是一个跨膜第二信使。它可以被视为一个noncalcium第二信使。在这项研究中,我们评估的影响₂营水平和PKA蛋白质表达和检查H89 PKA抑制剂和激活剂的影响Forskolin在心肌细胞LDH泄漏期间calcium-free H / R。PKA的密度比β肌动蛋白是用来表示PKA蛋白表达。PKA的密度0 cacon组设定在100%,和其他群体的密度计算相对于这些值。

营水平0 cah / R组低于0 cacon组,但差异无统计学意义()。F₂发现没有影响营水平calcium-free H / R。观察PKA蛋白含量无显著差异的不同组()。在培养细胞上清液LDH水平明显高于0 cah / R组比0 cacon集团()。然而,H89 Forskolin被发现没有影响心肌细胞LDH水平calcium-free H / R条件下(表3和4和图5)。

4所示。讨论

4.1。影响ERK1/2激活的H / R刺激心肌细胞损伤

ERK1/2通路是一个重要的细胞信号通路。细胞外信息转移到细胞核和调解最终的细胞反应。ERK1/2信号通路的研究表明,参与I / R损伤的各种组织和器官,尤其是在心肌组织(13,24- - - - - -27]。在这项研究中,我们关注心肌H / R损伤之间的关系和ERK1/2信号通路。我们的结果表明,H / R刺激激活ERK1/2存在和缺乏钙。这是证明了水平的提高p-ERK1/2总ERK的和不变的水平。ERK1/2-specific抑制剂U0126和PD98059对含钙,有效地抑制calcium-free-H / R-induced ERK1/2激活,从而减少细胞损伤,证明减少LDH水平和cTnI泄漏,和改善细胞的可行性。这些表明ERK1/2激活导致心肌细胞损伤对含钙和calcium-free-H / R刺激。

虽然研究表明,ERK1/2通路的激活可以促进细胞存活(28,29日),我们的研究结果表明,ERK1/2信号通路的激活导致心肌H / R条件下细胞损伤。这个结果已经被许多研究支持,如研究康et al .,这表明,激活ERK1/2 H / R可能引起的小说在心肌细胞药物目标(30.),Tsoporis等人的研究和刘et al .,在那里他们发现ERK1/2-p53信号通路的激活引起心肌细胞凋亡在心肌梗死或抗癌药物阿霉素(管理31日,32]。这样,ERK1/2有显著影响细胞的病理生理状态,但其作用可能是不同的在不同的细胞类型和实验模型。我们相信ERK1/2可能扮演不同的角色在不同阶段的I / R: ERK1/2的激活在一个非常短的I / R可能启动内源性保护过程,比如在缺血性预处理,但当伴随着I / R的扩展过程,ERK1/2激活可能发起损伤信号,导致细胞损伤(33,34]。

4.2。通过Calcium-Dependent PKC Egr-1表达的抑制作用α在F / ERK1/2 Egr-1通路₂保护心肌H / R损伤

我们的初步结果表明,屏蔽l型钙通道可以抑制钙流入,降低细胞内钙超载,从而抑制calcium-dependent PKCαEgr-1的激活和随后的异常表达。这是其中一个重要的F calcium-dependent机制₂从H / R-induced心肌细胞损伤的保护。然而,目前尚不清楚ERK PKC介导信号转导α和Egr-1。

我们在之前的一项研究中发现,H / R可以诱导PKCα易位的可溶性部分在心肌细胞(颗粒分数8]。在目前的研究中,我们还发现,H / R可以激活PKCα通过增加其磷酸化。我们也观察到,PKCα抑制剂Gő6976抑制p-ERK1/2和Egr-1蛋白质超表达,表明PKCα活化具有重要影响ERK1/2激活和Egr-1过度,这意味着ERK1/2和Egr-1 PKC的下游分子α信号通路。使用ERK1/2抑制剂U0126 PD98059,我们发现ERK1/2 Egr-1的上游信号分子。在目前的研究中,我们证明了H / R PKC激活异常引起的α/ ERK1/2 Egr-1通路,从而导致一系列的细胞损伤。

在这项研究中,p-PKCα、p-ERK1/2 Egr-1 F后蛋白表达减少₂治疗,但总PKCα和ERK1/2蛋白质表达并没有改变,这表明F₂还可以抑制PKCα和ERK1/2激活抑制Egr-1除了。PKC的α活化剂PMA可以抑制F₂downregulation p-PKC的αp-ERK1/2和egr-1差别表达和对这些基因的蛋白表达,这表明F₂抑制ERK1/2及其抑制PKC Egr-1依赖α激活。ERK1/2活化剂EGF可以抑制F₂downregulation p-ERK1/2激活和Egr-1蛋白质的表达和F₂保护心肌细胞(包括cTnI泄漏的抑制和改善细胞生存能力),这表明F₂保护心肌细胞是依赖其抑制ERK1/2 Egr-1蛋白质表达的差别和随后对这些基因的激活。通过这种方式,我们证明了F₂抑制ERK1/2激活PKCα端依赖和F₂抑制Egr-1 ERK1/2-dependent超表达,表明F₂保护心肌细胞H / R条件下通过调节异常PKC发生α/ ERK1/2 / Egr-1信号通路。此外,在这项研究中,我们使用钙拮抗剂维拉帕米作为一个积极的控制,发现维拉帕米,像F₂p-PKC有影响α、p-ERK1/2 Egr-1蛋白表达和保护心肌细胞从一系列的H / R损伤。这表明,F₂和维拉帕米可调节异常的PKCα/ ERK1/2 / Egr-1通路,通过调节钙可能发起的。这个假设是PKC支持的事实α是一个calcium-dependent激酶。在常氧条件下,Egr-1表达很低,PMA治疗激活ERK1/2但没有刺激Egr-1蛋白表达。同样,ERK1/2活化剂EGF没有造成Egr-1蛋白质过度或细胞损伤。这些结果表明,ERK1/2-related细胞信号网络非常复杂和特定的细胞内微环境在H / R刺激决定ERK1/2下游信号和其最终的功能。

4.3。抑制ERK1/2激活的细胞外Calcium-Independent F的机制₂保护心肌H / R损伤

细胞内钙超载是I / R损伤的一个重要原因。钙拮抗剂可以对抗细胞内钙超载,保护心肌细胞从I / R损伤。然而,亨佩尔等人发现硝苯地平没有影响ischemia-induced内皮细胞胞内钙增加但它可以防止ischemia-induced PKC易位和改善ischemia-induced内皮细胞通透性增加35]。Eickelberg等人进行的一项研究表明,氨氯地平、地尔硫卓,维拉帕米可以调节转录因子NF-IL6和NF -κB intracellular-calcium-independent地(36]。这些结果表明,钙拮抗剂可以影响细胞功能的方式除了钙通道堵塞,影响细胞内的钙含量。我们的初步结果还表明,F₂,一个新的l型钙拮抗剂,不仅可以激活calcium-independent PKCε通过易位在大鼠心肌细胞H / R的刺激,保护心肌细胞,也保护大鼠冠状动脉内皮细胞,没有l型钙通道,从H / R损伤(6,8- - - - - -11]。因此,我们有理由推测,F₂可以保护心肌细胞H / R损伤extracellular-calcium-independent地。

我们的研究结果表明,F₂抑制calcium-free-H / R-induced ERK1/2激活,导致减少LDH和cTnI泄漏,和改善细胞的可行性。引起ERK1/2活化剂EGF F₂抑制calcium-free-H / R-induced p-ERK1/2 upregulation和抑制F₂保护心肌细胞。这些数据表明,在calcium-free H / R F₂可以直接作用于ERK1/2或其上游信号分子和保护心肌细胞H / R损伤。换句话说,阻塞H / R-induced ERK1/2途径激活是一个extracellular-calcium-independent机制F₂保护心肌细胞。在常氧条件下,发现表皮生长因子激活ERK1/2钙的存在与否,但并没有导致心肌细胞损伤。然而,ERK1/2激活可导致细胞损伤在H / R,表明尽管ERK1/2是一个关键的中介,它仍然需要其他因素导致细胞损伤。

在ERK1/2-related途径的研究,我们的研究结果表明,营水平较低的0比0 cacon cah / R组群,但这种差异没有统计学意义,PKA团体之间的水平并没有改变。0 cah / R组LDH泄漏增加,PKA活化剂Forskolin和抑制剂H89没有影响calcium-free-H / R-induced LDH泄漏,这表明calcium-free-H / R-induced心肌细胞损伤不是由营/ PKA通路。我们也观察到,F₂没有影响营浓度或PKA calcium-free H / R蛋白表达的刺激,表明F的细胞外calcium-independent机制₂防止在心肌细胞H / R损伤ERK1/2有关,但上游信号分子营地/ PKA无关。

这项研究和我们以前的研究表明,F的心肌保护作用₂抑制相关I / R -和H / R-induced Egr-1 mRNA和蛋白进行靶向治疗。但目前的研究表明,calcium-free H / R没有造成Egr-1蛋白质upregulation和F₂没有影响Egr-1蛋白表达在calcium-free心肌细胞H / R。一个可能的解释是,钙参与H / R-induced upregulation Egr-1。我们发现,三种不同类型的钙拮抗剂维拉帕米、地尔硫卓、硝苯地平、抑制I / R - H / R-induced Egr-1 mRNA和蛋白上调在某种程度上7]。同样,罗等人发现,钙螯合剂BAPTA / AM完全抑制低氧诱导Egr-1超表达内皮细胞(37]。我们以前观察到H / R-induced Egr-1过度和F₂保护和抑制Egr-1微血管内皮细胞(9- - - - - -11]。这些细胞缺乏l型钙通道。然而,这些环境中特定的细胞钙。因此,我们推测,H / R可能导致细胞外钙流入并最终Egr-1超表达由于countertransportation Na的钙⁺/ Ca^{2 +}换热器(NCX)或膜完整性的破坏。F₂表现出监管Egr-1表达和微血管内皮细胞保护作用的抑制NCX外水流和随后的减少钙流入(38]。在这项研究中,EGTA螯合所有intracellular-extracellular细胞外钙和钙梯度消失了。所有的细胞外钙流入被淘汰所以calcium-dependent Egr-1过度和F₂的监管变得困难calcium-free H / R。

虽然我们观察到异常ERK / Egr-1通路活动对含钙H / R模型,对Egr-1 ERK1/2抑制剂和激活剂没有影响蛋白表达在calcium-free H / R。这表明ERK激活是一个总开关触发心肌H / R损伤是否在细胞外对含钙或calcium-free H / R,然而,其下游信号也是由特定细胞内微环境如细胞内钙浓度。因此,在目前的研究中,我们发现Egr-1表达式并没有改变和ERK活化钙被淘汰的涌入calcium-free H / R。这个结果支持了Josefsen et al .,他发现Egr-1表达依赖于Ca^{2 +}涌入(39]。当然,其他下游信号分子可以参与其中,值得进一步研究。

5。结论

总之,在培养的心肌细胞,extracellular-calcium-containing和extracellular-calcium-free-H / R发现激活ERK1/2,导致细胞损伤。F₂发现防止心肌细胞H / R损伤通过调节细胞外calcium-dependent PKC异常α/ ERK1/2 / Egr-1信号通路。F₂还发现,保护心肌细胞通过细胞外calcium-independent H / R损伤的机制,可能与它抑制H / R-induced ERK1/2激活相关但不营/ PKA信号通路或Egr-1蛋白表达。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是由中国国家自然科学基金支持的(国家自然科学基金委)广东联合基金(没有。U0932005),中国国家自然科学基金(没有。81072633),中央政府专项资金支持地方高校的发展。

引用

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