姜黄素预处理诱导Nrf2和抗氧化剂反应,防止Hemin-Induced毒性大鼠小脑颗粒神经元的主要文化

文摘

姜黄素是一种双功能抗氧化剂来自姜黄。本研究确定姜黄素作为neuroprotectant反对hemin-induced损伤的主要文化(CGNs)的大鼠小脑颗粒神经元。氯高铁血红素、血红素的氧化形式,是一种高活性化合物诱导细胞损伤。预处理CGNs 30μM姜黄素有效地增加了2.3 - -4.9折血红素oxygenase-1 (HO-1)表达谷胱甘肽(GSH)和5.6 - -14.3倍的水平。此外,15μM姜黄素减55%的增加活性氧(ROS)生产,94%的减少谷胱甘肽/二硫化谷胱甘肽(GSSG)比和49%氯高铁血红素诱导的细胞死亡。血红素加氧酶系统或谷胱甘肽合成的抑制与锡mesoporphyrin buthionine sulfoximine,分别抑制对hemin-induced姜黄素毒性的保护作用。这些数据表明,HO-1和谷胱甘肽发挥重要作用在姜黄素的保护作用。此外,发现24小时孵化与姜黄素增加1.4 - 2.3——5.2倍谷胱甘肽还原酶的活性,分别为谷胱甘肽S-transferase和超氧化物歧化酶。此外,它是发现,姜黄素能够诱导核转录因子(erythroid-derived 2)——2 (Nrf2)易位到细胞核。这些数据表明,姜黄素诱导Nrf2的预处理和抗氧化剂的反应可能发挥重要作用的抗氧化剂对hemin-induced神经元死亡的保护作用。

1。介绍

一般使用天然产物一直是调节细胞内抗氧化体内平衡的方法。姜黄素是一种黄姜黄中含有的多酚化合物,来自姜黄林恩。(1]。姜黄素已经证明是一种有效的抗癌,抗病毒,抗氧化2- - - - - -5,抗炎物质在人类细胞培养和动物模型6,7]。

姜黄素作为一个直接和间接的抗氧化剂,因为它进行清除活性氧和氮物种(8,9]和诱发cytoprotective glutathione-S-transferase等酶(GST),γ谷酰基半胱氨酸连接酶(γgcl),血红素oxygenase-1 (HO-1)等(10,11]。姜黄素能够清除过氧化氢,过氧化氢自由基,超氧阴离子、羟自由基、单线态氧,一氧化氮和过氧亚硝基阴离子(8]。它已经表明,姜黄素诱导内源性抗氧化防御机制等调节转录因子核转录因子(erythroid-derived 2)——2 (Nrf2) [4),激活蛋白1 (AP-1)和核因子k B (NFκB) (12]。Nrf2维护主要在细胞质中,它仍然是绑定到BTB-Kelch-like ECH-associated蛋白1 (Keap1或KLHL19);Keap1作为亲电化合物的受体,促进Nrf2泛素化对于后续26 s蛋白酶体降解复杂的(13,14]。修改扣留1通过氧化或烷基化(如姜黄素交互)释放Nrf2然后Nrf2把进入细胞核,它作为异质二聚体抗氧化反应元素结合在DNA启动目标基因的表达。Nrf2-regulated基因可以分为二期xenobiotic-metabolizing抗氧化剂酶分子陪伴,DNA修复酶,蛋白质和抗炎反应(15]。这些蛋白质减少亲电试剂毒性低和自由基中间体,同时提高细胞修复任何后续损伤的能力(1,10,15,16]。在这方面,姜黄素能够诱导保护和激活Nrf2-dependent保护性反应在细胞系或动物模型暴露于氧化条件(17,18]。

氯高铁血红素、血红蛋白的降解产物释放溶解的红细胞在出血性中风19,20.]。这个分子是退化的亚型血红素加氧酶(HO)系统:HO-1诱导对碘氧基苯甲醚和本构血红素加氧酶2 (HO-2)。何氏反应prooxidant血红素水平降低,增加了抗氧化胆绿素,并且释放凋亡一氧化碳(CO) (20.]。此外,氯高铁血红素是一种高活性的化合物和一个危险分子与各种各样的氧化机制,其中大部分(包括酶反应21]。此外,它也知道氯高铁血红素本身就是redox-active和能够与过氧化物反应产生细胞毒性自由基和氧化应激。此外,氯高铁血红素是亲脂性的,插入到质膜,这可能诱导脂质过氧化反应,以及干扰膜流动性和功能(20.]。同时,氯高铁血红素迅速耗尽星形谷胱甘肽通过peroxynitrite-dependent机制诱导细胞死亡前(22]。它已经表明,氯高铁血红素由何鸿燊迅速积累,慢慢退化,主要造成损坏,在大鼠星形胶质细胞和神经元23,24]。此外,氯高铁血红素iron-dependent受伤还没有完全建立,因为铁螯合剂(邻二氮杂菲和去铁胺)无法减轻氯高铁血红素的破坏性影响22,23]。此外,在星形胶质细胞发现抗氧化剂如trolox或n -乙酰半胱氨酸不能够减少氯高铁血红素诱导的损害(23]。因此,新策略是必要的,以抵消氯高铁血红素诱导的损害。这些策略可能涉及大脑细胞的抗氧化潜力的提高刺激HO-1表达增强氯高铁血红素降解(避免参与氧化还原反应)和非酶的增加抗氧化剂谷胱甘肽和另一个cytoprotective酶等。在这种背景下,姜黄素过多的铁螯合等生物效应,直接和间接抗氧化和hormetin(电感轻微压力)动物和细胞模型(25- - - - - -28]。

考虑姜黄素的抗氧化性能和oxidant-mechanisms参与血红素组,引起的毒性的假说是,姜黄素可以减弱氯高铁血红素诱导的损害的主要文化(CGNs)的大鼠小脑颗粒神经元。发现CGNs神经元的预处理,有效地阻止了hemin-induced氧化损伤。这种保护作用是显著核易位Nrf2和提高酶和非酶的抗氧化剂。

2。实验程序

2.1。试剂

姜黄素(7-bis (4-hydroxy-3-methoxyphenyl) 1, 6-heptadiene-3, 5-dione,高纯度≥98.5%,商品目录号。alx - 350 - 028 - m050,很多没有。L12586)获得恩佐生命科学,Inc .(美国安阿伯市MI)。基础培养基鹰(BME)、胰蛋白酶、脱氧核糖核酸酶I型(DNAse I),阿糖胞苷,谷氨酰胺,葡萄糖,庆大霉素,氯高铁血红素(商品目录号。H5533,很多没有。110 k1094), 3 - [4, 5-dimethylthiazol - | 2-yl) 2, 5-diphenyl-tetrazolium溴化,L-buthionine sulfoximine (BSO),氯化锰,牛血清白蛋白(BSA), 5、5′-dithio-bis (2-nitrobenzoic酸),2-vinylpyridine (2-VP)、谷胱甘肽减少形式,L-glutathione氧化形式,poly-L-lysine,氮蓝四唑(电视台),1-chloro-2, 4-dinitrobenzene (CDNB)、乙二胺四乙酸(EDTA)、黄嘌呤,黄嘌呤氧化酶,βnadph和反α微管蛋白抗体购自Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。胰蛋白酶抑制剂,penicillin-streptomycin,台盼蓝、胎牛和马血清买来Gibco(生活技术,大岛,纽约,美国)。锡mesoporphyrin (SnMP)从前沿科学公司(美国UT Logan)。Monochlorobimane和赫斯特33258年污点从丙烯酰胺(Sigma-Aldrich)。异硫氰酸荧光素(FITC)共轭二次抗体购自杰克逊Immunoresearch实验室(美国西树林,PA)。Anti-HO-1抗体从恩佐获得生命科学,Inc . 5 - (6 -) Carboxy-2′, 7′二乙酸-dichlorodihydrofluorescein (carboxy-DCFDA)和荧光素二乙酸(FDA)购买的分子探针(技术)。辣根过氧化物酶(合)共轭驴anti-rabbit或山羊anti-mouse免疫球蛋白是通用电气医疗集团生物科学(美国宾夕法尼亚州匹兹堡)和表达载体(技术),分别。Anti-Nrf2和antiproliferating细胞核抗原抗体来自Abcam(美国Cambridge, MA)。Nrf2 TransAM的酶联免疫试剂盒(目录。50296)和核提取工具包(目录没有。 40010) were purchased from Active Motif Inc. (Carlsbad, CA, USA). Bio-Rad Protein Assay Dye reagent concentrate was purchased from Bio Rad Laboratories (Hercules, CA, USA). All other reagents were of analytical grade and were commercially available.

2.2。的主要文化CGNs

原代细胞培养得到从7-day-old鼠小脑如前所述29日- - - - - -31日]。实验用细胞体外培养9天(DIV)。动物被处理和护理与指导方针达成协议的正常实验动物的使用和护理官方墨西哥动物园(笔名- 062 - 1999)和生物残渣的处理(笔名- 087 -生态- 1995)。协议是经当地伦理委员会批准(FQ CICUAL / 059/13)。CGNs培养在BME补充50μ硫酸庆大霉素的g / mL, heat-inactivated 2更易与L谷酰胺,10%胎牛血清。阿糖胞苷(10μ米)添加镀后24小时。葡萄糖(5毫米)添加到文化DIV 4日。CGNs维持在37°C 5%有限公司₂的气氛。纯洁的文化中使用这种方法是95%左右31日]。

2.3。文化的治疗方法

为了引起氧化应激,CGNs与5-50孵化μM在克雷布斯铃声中氯高铁血红素1 h,氯高铁血红素被删除,CGNs孵化24小时的培养基。集中氯高铁血红素的解决方案(8毫米)溶解在40毫米氢氧化钠和维护受光。这个解决方案是用来准备工作的解决方案在10毫米磷酸盐缓冲剂,pH值7.4。建立了姜黄素对细胞活力的影响。集中姜黄素溶液(10毫米)溶解在DMSO和维护受光。这个解决方案是用来准备工作的解决方案在10毫米磷酸盐缓冲剂,pH值7.4。这个解决方案是直接添加到培养基达到所需的最终浓度。CGNs与姜黄素浓度增加(0-50孵化μ米)24 h。这一次,年底是测定细胞的可行性。在进一步的实验中,姜黄素的潜在保护作用CGNs决心。CGNs孵化24小时,5、10和15μ米的抗氧化氯高铁血红素和其生存能力评估之前24小时以后。

2.4。细胞生存能力测量

比色MTT和FDA荧光化验是用来测量细胞的可行性。MTT减少甲瓒线粒体脱氢酶的活性,与吸光度成正比可行的细胞(30.]。另一方面,食品及药物管理局是一个细胞渗透探测器,酯酶活细胞转化成荧光化合物的荧光素。细胞治疗12μM FDA在37°C和5分钟洗后荧光量化在协同HT多模标仪(美国弗吉尼亚州Biotek, Winooski)使用以下波长过滤器:激发和发射528/20 nm 485/20。细胞生存能力表示为一个百分比的MTT还原或荧光发射。控制细胞的生存能力(不处理)被认为是100%。细胞培养的价值有不同的治疗与控制的细胞。MTT和FDA方法之间的相关系数也计算。

2.5。免疫印迹分析

在每个治疗,细胞收获在50 mM磷酸盐缓冲剂(pH值7.4)和特里同x - 100年的0.1%。蛋白质的总量决定使用洛瑞与BSA方法作为标准。免疫印迹分析如前所述[29日]。蛋白质(30μg)在sds - page分离和转移到聚乙二烯二氟化物膜(EMD密理博公司,Billerica,妈,美国)。阻塞后5%的脱脂牛奶阻塞TBS-T缓冲区(三羟甲基氨基甲烷、液pH值7.4包含Tween-20 0.1%),膜与anti-HO-1孵化或反α微管蛋白抗体在TBS-T一夜之间4°C。之后,膜清洗和探测与辣根peroxidase-conjugated驴anti-rabbit或山羊anti-mouse免疫球蛋白在室温下1 h。乐队是由化学发光检测使用微孔对autoradiographic电影发射极耦合逻辑检测设备和显示。微执行ImageJ 1.47(美国国立卫生研究院)。

2.6。测定活性氧(ROS)

ROS的测量是由使用荧光探针carboxy-DCFDA和dihydroethidium如前所述[32]。酯酶的复合carboxy-DCFDA脱去乙酰基,由活性氧和活性氮物种氧化,并转换为荧光化合物5 - (6 -)carboxy-2 7-dichlorofluorescein (carboxy-DCF),染色和明亮的绿色荧光细胞的细胞质。Dihydroethidium被氧化的ethidium胞质主要由细胞核内超氧化物阴离子然后保留因为与DNA的相互作用,因此与亮红色荧光染色细胞核(33]。

细胞培养的治疗后,铃声柠檬酸溶液中荧光探针都装载在20分钟。细胞是一个数字化的显微镜下检查使用荧光立方体B-2A / C-excitation 450到490纳米,G-2A-excitation从尼康仪器公司510到560纳米。(美国纽约梅尔维尔)carboxy-DCF ethidium检测,分别为(31日]。荧光强度测量五个随机和不同领域/好/条件在三个独立的实验中,使用NIS元素成像软件(尼康仪器公司)。

2.7。谷胱甘肽含量的测定

2.7.1。总谷胱甘肽(GSSG谷胱甘肽+)和GSSG分析

谷胱甘肽和GSSG水平以CGNs提取使用谷胱甘肽还原酶酶方法(34]。这个分析是基于谷胱甘肽的反应和thiol-mediated生产5、5′-dithio-bis(2对硝基苯甲酸)(DTNB) 5-thio-2-nitrobenzoic酸(TNB),可检测λ= 412海里。测试是特定于谷胱甘肽由于谷胱甘肽,谷胱甘肽还原酶酶的特异性TNB积累的速率正比于样品中谷胱甘肽的浓度。短暂,细胞提取物稀释1:2 KPE缓冲区(0.1 M磷酸钾,EDTA二钠5毫米,pH值7.5)之前的刚做好DTNB(2.5毫米),谷胱甘肽还原酶(250 U /毫升)的解决方案。后的βnadph,吸光度(λ= 412海里)测量立即在30年代间隔2分钟。吸光度的变化率是相比,谷胱甘肽标准。GSSG在每个样本的测量是相同的,用于测定谷胱甘肽,但与2-VP以前治疗的样本,这反应了谷胱甘肽。

2.8。谷胱甘肽减少形式

谷胱甘肽水平测量使用monochlorobimane如前所述[35]。荧光测量使用激发和发射波长385 - 478纳米,分别使用协同HT多模标。

2.9。抗氧化酶的活性

GR活性测试使用GSSG作为基质,通过测量NADPH的消失在340海里每分钟3分钟。一个单位的GR被定义为氧化的酶量1μ摩尔NADPH /分钟。GST活性化验混合物中含有谷胱甘肽和CDNB和测量光密度的增加在340海里每分钟3分钟。一个单位的销售税被定义为轭合物的酶量1μ每分钟CDNB摩尔与谷胱甘肽。总SOD活性化验spectrophotometrically在560海里的方法使用黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶试剂代超氧化物阴离子和电视台的指标(28]。的蛋白量抑制最大电视台减少到50%被定义为1 U的SOD活性。所有的活动都表示为U /毫克的蛋白质。

2.10。采用定位Nrf2

CGNs被播种在12-well板块包含玻璃盖玻片处理0.025% poly-l-lysine和增长了9天。姜黄素增加了1、4、6、16、24小时或24小时之前氯高铁血红素治疗。接下来,细胞用磷酸缓冲盐(PBS)和固定4%多聚甲醛在室温下15分钟,permeabilized 0.5% triton x - 100 20分钟,阻止了3% bsa - 0.5% triton x - 100 - 3%马血清,和孵化anti-Nrf2抗体(1% bsa - 1% triton x - 100)在室温下为2.5 h。盖玻片是孵化一夜之间在黑暗中在4°C FITC共轭二次抗体和PBS洗。核复染色溶液为0.2μg / mL赫斯特33258染色1分钟,安装在一个幻灯片使用Fluoromount水安装介质(36]。倒置荧光显微镜(尼康Eclipse ts - 100 f)是用于B-2A / C滤波器对FITC荧光和UV-2A滤波器对赫斯特的信号。这些照片是用尼康数码视觉DS-Fi 1相机获得的。五个随机图像被为每个条件的三个独立的实验。NIS元素成像软件(尼康仪器Inc .)是用于量化。

2.11。核提取和Nrf2绑定活动分析

核细胞提取物是从CGNs准备使用活动主题的核提取设备根据制造商的指导方针。蛋白质浓度测定样本中使用Bio-Rad蛋白质测定染料试剂。固定化的ELISA-based试验包括寡核苷酸包含consensus-binding站点(5′-GTCACAGTGACTCAGCAGAATCTG-3′)是用来测量Nrf2 DNA结合活性。Nrf2从20μ克核提取被允许绑定到96孔板。一个主要抗体Nrf2被用来检测Nrf2绑定。二次抗体结合合提供了比色读出450海里。核提取物COS-7细胞转染Nrf2包括积极控制。增殖细胞核抗原和缺乏蛋白质的存在被用作衡量核提取物的纯度。

2.12。统计数据

数据表示为±SEM。他们用软件分析了棱镜5(美国GraphPad,圣地亚哥,CA)由单向方差分析(方差分析)其次是Bonferroni多重比较检验或Dunnett测试,是适当的;被认为是显著的。””表示独立实验的数量。

3所示。结果

3.1。氯高铁血红素诱导细胞毒性和在CGNs ROS生产

结果表明:CGNs暴露于氯高铁血红素诱导减少浓度的可行性从20到50μ米1 h孵化后,使用两种方法:FDA荧光和MTT还原(数字1(一)和1 (b))。这些方法表现出高度的相关性(,)(图1 (c))。孵化30μM氯高铁血红素1 h细胞生存能力降低了约50%的控制量化与分析()。同时,细胞形态在明视场显微图验证(数据没有显示)。CGNs接受车辆或10 - 20μM氯高铁血红素是圆和黑暗与著名的网络流程,但细胞接受更高浓度的氯高铁血红素(30 - 50μ米)显示形态变化,常规的细胞体见过被萎缩所取代,不规则的soma和薄的存在和神经突支离破碎。后来,氯高铁血红素的氧化效果评估(数字1 (d)和1 (e))。孵化30μM氯高铁血红素荧光carboxy-DCF和ethidium增加了3.5和4.4倍(),分别指示标志着CGNs ROS增加(图1 (e))。

3.2。姜黄素预防Hemin-Induced细胞毒性和ROS生产

低浓度的姜黄素(0-40μM)未能诱导CGNs形态变化(图2(一个))。轮和暗细胞和一个网络流程是著名的整个领域。然而,姜黄素在更高浓度(50μ米)诱导形态变化等神经突薄而支离破碎的存在。细胞生存能力保持不变在浓度范围从5到30μM;然而,在50岁的可行性μM姜黄素24小时孵化后下降了20%和21%使用MTT和FDA化验,分别(图2 (b),)。姜黄素的潜在的保护作用对hemin-induced损伤评估。姜黄素显著降低hemin-induced细胞死亡在CGNs浓度测试()。预防细胞死亡的百分比是45岁,47岁和49 5、10和15μ分别为M姜黄素(图2 (c))。此外,姜黄素(5、10或15μ米)添加到文化氯高铁血红素暴露前24小时,和活性氧的生产是通过荧光测定术(数字来衡量的3(一个)和3 (b))。结果发现,姜黄素能阻止hemin-induced ROS增加(),姜黄素仅略有增加活性氧(数字3(一个)和3 (b))。有趣的是,姜黄素的预培养1或2 h和coincubation姜黄素的30μM氯高铁血红素1 h无法防止hemin-induced毒性在CGNs 24 h(数据未显示)。

3.3。姜黄素增加HO-1 CGNs表达与谷胱甘肽的水平

姜黄素诱导HO-1蛋白质含量浓度的方式(图4(一))。暴露CGNs 5μM姜黄素24 h HO-1水平增加了三倍相比,控制()。最大程度的表达式5.4——4.9倍在20到30了μ分别为M(图4(一))。此外,15μM姜黄素诱导的时间增加HO-1蛋白质含量从4 h;显著增加8、16、24 h(图4 (b),)。此外,姜黄素诱导显著增加谷胱甘肽,谷胱甘肽)+ (GSSG)水平后24小时孵化的检测姜黄素浓度(5到30μ米)浓度的方式(数字4 (c)和4 (d),)。谷胱甘肽水平也评估CGNs文化孵化与姜黄素前24小时氯高铁血红素治疗。首先,姜黄素和姜黄素+氯高铁血红素显著增加谷胱甘肽水平(图5(一个),)。氯高铁血红素显著增加GSSG水平(九倍(图)5 (b),)和(谷胱甘肽)/ (GSSG)比率下降(图5 (c),)。此外(谷胱甘肽)+ (GSSG)水平与姜黄素增加,姜黄素+氯高铁血红素,氯高铁血红素(图5 (d),)。

3.4。HO系统和谷胱甘肽合成的抑制剂废除保护姜黄素诱导的Hemin-Treated CGNs

的评估机制curcumin-induced保护,以下使用抑制剂:SnMP, HO系统的抑制剂和BSO抑制剂γ- - - - - -GCL,谷胱甘肽合成的病原反应酶。细胞被孵化15分钟和10μM SnMP然后暴露于30μ氯高铁血红素。孵化与SnMP或姜黄素单独或SnMP /姜黄素对细胞生存能力没有影响。相比之下,显然,coincubation SnMP /姜黄素有或没有氯高铁血红素显著影响CGNs和阻止细胞保护的可行性(图6(一),)。另一方面,与15 CGNs 24 h预处理μ首先在姜黄素的孵化了25μM BSO 1 h,然后接触到30μ氯高铁血红素。在这种情况下,氯高铁血红素诱导细胞死亡明显加剧引起的谷胱甘肽耗竭BSO期间()。细胞生存能力是影响孵化BSO或姜黄素单独或BSO /姜黄素(图6 (b))。

3.5。Nrf2激活了姜黄素和局部核神经元的文化

姜黄素能够带来核易位Nrf2时间。Nrf2在核本地化孵化后15μM姜黄素通过4、6 16和24小时(4 h, C 6 h, 16 h和24 h,人物7(一))。此外,信号Nrf2被孵化24 h后24 h与姜黄素(恢复时间)(C 24 h + 24 h,图7(一))。

更有趣的是,荧光信号明显Nrf2 colocalizes核信号在孵化(图16 - 24小时7(一))。同时,Nrf2显示在细胞的信号处理姜黄素(24 h(孵化)和氯高铁血红素(24 h + h, C图7(一))和24小时恢复时间(C 24 h + h + 24 h,人物7(一))。氯高铁血红素的有或没有24小时恢复时间(h + 24 h)积累Nrf2诱导无细胞核,但姜黄素preincubated时,强烈的感应水平观察(图7 (b),)。此外,使用TransAM酶联免疫试剂盒,核在CGNs Nrf2绑定活动评估控制,和15μM姜黄素24 h, 15μM姜黄素24 h(孵化+氯高铁血红素和氯高铁血红素。显著增加Nrf2活性被认为姜黄素存在时(图7 (c),),这是与采用数据(数据一致7(一)和7 (b))。COS-7细胞转染Nrf2被用作一个积极的控制(图7 (c)最后一列)的测定。这种积极的活动控制显示的可靠性试验。

3.6。姜黄素预处理诱导GR的活动,销售税,CGNs中超氧化物歧化酶(SOD)

抗氧化酶活性的测定与15细胞培养24小时μ姜黄素和处理30μ氯高铁血红素1 h。此外,酶活性测定(恢复时间)后24 h化合物都删除。GR活性、销售税和SOD在CGNs增加姜黄素处理24 h(图8)。GR活性显著增加在孵化后的恢复时间与姜黄素和姜黄素/氯高铁血红素(图8(一个),)。此外,销售税和SOD的活性只有24小时后显著增加姜黄素孵化()。无意义的增加销售税和SOD活性的观察与姜黄素/氯高铁血红素和姜黄素或cotreatment 24 h后孵化(数据的恢复时间8 (b)和8 (c))。

4所示。讨论

这项工作的目的是研究姜黄素的影响对CGNs hemin-induced损害。姜黄素保护的文化中不同的细胞和大鼠模型对各种损害已经先前描述(28,37- - - - - -39];然而,没有研究检测姜黄素对氯高铁血红素毒性的潜在保护作用的神经元。

它被描述在CGNs氯高铁血红素本身是有毒的。首先,可以积累氯高铁血红素神经元(部分是由于血红素蛋白质载体1)其次,铁^{3 +}没有损坏的主要效应,因为铁螯合剂的使用无法防止氯高铁血红素的毒性。同时,HO-1表达式不是CGNs[增强的24]。我们的数据也显示氯高铁血红素毒性,实际上增加了活性氧的生产和细胞损伤后显示1 h与氯高铁血红素的孵化。HO-1表达没有明显增加氯高铁血红素在这项工作中使用的时间和浓度(数据没有显示)。另一方面,我们已经了解到,姜黄素可以提供神经保护通过活性氧清除铁螯合物、细胞信号传导通路的调制,抑制炎症的38,40]。此外,姜黄素能穿过血脑屏障,神经神经障碍。几项研究不同实验模型的帕金森症和阿尔茨海默疾病强烈支持这些病态的姜黄素的临床应用41,42]。

基于上述数据,发现姜黄素不是有毒CGNs浓度低于50μ当孵化24小时。此外,只有预处理的姜黄素预防hemin-induced细胞死亡,和cotreatment姜黄素/氯高铁血红素未能保护神经元。发现姜黄素是有效的防止氧化损伤培养神经元只有当它被添加作为预处理。有趣的是,这个一直在观察大鼠与钾dichromate-induced肾毒性(28]但不是在大鼠5/6肾切除术的姜黄素治疗后有效逆转肾损害(5]。这可能表明,后处理只在一些体内实验研究是有效的。

此外,姜黄素仅能稍微提高ROS生产孵化24小时后,但这多酚能阻断hemin-induced ROS的形成。在这种背景下,姜黄素已被视为hormetin,因为它是一个电感的轻度应激通路的保护、维护和修复(26,27,43]。

姜黄素可以发挥保护作用的代理直接抗氧化剂或间接抗氧化剂。姜黄素的活性氧清除能力(直接抗氧化作用)主要归因于其结构为双α,β不饱和β二酮两种阿魏酸单元,通过亚甲基连接组,此外,姜黄素可以修改迁移的硫醇Keap1释放Nrf2组细胞核和诱导抗氧化酶的表达(间接抗氧化作用)1]。

在目前的研究中,姜黄素诱导HO-1在CGNs浓度和时间的方式。事实上,它被描述,姜黄素可以提高HO-1水平在不同的器官,如肾上皮细胞模型,大鼠海马神经元,星形胶质细胞,正常的人类皮肤成纤维细胞(18,27,44,45]。发现姜黄素的保护作用是阻止与SnMP暗示角色HO的保护功能,在CGNs。有证据,何鸿燊的产品反应胆绿素(迅速转化为胆红素,胆绿素还原酶)和公司能给保护大脑血管和CGNs29日,31日,46]。然而,SnMP无法加剧hemin-induced细胞死亡。这些发现表明,姜黄素诱导的表达HO-1这是一个完整的细胞抗氧化反应的一部分,参与cytoprotection。

大脑保持一个氧化还原平衡在氧化条件下通过增加谷胱甘肽水平变弱细胞损伤或死亡。谷胱甘肽是由神经元和神经胶质细胞合成,在大脑中是最丰富的可溶性抗氧化剂分子(47,48]。此外,谷胱甘肽显著保护神经元在体外从6-hydroxydopamine引起的氧化条件,N-methyl-4-phenylpyridinium离子和多巴胺(49,50]。

CGNs姜黄素显著增加谷胱甘肽的水平。此外,氯高铁血红素增加GSSG由姜黄素预处理预防水平。氯高铁血红素可以与gh交互,从而防止协会与红细胞膜氯高铁血红素51]。此外,BSO能够避免保护细胞生存能力cotreatment姜黄素和氯高铁血红素。这些结果同意在星形胶质细胞中发现的氯高铁血红素处理建议的一个关键角色astroglial谷胱甘肽在细胞对抗氧化应激在大脑中。然而,谷胱甘肽限制氯高铁血红素毒性机制仍不完全理解(22]。

一起拍摄的这些结果,我们测试了Nrf2通路是否参与了这一过程,因为感应HO-1和谷胱甘肽合成的姜黄素和许多解毒和cytoprotective酶是由Nrf2 [1,45]。在没有压力的条件下,Nrf2控制基底目标基因的表达和不断Keap1的目标通过ubiquitin-dependent 26 s蛋白酶体降解催化的方法(52]。

它已经表明,姜黄素诱导Nrf2在各种模型(4,5,27,45,53,54]。姜黄素是一种有效的催化剂Keap1-Nrf2途径,因为它是一个包含两个双迈克尔受体受体组和能够形成配合与硫醇两组(14]。发现姜黄素激活,把核本地化Nrf2 CGNs。Nrf2后容易检测到4 h和持续的时间至少24小时的接触,与明显的最大数量的Nrf2 16 h(暴露后观察。在时间方面,姜黄素显示最大激活Nrf2从8到48 h在不同模型(27,37,54]。也与类黄酮素槲皮素,核的位置Nrf2被孵化的24小时CGNs [55]。这表明在植物化学的化合物是重要的时间代谢激活Nrf2产生轻微的压力。

此外,我们还评价了姜黄素的影响在CGNs GR的酶活性,消费税和SOD cytoprotective Nrf2酶调控的途径。我们的结果表明,姜黄素能够提高这些酶的活性和预处理之前添加氯高铁血红素的能力增加。在神经元,GR的数量足以允许GSSG积累的快速减少。在氧化应激,GR保持平衡(谷胱甘肽)/ (GSSG)在细胞内氧化还原状态(56]。几个外源性物质和销售税形成谷胱甘肽结合反应,导致这些化合物解毒和排泄的细胞(47]。SOD催化过氧化物自由基的歧化作用H₂O₂然后转化为水的过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶,或酶类21]。这是与出血性中风,因为伤害降低overexpressing小鼠SOD,包括减少诱导一氧化氮合酶的表达在大脑皮层和衰减的过氧化损伤57,58]。

5。结论

我们的数据表明,姜黄素诱导Nrf2的预处理和抗氧化剂反应可能参与这种抗氧化剂对hemin-induced神经元死亡的保护作用。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这是由CONACYT 1298938支持部分,PAPIIT IN210713。作者感谢Ismael托雷斯博士,恩里克平邹博士,MVZ Atonatiuh戈麦斯连续与实验动物技术支持。

引用

1. t . Esatbeyoglu p . Huebbe i m·恩斯特et al .,“Curcumin-from分子生物学功能”,《应用化学国际版》,51卷,不。22日,第5308 - 5332页。视图:谷歌学术搜索
2. f·科雷亚,m . Buelna-Chontal s Hernandez-Resendiz et al .,“姜黄素维持心脏和线粒体功能在慢性肾脏疾病中,“自由基生物学和医学C卷,61年,第129 - 119页,2013年。视图:谷歌学术搜索
3. a . Gonzalez-Salazar e . Molina-Jijon f·科雷亚et al .,“姜黄素可以保护心脏再灌注损伤衰减的氧化应激和线粒体功能障碍,”心血管毒理学,11卷,不。4、357 - 364年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. e . Tapia诉索托,k . m . Ortiz-Vega et al .,“姜黄素诱导Nrf2核易位和阻止肾小球高血压、反渗透法,氧化剂的压力,以及减少抗氧化酶在5/6进行肾切除手术的老鼠,”氧化医学和细胞寿命ID 269039条,卷。2012年,14页,2012。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. e . Tapia z l . Zatarain-Barron r . Hernandez-Pando et al .,“姜黄素逆转肾小球血流动力学改变和氧化剂的压力在5/6进行肾切除手术的老鼠,”植物学期刊,20卷,不。3 - 4、359 - 366年,2013页。视图:谷歌学术搜索
6. j . Epstein i r·桑德森和t·t·麦克唐纳在“姜黄素作为一种治疗剂:证据来自体外,动物和人类的研究,“英国营养学杂志》上的,卷103,不。11日,第1557 - 1545页,2010年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. 唱,s·普拉萨德,v . r . Yadav et al .,“癌症细胞信号通路的目标spice-derived保健品,”营养和癌症,卷64,不。2、173 - 197年,2012页。视图:谷歌学术搜索
8. j .特鲁希略y Chirino,大肠Molina-Jijon et al .,“Renoprotective抗氧化剂姜黄素的影响:最近发现,“生物氧化还原,1卷,不。1,p。9日,2013。视图:谷歌学术搜索
9. a . Barzegar和a . a . Moosavi-Movahedi”细胞内活性氧保护效率和免费的自由基清除活性的姜黄素,”《公共科学图书馆•综合》》第六卷,没有。10篇文章ID e26012 2011。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. a . t . Dinkova-Kostova和p . Talalay”,直接和间接诱导的抗氧化性能cytoprotective蛋白质,”分子营养与食品研究,52卷,补充1,S128-S138, 2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. l . m . Reyes-Fermin s Gonzalez-Reyes n . g . Tarco-Alvarez et al .,“神经保护效应alpha-mangostin和姜黄素iodoacetate-induced细胞死亡,”营养神经科学,15卷,不。5、41、2012页。视图:谷歌学术搜索
12. r . Pinkus l·m·维纳和诉丹尼尔,”角色的氧化剂和抗氧化剂在AP-1的感应,NF -κB,谷胱甘肽S-transferase基因表达”,生物化学杂志,卷271,不。23日,第13429 - 13422页,1996年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. a·c·Anderica-Romero i g . Gonzalez-Herrera a Santamaria et al .,“Cullin 3小说在不同目标病态,”生物氧化还原,1卷,不。1,第372 - 366页,2013。视图:谷歌学术搜索
14. k . t . Turpaev“Keap1-Nrf2信号通路:监管机制和作用在保护细胞对抗外源性物质引起的毒性与亲电试剂,”生物化学,卷78,不。2、111 - 126年,2013页。视图:谷歌学术搜索
15. h·k·布莱恩,a . Olayanju c·e .·戈德林et al .,“Nrf2细胞防御通路:Keap1-dependent和独立监管机制,“生化药理学,卷85,不。6,705 - 717年,2013页。视图:谷歌学术搜索
16. c·古普塔,s·普拉萨德,j·h·金et al .,“Multitargeting姜黄素作为揭示了分子间相互作用的研究中,“天然产品报告,28卷,不。12日,第1955 - 1937页,2011年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. a . a . Canales-Aguirre, a . Gomez-Pinedo s Luquin m . a . Ramirez-Herrera m . l . Mendoza-Magana和a . Feria-Velasco“姜黄素预防农药诱导的氧化损伤对硫磷在老鼠大脑的海马,”营养神经科学,15卷,不。2、62 - 69年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. g . Scapagnini c . Colombrita m . Amadio et al .,“姜黄素激活防御基因和保护神经元免受氧化应激,”抗氧化剂和氧化还原信号,8卷,不。3 - 4、395 - 403年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. r·f·里根x, y . Wang庄,和郭y”激活星形胶质细胞细胞外signal-regulated激酶强化氯高铁血红素毒性的文化中,“神经化学杂志,卷79,不。3、545 - 555年,2001页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. s r·罗宾逊t . n .党r . Dringen通用主教,“氯高铁血红素毒性:出血性中风后大脑损伤的预防的来源,”氧化还原的报告,14卷,不。6,228 - 235年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. 氧化应激b·哈维尔“生物化学”,生化社会事务,35卷,第5部分,1147 - 1150年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. m·d·Laird c . Wakade c . h . Alleyne Jr .)和k . m . Dhandapani”Hemin-induced necroptosis就是在鼠标星形胶质细胞谷胱甘肽耗竭”自由基生物学和医学,45卷,不。8,1103 - 1114年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. t . n .党通用主教,r . Dringen s r·罗宾逊,“在星形胶质细胞氯高铁血红素的代谢和毒性,”神经胶质卷,59号10日,1540 - 1550年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. t . n .党s r·罗宾逊r . Dringen通用主教,“氯高铁血红素的吸收、代谢和毒性培养神经元,”国际神经化学,卷。58岁的没有。7,804 - 811年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. m·c·戴z h .钟黄懿慧太阳et al .,“姜黄素预防铁诱导神经毒性主要皮质神经元的衰减necroptosis,”神经学字母卷。536年,41-46,2013页。视图:谷歌学术搜索
26. d Demirovic和s i s藤”,姜黄素诱导应激反应和hormetically调节伤口愈合能力的人类皮肤成纤维细胞进行体外老化,“Biogerontology,12卷,不。5,437 - 444年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
27. c·f·利马,c . Pereira-Wilson和s . i s藤“姜黄素诱导血红素oxygenase-1在正常人类皮肤成纤维细胞通过氧化还原信号:相关性为抗衰老干预,”分子营养与食品研究,55卷,不。3、430 - 442年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
28. e . Molina-Jijon e . Tapia c Zazueta et al .,“全身的姜黄素可以防止铬(VI)肾氧化剂破坏线粒体途径,”自由基生物学和医学,51卷,不。8,1543 - 1557年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. s . Gonzalez-Reyes m . Orozco-Ibarra s Guzman-Beltran e . Molina-Jijon l .马休和j . Pedraza-Chaverri“神经保护作用的血红素加氧酶1讯息iodoacetate-induced鼠小脑颗粒神经元毒性:胆红素的作用,“自由基的研究,43卷,不。3、214 - 223年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
30. s . Guzman-Beltran美国埃斯帕达,m . Orozco-Ibarra j . Pedraza-Chaverri和a . Cuadrado“去甲二氢愈创木酸激活抗氧化途径Nrf2 / HO-1和保护小脑颗粒神经元氧化应激,”神经学字母,卷447,不。2 - 3、167 - 171年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
31. m . Orozco-Ibarra a . m . Estrada-Sanchez l .马休和j . Pedraza-Chaverri”血红素oxygenase-1感应期间防止神经损伤引起的线粒体抑制:CO和胆红素的作用,“国际生物化学和细胞生物学杂志》上第41卷。。6,1304 - 1314年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
32. j . Pedraza-Chaverri l . m . Reyes-Fermin e . g . Nolasco-Amaya et al .,“活性氧清除能力和神经保护作用α小脑颗粒神经元对3-nitropropionic倒捻子素酸”,实验和毒素的病理,卷61,不。5,491 - 501年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
33. v . p . Bindokas和a . t .石田”Conotoxin-sensitive conotoxin-resistant Ca2 +电流在鱼类视网膜神经节细胞。”神经生物学杂志》上卷,29号4、429 - 444年,1996页。视图:谷歌学术搜索
34. 拉赫曼,a Kode, s . k . Biswas”试验定量测定的二硫化谷胱甘肽,谷胱甘肽水平使用酶的回收方法,”自然的协议,1卷,不。6,3159 - 3165年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
35. j . c . Fernandez-Checa和n . Kaplowitz”使用monochlorobimane确定肝和合成谷胱甘肽水平,”分析生物化学,卷190,不。2、212 - 219年,1990页。视图:谷歌学术搜索
36. c . e . Guerrero-Beltran m . Calderon-Oliver大肠Tapia et al .,“萝卜硫素预防cisplatin-induced肾毒性,”毒物学字母,卷192,不。3、278 - 285年,2010页。视图:谷歌学术搜索
37. 郭h .江,x, y, w•杜安·h·布鲁里溃疡,和c·李,“核转录因子的激活红色的两个相关因素2 cytoprotective信号由姜黄素保护主要脊髓星形胶质细胞免受氧化毒性,”生物和医药公告,34卷,不。8,1194 - 1197年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
38. m n a . Mandal j·m·r·Patlolla l .郑et al .,“姜黄素可以保护视网膜细胞从光明氧化剂应激细胞死亡,”自由基生物学和医学,46卷,不。5,672 - 679年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
39. a . Yadav,诉Lomash, m . Samim et al .,“姜黄素封装在壳聚糖纳米粒子:砷中毒的治疗的新策略,”Chemico-Biological交互,卷199,不。1,49 - 61年,2012页。视图:谷歌学术搜索
40. n . Kelsey w . Hulick, a .冬天,e·罗斯和d . Linseman”神经花青素对线粒体氧化应激诱导细胞凋亡的影响,“营养神经科学,14卷,不。6,249 - 259年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
41. r . b . Mythri和m . m .斯Bharath”,姜黄素:一个潜在的神经保护代理在帕金森病,”当前的药物设计,18卷,不。1,第99 - 91页,2012。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
42. d .平贺柳泽t . Amatsubo s Morikawa et al .,“体内检测淀粉样蛋白β沉积using19F磁共振成像与a19F-containing姜黄素衍生物在阿尔茨海默病小鼠模型,”神经科学卷,184年,第127 - 120页,2011年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
43. m·p·马特森“激效定义”,老化的研究评论,7卷,不。1、1 - 7,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
44. r·f·里根j·陈,l . Benvenisti-Zarom”血红素oxygenase-2基因缺失变弱氧化应激在神经元细胞外暴露于氯高铁血红素,”BMC神经科学第三十四条,卷。5日,2004年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
45. e . Balogun霍克·m·p·龚et al .,“姜黄素激活血红素oxygenase-1 Nrf2基因通过调节和antioxidant-responsive元素,”生物化学杂志第3部分,卷。371年,第895 - 887页,2003年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
46. h . Parfenova c·w·莱弗勒s Basuroy j . Liu和a . l . Fedinec“抗氧化血红素加氧酶的角色、一氧化碳和胆红素在癫痫、脑循环”脑血流量和新陈代谢杂志》上,32卷,不。6,1024 - 1034年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
47. k .青山、m . Watabe和t . Nakaki“神经谷胱甘肽合成的调控,”药理科学杂志》,卷108,不。3、227 - 238年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
48. c . Mytilineou公元前克雷默,j . a . Yabut“谷胱甘肽耗竭和氧化应激帕金森症和相关疾病,8卷,不。6,385 - 387年,2002页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
49. m . b .脊柱,s . p . Squinto j·米勒,r·m·林赛和c·海曼,“保护多巴胺神经元脑源性神经营养因子与6 - hydroxydopamine N-methyl-4-phenylpyridinium离子毒性:参与谷胱甘肽系统”神经化学杂志卷,59号1,第106 - 99页,1992。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
50. l·a·h·斯托克斯d . y . Lewis h .睫毛et al .,“多巴胺神经母细胞瘤细胞毒性:谷胱甘肽耗竭byL-BSO和细胞凋亡的作用,“大脑研究,卷858,不。1,1 - 8,2000页。视图:谷歌学术搜索
51. v . e . Sahini m . Dumitrescu e . Volanschi l·贝拉和c . Diaconu“光谱和interferometrical haemin还原型谷胱甘肽的相互作用的研究中,“生物物理化学,卷。58岁的没有。3、245 - 253年,1996页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
52. t .阮、p . Nioi和c·b·皮科特“Nrf2-antioxidant响应元素信号通路及其氧化应激激活的,”生物化学杂志,卷284,不。20日,第13295 - 13291页,2009年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
53. Carmona-Ramirez, a . Santamaria j . c . Tobon-Velasco et al .,“姜黄素恢复Nrf2水平,防止喹啉段神经毒性,”《营养生物化学杂志》上,24卷,不。1、14 - 24,2013页。视图:谷歌学术搜索
54. c .杨x张、h .风扇和y . Liu“姜黄素上调转录因子Nrf2, HO-1表达和保护大鼠大脑局部缺血,”大脑研究卷,1282年,第141 - 133页,2009年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
55. f·阿雷东多,c . Echeverry j . a . Abin-Carriquiry et al .,“细胞内化后,槲皮素导致Nrf2核易位,增加谷胱甘肽的水平,并防止神经元死亡对抗氧化的侮辱,“自由基生物学和医学卷,49号5,738 - 747年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
56. r . Dringen l . Kussmaul j . m .排水沟,j . Hirrlinger和b . Hamprecht“过氧化的谷胱甘肽系统解毒比astroglial效率低于神经元细胞,”神经化学杂志,卷72,不。6,2523 - 2530年,1999页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
57. m . j . McGirt a . Parra盛h . et al .,“衰减蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的老鼠overexpressing细胞外超氧化物歧化酶,”中风,33卷,不。9日,第2323 - 2317页,2002年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
58. a .齐藤h . Kamii i加藤et al .,“转基因CuZn-superoxide岐化酶抑制没有合酶诱导实验性蛛网膜下腔出血,”中风,32卷,不。7,1652 - 1656年,2001页。视图:谷歌学术搜索

版权

版权©2013苏珊娜Gonzalez-Reyes等。这是一个开放的分布式下文章知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。