小说四肽衍生物展品Neutrophil-Derived的体外抑制活性氧和溶酶体酶释放

文摘

嗜中性粒细胞浸润在心肌损伤的发病机制中起着重要作用。氧化损伤是建议中央的急性心肌梗死后的细胞损伤机制。这项研究是开门的预后作用四肽衍生物PEP1261 (BOC-Lys(中行)-Arg-Asp-Ser (tBu) -OtBU),乳铁蛋白肽序列(39-42),研究了中性粒细胞功能的调制在体外通过测量活性氧(ROS)生成、溶酶体酶的释放,增强C蛋白的表达。基础实验是关心隔离的中性粒细胞正常和急性心肌梗死大鼠找到PEP1261的功效在存在强大的中性粒细胞兴奋剂,佛波醇醋酸12-myristate 13 (PMA)。与PMA刺激中性粒细胞导致了氧化的超氧化物阴离子和增强溶酶体酶的释放和表达的补充蛋白质。本研究进一步证明了自由基增加中性粒细胞的补充因素确认活性氧的作用。PEP1261治疗显著降低超氧化物阴离子的含量和抑制溶酶体酶的释放刺激控制和梗塞大鼠中性粒细胞。这项研究表明,PEP1261显著抑制对ROS生成的影响以及补充的信使rna合成和表达因素中性粒细胞分离心脏梗塞。

1。介绍

活性氧(罗斯)已被证明对心肌产生直接的抑制作用函数体内,有一个关键的角色在心肌惊人的发病机制1,2]。氧化应激和活性氧的形成可能引发一连串的生化和分子尖叫声如黄嘌呤脱氢酶/黄嘌呤氧化酶转换,导致在生产活性氧(3,4]。氧化缺血性损伤提出的中央机制影响所有器官和组织的细胞损伤后缺血;然而,机制触发和调节这伤害,没有充分的特点。

多形核白细胞(PMNLs)是短暂的,终末分化细胞,对抗感染,他们都是最重要的一个细胞成分参与宿主防御。循环PMNLs参与宿主防御着边和外渗的炎症(5]。尽管中性粒细胞对宿主防御至关重要,他们也被牵连在缺血的病理6,7]在许多慢性炎症性疾病8,9]。中性粒细胞激活水平在心肌梗死(10),随后,激活中性粒细胞产生活性氧(ROS),如超氧化物阴离子()、过氧化氢(H₂O₂)、次氯酸(HOCl)和羟基自由基(可能)[11,12]。

因此,氧自由基的积累和激活中性粒细胞也强烈与重要的病理生理机制介导心肌缺血(2,13]。因此,炎症的特点是高浓度的刺激中性粒细胞,分泌ROS和蛋白水解酶(14- - - - - -16]。

补体激活炎症的构成方面,发生在缺血(17- - - - - -19]。各种实体激活补体,包括抗体,微生物膜,自由基(20.]。尽管众所周知,自由基激活补体系统,自由基对补转录的影响仍然无法解释。

在目前的工作,我们发现,PEP1261 (21)可以抑制ROS和溶酶体酶释放激活中性粒细胞与急性心肌梗死大鼠(1]。

2。材料和方法

这项研究符合机构动物伦理委员会的指导原则(IAEC)委员会控制和监督的目的动物实验(CPCSEA),和指导的护理和使用实验动物发表的美国国立卫生研究院(NIH没有出版。85 - 23,1996年修订)。

2.1。化学物质

佛波醇醋酸12-myristate 13 (PMA),细胞色素C,超氧化物歧化酶,酚红、右旋糖酐,O-dianisidine盐酸,ficoll-histopaque(σ1077),甘油,hexadecyltrimethylammonium溴化,汉克的平衡盐溶液(hbs),辣根过氧化物酶,特里同X100买来σ(圣路易斯,密苏里州,美国)。Folin-Ciocalteau试剂、血红蛋白、过氧化氢和磷酸p-nitrophenol取自Sisco研究实验室(印度孟买)。所有其他化学物质均为分析纯。

2.2。实验动物

雌性老鼠(威)重180 - 200克纯系在病原体免费设施,和他们保持在环境控制的房间12 h光/暗周期。动物收到商业大鼠饮食和水随意。

2.3。合成PEP1261

PEP 1261用于本研究合成了解决方案阶段方法示意图如图表示1并通过柱层析法纯化。肽的同质性建立了薄层色谱法。质子核磁共振谱和红外光谱被记录使用布鲁克300 MHz FT-NMR那些时光DX-20傅立叶变换红外光谱仪、分光计和Nicolet分别。氨基酸肽衍生物的分析是由precolumn衍生化与phenylisothiocyanate (PITC)使用高效液相色谱法。反相高效液相色谱法分离PTC氨基酸和淀粉微球进行LKB LCC 2252 / LKB VWM 2141单位固定或可变波长检测器在254海里。杜邦Zorbax甲状旁腺素列,25厘米长,内直径0.46厘米,和5μ米粒子大小、使用。FAB质谱被记录在JEOL SX 102 / da - 6000质谱仪数据系统21]。

2.4。梗塞模型的发展

诱导大鼠心肌梗死模型如前所述[1与修改早期死亡率降到最低。短暂,动物有粘液分泌腺[2 -受体阻滞药胃长宁μ克/ kg.b.wt。,我。m) and were anaesthetized with ketamine [50 mg/kg.b.wt., i.p] and diazepam (2.5 mg/kg.b.wt., i.p]. After anesthesia, endotracheal intubation was performed and a tube connected to a positive pressure respirator was introduced. After establishing positive pressure respiration, left intercostal thoracotomy was performed using aseptic technique, and the third and fourth intercostal ribs were separated with a small retractor to expose the heart. The pericardium was opened carefully avoiding any injury to the heart. The left coronary artery (LCA) and its branches could be seen easily without any amplification or use of a surgical microscope. The pattern of the LCA was carefully examined in order to ligate the left anterior descending coronary artery. A 6–0 atraumatic proline silk suture was passed through the epicardial layer around the midway of the left anterior descending coronary artery. Following coronary occlusion, the thorax was closed in layers, the endotracheal tube was removed, and the animals were brought back to normal respiration.

2.5。隔离大鼠中性粒细胞

血液从sham-operated和梗塞大鼠中性粒细胞分离根据纽曼et al。22]。中性粒细胞是悬浮在哈佛商学院,和细胞浓度确定使用血球计。

2.6。刺激研究

确定最优的浓度PEP1261中性粒细胞分离大鼠,髓过氧化物酶(MPO)作为一个敏感的标志和结果显示一个抑制浓度(IC₅₀)μ(数据未显示)。因此,进一步的研究进行了120年最佳浓度μM PEP1261和KRDS。中性粒细胞(细胞/)留给坚持了1 h,它们被添加PMA刺激(100 ng / mL) (231 h在37°C)。对于sham-operated梗塞大鼠,中性粒细胞分离和1 h依从性和PEP1261后补充道。文化是PEP1261治疗的1 h后终止。

MPO是化验后的细胞溶解产物提取酶在含有溴化十六烷基trimethylammonium磷酸盐缓冲剂24]。

对H₂O₂分析(25),介质被除去,附着中性粒细胞,100μL (1μPMA的g / mL)添加紧随其后的1000年μL (hbs含有辣根过氧化物酶(19个单位/毫升)和酚红(0.02%)。在100年1 h的孵化μL 1 M氢氧化钠添加颜色开发阅读605海里。

的测定(26),介质被和附着中性粒细胞孵化80年哈佛商学院包含1 hμM细胞色素C和10μM PMA。颜色在上层的开发是在580海里。的数量释放是由细胞色素C的量测量使用的摩尔消光系数米⁻¹厘米⁻¹。

溶酶体酶化验,去除无细胞培养基后,这些细胞被细胞溶解通过添加0.5毫升的冰冷Triton在0.25 X100蔗糖0.1%,遭受反复冻融和化验酸性磷酸酶(27)和组织蛋白酶D (28]。

2.7。补充表达研究

总RNA从虚假的操作和梗死组织中性粒细胞分离提取使用试剂盒试剂(Gibco-BRL提供的工具(技术)(美国专利号5346年、94年)酚和异硫氰酸胍发达的单相解Chomczynski和萨基29日)(表1)。

2.8。统计研究

所有参数,进行单变量分析和非参数统计分析的结果Mann-Whitney””测试。

3所示。结果

研究PMA刺激大鼠中性粒细胞的有益作用PEP1261 ROS的生成和溶酶体酶的释放,而且,因此,实验进行中性粒细胞分离心肌缺血大鼠。虽然H的水平₂O₂和明显增加了PMA刺激和中性粒细胞分离心肌梗塞大鼠,PEP1261显示对自由基产生保护作用,无论兴奋剂的性质()(图2)。

相比,PMA处理细胞,PEP1261细胞表现出显著减少PMA-induced MPO激活()。符合这些观察,来自心肌梗死大鼠中性粒细胞明显抑制在PEP1261治疗()。

溶酶体酶释放PMA也增强中性粒细胞和被治疗纠正PEP1261如图3。PMA刺激导致适度增加()的组织蛋白酶D和酸性磷酸酶水平,而且发现了这些酶的水平减少PEP1261治疗()。

确保结果是中性粒细胞的来自于急性心肌梗塞的老鼠,从总RNA提取用于建立rt - pcr扩增的mrna的存在和相对价值功能终端C蛋白,即C5、C6, C7、C8,制备过程,GAPDH(图4)。

4所示。讨论

中性粒细胞代表宿主防御的第一行所有类型的感染,他们也参与各种炎症的病理条件(30.]。生存能力感染的挑战可能取决于适当的调制这些中性粒细胞功能的31日]。

氧化应激,定义为增加活性氧的生产,也就是说,H₂O₂,一直在与再灌注损伤心脏和其他器官(32,33]。中性粒细胞招募取决于炎性介质的存在。因此,这些细胞可能加重组织损伤通过自由基的释放和蛋白水解酶。氧代谢产物所产生膜结合酶复杂,NADPH氧化酶。因此,在缺血条件下,总有中性粒细胞的粘附和激活与自由基的生成。因此,组织损伤的发展取决于之间的平衡ROS的生成和组织抗氧化状态(34]。在这个平衡扰动自由基导致的氧化应激增加和提升者亚细胞的变化导致心肌病,心脏衰竭(10]。

几种药物被发现减少这些有害的影响,和最近的兴趣是特定的肽序列的作用在许多疾病治疗药物。序列H-Lys-Arg-Asp-Ser-OH (KRDS)是一种模拟RGDS和对应于残留39-42人乳铁蛋白。众所周知,人类乳铁蛋白展品消炎抗菌的特性,和它的作用在调节免疫系统的各个组件,生长因子活性,抑制血小板聚集(35]。这个序列,位于附近的氨基端地区已知的蛋白质和抑制血小板聚集在体外条件下,适当修改与疏水集团(PEP1261)也提高跨膜渗透性和增加稳定性。

初步研究进行了使用PMA刺激人类中性粒细胞和PEP1261被发现显著抑制活性氧物种生成和溶酶体酶释放浓度达到120μm . 120的浓度μ米似乎并没有非常高的自早期的实验表明,肽抑制血小板聚集在临界胶束浓度(CMC) (60μ米)是实现和浓度超过153μ米被发现有效抑制血小板聚集(21]。

白细胞积累的一个标志,MPO活性显著升高的心脏损伤。显示最近,中性粒细胞典型入侵在缺血心肌组织,他们观察到的是自由基的主要来源2]。本研究的结果显示PEP1261显著减少H₂O₂,MPO水平的刺激和老鼠心肌梗塞中性粒细胞也在协议与Manikandan et al。36]。

的广泛的版本衍生品可能参与缺血后组织损伤的发病机制在中风和心肌梗死和呼吸窘迫综合征(35]。在心肌组织缺血引起的一种急性炎症反应的早期阶段中性粒细胞聚集,加速了再灌注。H的上升₂O₂水平在心肌缺血发生表明,强化氧自由基的生产。这可能是次黄嘌呤转换的结果通过黄嘌呤氧化酶,儿茶酚胺自动氧化,多形核中性粒细胞激活,和/或错乱内线粒体电子传递(37]。在实验模型中,干预措施,减少中性粒细胞或抑制其功能造成显著减少心肌梗塞大小(36]。

溶酶体酶能完全降解结缔组织胶原蛋白等成分protein-mucopolysaccharide复合物,糖蛋白和弹性蛋白(38]。这些观察人士同意我们的发现,有一个增加溶酶体酶的活动,如酸性磷酸酶和组织蛋白酶D在心肌缺血的中性粒细胞在PEP1261治疗得到控制水平。

总之,neutrophil-mediated ROS,以及溶酶体酶泄漏,尤其是增加受伤后。治疗PEP1261减弱活性氧生成和心脏炎症可能会减弱。我们建议这些观察反映出角色激活补体介导的中性粒细胞在急性心肌梗塞。我们的观察可能会建议新策略来减弱心脏损伤和炎症在表明,更好的理解炎症细胞和环境刺激改变ROS水平是十分必要的。

承认

C.S.I.R.的财政援助,New Delhi to two of the authors, (MS) and (PM) is gratefully acknowledged.

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