抑制核Nox4活动Plumbagin:人类羊膜干细胞增殖能力的影响

文摘

人类羊水干细胞(AFSC) multilineage分化潜力细胞疗法的新来源。然而,在体外扩张导致衰老影响分化和增殖能力。活性氧(ROS)参与了干细胞多能性的规定,增殖,分化。Redox-regulated信号转导是由空间协调控制生产的亚细胞内ROS隔间。NAD (P) H氧化酶家族,特别是Nox4,已经知道产生ROS在细胞核;然而,这个函数的机制和意义在很大程度上仍未知。在目前的研究中,我们表明,Nox4核表达(nNox4)增加在文化通道细胞周期阻滞和血清饥饿会导致同样的效果。Nox4活动的减少,获得plumbagin,减少核ROS生产和DNA损伤的发生。此外,plumbagin敞口减少nNox4和nucleoskeleton组件之间的绑定,如Matrin 3。也同样的效果观察与phospho-ERK绑定,尽管核ERK和P-ERK不变。综上所述,我们建议nNox4监管可能干细胞增殖的重要病理生理的影响通过核信号的调制和DNA损伤。

1。介绍

干细胞具有自我更新和分化能力。通过自我更新,干细胞维持干细胞的体内平衡池;通过分化、干细胞能增加终端多样化的形态和功能的细胞(1]。在组织中,大多数干细胞是在静止状态,他们受特殊的微环境保护(细分市场)2]。干细胞的沉默可能阻止DNA复制错误的积累(3和可能促进抵抗许多压力4]。细胞内ROS水平是一个关键因素,调节间充质干细胞(MSC)的静止状态(5]。类似于低氧的分压、低水平的ROS对MSC的具备干细胞利基市场的重要6]。然而,在体外干细胞的扩张意味着文化常氧条件。

事实上,MSC增殖和集落形成能力是normoxia显著增加。然而,MSC normoxia展开显示衰老增加三倍到四倍,这表明缺氧防止氧化应激衰老和蜜饯MSC长期自我更新(7]。

活性氧的积累是一种常见的发生在衰老细胞。研究表明,活性氧诱导的衰老细胞是参与抑制癌细胞增殖8]。另一方面,细胞内积累的H₂O₂在人类胎儿msc称为衰老placenta-derived多功能细胞(PDMCs)被发现,但积累并没有参与抑制癌细胞增殖。相反,H₂O₂参与改变的分化潜能衰老PDMCs [9]。

各种ROS-generating和ROS-degrading系统在不同的隔间的细胞似乎发挥重要作用。原子核本身就含有大量的蛋白质和可氧化的硫醇必不可少的转录,染色质稳定,和核蛋白质进出口,以及DNA复制和修复(10]。特定亚型的谷胱甘肽氧化酵素、谷胱甘肽S-transferases和丰富的抗氧化蛋白核,进一步支持功能的解释thiol-dependent系统至少在核是定量和定性可能也不同于细胞质中的类似的过程(11]。

ROS生成核内可能有几个重要对细胞功能的影响。活性氧可以灭活nuclear-localized磷酸酶,从而增强激酶激活。例如,氧化失活的核磷酸酶增殖激酶磷酸酶1调节ERK1/2激活(12]。过多的活性氧的生产也可能导致氧化DNA损伤。

在这个角度看,NADPH氧化酶的亚细胞定位同种型4 (Nox4)可能是特别重要的,鉴于其本构行为,不同亚型,如Nox1或Nox2,需要激活受体激动剂。然而,它的亚细胞分布仍然是有争议的,至少部分归因于缺乏足够的特定或抗体的特点。Nox4被报道不定地出现在ER (13,14),线粒体(15),细胞骨架16),质膜(17),和核18在不同的细胞类型。

其他未解决的问题包括是否Nox4利用NADPH NADH作为底物产生(18,19),无论是主要生产超氧化物或过氧化氢18,20.]。

最近,内皮细胞核已被证明产生的ROS,至少部分Nox4依赖(18,21),但其亚核的定位(在特定核细胞膜)仍不清楚22]。核Nox4也被卷入造成DNA损伤血管内皮瘤形成两方面(23)和丙型肝炎病毒感染(24]。

NADPH氧化酶Nox4是致癌的一个关键调解人H-RasV12-induced DNA损伤反应(25]。DNA损伤反应,c-H2A探测到。X疫源地分析,导致细胞老化和随后的衰老26]。

Anilkumar et al。27)发现有nuclear-localized和功能活跃的剪接变体Nox4 (Nox4D)可能有重要的病理生理的影响通过核信号的调制和DNA损伤。有趣的是,很大一部分的核Nox4D局部血管细胞的核仁。

在这项研究中,我们调查的角色Nox4-derived核ROS羊水干细胞的增殖能力(AFSC),因为它们可以被认为是代表人类干细胞,针对他们的特点,如胚胎干细胞和成年干细胞之间的中间状态。

此外,德和他的同事们(科比28]描述AFSC可以直接到广泛的细胞类型代表了三个主要的胚胎中胚层的血统,外胚层,决定性的内胚层[29日,30.]。羊水是包含一个异构人口细胞来源于胎儿组织和羊膜(31日]。在体外扩大人类干细胞获得足够的细胞数量是必要的在活的有机体内植入的目的,但它会导致衰老影响增殖和分化能力。因此,如果活性氧的作用是执行不可逆转细胞衰老,NADPH氧化酶Nox4, ROS-generating系统,似乎是一个潜在的核活性氧的来源。

在这里,我们表明,一部分Nox4 AFSC的核心所在,在氧化酶可能形成一个功能复杂的核浆p22phox和产生活性氧。此外,Nox4似乎调节DNA损伤,构成氧化应激的一部分。这里,我们评估plumbagin的影响,基于植物的萘醌直接抑制Nox4活动(32),在DNA损伤和Nox4核相互作用。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

羊膜穿刺术样本(5备份烧瓶获得不同的捐助者)Laboratorio di提供的遗传,Ospedale圣玛丽亚四星龙(Reggio Emilia、意大利)。所有样本收集病人的知情同意(母亲的年龄35)根据意大利法律和伦理委员会指导。

人类AFSC骑绝尘被孤立如前所述De et al。28]。人类羊膜穿刺术文化被胰蛋白酶化和收获进行c - kit免疫选择mac技术(Miltenyi研究,德国)。AFSC亚文化通常在1:3稀释,不允许扩大超出了70%的融合。AFSC生长在培养基(αMEM补充20%胎牛血清的边后卫,2毫米谷酰胺,100 U /毫升青霉素,100μg / mL链霉素)(从EuroClone Spa,意大利)33]。

细胞治疗plumbagin (5-hydroxy-2-methyl-1 4萘醌)或diphenyleneiodonium(西格玛奥德里奇,圣路易斯,密苏里州,美国)。

2.2。细胞生存和增殖试验

可行的细胞MTT试验进行评估,因为减少四唑盐被广泛接受为一个可靠的方法来检查细胞生存能力/扩散。细胞与肝癌和0.5毫克/毫升孵化4 h 37°C,如前所报道(34]。最后孵化,紫色甲瓒盐晶体溶解通过添加增溶溶液(盐酸异丙醇,0.01)。多井的吸收在570纳米测量板读者(Appliskan热费希尔科学,万塔,芬兰)。

2.3。细胞周期分析

检测和量化的细胞周期分布、样本包含2 - 510⁵细胞被离心收获,固定在冷乙醇,并受propidium碘(西格玛奥德里奇,圣路易斯,密苏里州,美国)流仪测定。总溶解产物,获得如下报道,受到西方墨点法和揭示anticyclin E(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国)。

2.4。制备的细胞提取

细胞中提取得到描述Maraldi et al。35]。短暂,subconfluent细胞被添加在裂解提取缓冲(20毫米Tris-Cl, pH值7.0;1%诺乃清洁剂p 40;150毫米氯化钠;10%甘油;10毫米EDTA;20毫米氟化钠;5毫米焦磷酸钠;Na和1毫米₃签证官₄)和新添加的西格玛奥德里奇蛋白酶抑制剂鸡尾酒在4°C为30分钟。用溶菌产物,通过离心,立即煮在SDS示例缓冲区或用于免疫沉淀反应实验,如下所述。

2.5。免疫沉淀反应和电泳

免疫沉淀反应进行报道他et al。36]。等量的事先批准溶解产物,其蛋白质含量是由布拉德福德的方法,在一夜之间被孵化与anti-NOX4(罗福斯生物制品有限公司,美国),antipan 14.3.3(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国)(3μg)。然后,这两个样本处理30μL 50% (v / v)的蛋白质/ G琼脂糖水泥浆(通用电气医疗集团生物科技,乌普萨拉,瑞典)在4°C温柔摇晃1 h。球团矿和20毫米Tris-Cl洗两次,pH值7.0;1%诺乃清洁剂p 40;150毫米氯化钠;10%甘油;10毫米EDTA;20毫米氟化钠;与10毫米和5毫米焦磷酸钠,一旦Tris-Cl, pH值7.4,煮在SDS示例缓冲区,和离心机。上层清液被加载到SDS-polyacrylamide凝胶涂抹在Immobilon-P膜(美国微孔,沃尔瑟姆,MA),并处理与表示抗体,免疫印迹检测到Supersignal衬底化学发光检测设备(美国皮尔斯,罗克福德,IL)。信号的定量是通过化学发光检测柯达影像站440 cf与柯达1 d图像分析软件。

2.6。核净化

人类AFSC核被他净化报道et al。37]。简单地说,5×10⁶细胞400μL核隔离缓冲区添加(10毫米Tris-HCl, pH值7.8,1%诺乃清洁剂p 40, 10毫米β巯基乙醇,0.5毫米phenylmethylsulfonyl氟化物,1μg / mL抑肽酶和亮抑酶肽,5毫米氟化钠)8分钟冰。MilliQ水(400μL)被添加到膨胀细胞为3分钟。细胞通过22码针被剪切的段落。核被离心恢复在400×g在4°C 6分钟,400年洗一次μL洗涤缓冲(10毫米Tris-HCl, pH值7.4,2毫米MgCl₂+文本)抑制剂如前所述。上层清液(包含胞质分数)进一步离心机在4000×g为30分钟。孤立的核和胞质提取物终于在裂解缓冲细胞溶解,用近,通过离心分离。

2.7。免疫印迹

免疫印迹的协议进行了描述,汉森et al。38]。

由布拉德福德蛋白质测定蛋白质提取、量化(Bio-Rad实验室、CA、美国),接受SDS-polyacrylamide凝胶电泳和被转移到Immobilon-P膜。以下使用抗体:兔子antipan 14.3.3,兔子anticyclin E,兔子anti-Nox4,兔子anti-Ki67,兔子anti-ERK1/2,山羊anti-Matrin 3,山羊anti-actin, anti-p22phox(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国)稀释1:500年,兔子anti-p44/42 ERK1/2(细胞信号技术,贝弗利,妈,美国),鼠标anti-Tubulin(西格玛奥德里奇圣路易斯,密苏里州,美国),兔子anti-Nox4 (Abcam,剑桥,英国),兔子anti-Nox4(罗福斯生物制品有限公司,美国),和鼠标anti-pH2A (Ser139)(美国Billerica的微孔,MA)稀释1:1000;peroxidase-labelled anti-rabbit,鼠标,和山羊二级抗体稀释1:3000(皮尔斯抗体,热科学;美国罗克福德,IL)。Ab稀释了包含3% BSA TBS-T pH值7.6。膜使用Supersignal衬底化学发光检测可视化工具包(美国皮尔斯,罗克福德,IL)。Antiactin抗体被用来控制蛋白质的加载。

2.8。共焦显微镜

未分化AFSC冰冷的多聚甲醛固定的20分钟4%然后permeabilized 0.1% Triton x - 100在冰冷的磷酸盐(PBS) 5分钟。Permeabilized样本然后堵塞3%的牛血清白蛋白(BSA)在PBS 30分钟在室温和孵化主要抗体(Abs)。兔兔anti-Nox4山羊anti-Matrin 3 anti-Ki67(美国圣克鲁斯,CA)(稀释1:50),和鼠标anti-pH2A (Ser139)(美国微孔,Billerica的)(稀释1:100),在含3% BSA的PBS 1 h RT被用作主要的抗体(Ab)。二次Ab稀释1:200年PBS含有3% BSA(山羊anti-mouse Alexa 647年,山羊anti-rabbit Alexa 488年,抗体和驴Alexa 488)。在PBS洗涤后,样本沾1μg / mL DAPI H₂O为1分钟,然后用抗衰落安装介质(0.21米DABCO和90%甘油0.02米三羟甲基氨基甲烷、液pH值8.0)。消极的控制由样本不主要抗体孵育,但只有二级抗体。

共焦成像进行一个尼康A1共焦激光扫描显微镜(如前所述)(39]。

光谱分析进行了排除两个信号之间的重叠或荧光染料的自发荧光背景信号的影响,正如前面所示(40]。共焦串行部分加工与ImageJ软件均获得三维预测,如前所述[41]。渲染的图像是由Adobe Photoshop软件。

2.9。核ROS成像

核发现了ROS nuclear-localized荧光探针为H₂O₂,核过氧化翡翠1 (NucPE1) [42- - - - - -45]。对所有实验,5μM NucPE1的解决方案(从5毫米股票在DMSO)在PBS /葡萄糖。细胞被保存在一个孵化器(37°C, 5%的公司₂)过程中所有的实验。探测器孵化了30分钟。荧光测量在多井板读者(Appliskan,热科学)使用488纳米过滤励磁和535纳米过滤排放。

共焦荧光成像研究进行一个尼康A1共焦激光扫描显微镜。激发NucPE1-loaded细胞在488纳米是一个基于“增大化现实”技术的激光和排放收集在535海里。所有图片收集在一个实验同时使用相同的显微镜设置。图像分析进行图像J。

2.10。统计分析

在体外实验进行了一式三份。定量比较,价值观被报告为平均数±标准差为每个样本一式三份分析的基础上。测试观察学习小组之间的差异的重要性,未配对的学生t以及应用。一个值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果与讨论

3.1。Nox4表达AFSC

首先我们注意到羊水干细胞表达NADPH同种型4 Nox4进入细胞核和细胞质中,与Nox1和Nox2(数据没有显示)。我们测试了不同抗体针对Nox4蛋白质为了验证这个观察。事实上,在文献中,经常使用自制抗体anti-Nox4(由伦敦朗伯斯区多克隆抗体Nox4和沙组织最常用的)(见评论(46])。另一方面,所有使用抗体显示变量比例的细胞的核本地化Nox4(图1(一)),这与其他研究数据是一致的,即Nox4被发现在核或细胞核周围的区域(18,25,47,48]。通过使用抗体从圣克鲁斯、Abcam或罗福斯,我们可以看到一个信号主要是局部细胞核内,没有核膜,演示了在小鼠肝细胞48]。关于Abcam抗体的染色了,所有的核浆除了核仁标记。罗福斯抗体结合其他perinucleolar域,而圣克鲁斯抗体显示点状的模式。

为了探讨NADPH氧化酶活动核内部,我们核选择性探针用于H₂O₂,核过氧化翡翠1(图1 (b))。检测核ROS生产这个调查表明,核内活性氧的来源有一个点状的模式类似于从圣克鲁兹Nox4之一。因此,对于免疫荧光分析,我们使用这些抗体。

同样的分析已经进行免疫印迹实验(图2(一个))。总溶解产物、胞质及核分数和上面的三个抗体报道进行了测试。

世行分析所有的抗体的核和细胞质分数确认Nox4出现在胞质及核。孵化与所有三个抗体显示三乐队在50到75 kDa,即使带强度取决于抗体是不同的。在世行,抗体罗福斯似乎认识到核Nox4 (nNox4)比别人更好,因为乐队在核蛋白质分数是最强烈的(图2(一个))。

罗福斯抗体免疫沉淀反应实验作品也。图2 (b)显示核提取物(NL)用于coimmunoprecipitation分析anti-Nox4 (IPNox4)。这个实验证实了存在Nox4核蛋白质显示Nox4和调节亚基p22phox之间的交互。此外,Nox4似乎与核基质蛋白,Matrin3,和增殖蛋白激酶ERK1/2,建议直接参与核MAPK信号调节。之前它已经被证明ERK激活(磷酸化)发生下游Nox4途径:特别是通过Ras激活在人类脐静脉内皮细胞的内质网(49)或由Src / caveolin-mediated激活在肾小管细胞50]。

3.2。调制Nox4的存在进入细胞核

ERK级联是参与细胞增殖、分化和存活。事实上核易位ERK1和ERK2至关重要基因表达和DNA复制诱导生长因子(51]。此外,在细胞核,ERK的磷酸化数组的目标,包括转录因子参与增长控制的多个方面。基于这些考虑,我们调查的影响扩散刺激在AFSC Nox4本地化。AFSC通常生长在20%血清的存在是为了诱导最佳增殖率。血清饥饿(−的边后卫)事实上影响Nox4细胞内的分布。证明了世行,如果分析数据所示3(一)和3(b),核部分Nox4 (nNox4)增加AFSC培养没有24小时的边后卫。事实上,共焦图像显示Nox4点状的模式在大多数核in-FBS样本。血清剥夺诱导也减少Nox4染色细胞溶质(数字3(一)和3(b)),而样品+的边后卫。

这个观察是一致的与数据fluorogenic探针测定核ROS。事实上核强烈沾染了探测器的数量更高文化−的边后卫(图3(c))。核ROS量化显示荧光强度的增加在缺乏的边后卫是50%左右。

羊水干细胞,经过一个星期的文化扩散缓慢,可以通过融合70%每两到三天。作为mesechymal干细胞,他们可以迅速扩张期间对文化环境的变化。特别是,MSC已经证明逐渐衰老,降低其增殖能力而在文化。的增殖曲线AFSC在我们的实验条件如图4(一),S期细胞的比例画。后的第一个3 - 4通道缓慢增长,增加扩散发生在第八段到高原州;因此,细胞可以分裂的数量迅速减少。

免疫印迹分析AFSC在文章末(图4 (b))表明,核Nox4存在显著增加细胞周期阻滞,减少细胞溶质。事实上共焦图像显示Nox4点状的模式在大多数样品的核12通道。事实上,虽然在12日通过细胞周期素E表达减少,表明停止增殖,Nox4引发了核分数。这一趋势可以观察到如果分析,如图4 (c)。

3.3。在AFSC Nox4抑制增殖的影响

为了评估Nox4抑制细胞生存能力/扩散的影响,我们使用plumbagin,基于植物的萘醌,直接与Nox4交互和抑制其活动(31日]。MTT测试显示,1 - 2μM plumbagin并不影响负面细胞生存能力,而是在2μM浓度plumbagin能够显著提高细胞增殖。在较高的浓度,plumbagin减少AFSC可行性约50 - 60%孵化(图1的一天5(一个));因此,这些浓度没有选择的实验报告。

此外,末段落(8 - 12 p) AFSC培养的2μM plumbagin更好的扩散趋势,显示为图S期细胞(图所示5 (b)),即使不总是以显著的方式。如果实验提供的相同的迹象是ki - 67染色在文化通道(图5 (c))。人类ki - 67蛋白的表达是严格与细胞增殖有关。细胞核阳性ki - 67的数量也大大减少了样本内的通道。plumbagin,染色的ki - 67是高8和12通道,而控制样品。

即使使用Nox4合成或天然抑制剂,diphenyleneiodonium (DPI)和Plumbagin,不是针对核Nox4的一部分,展示的fluorogenic探测试验,Nox4活动抑制减少核ROS生产(图6(一))。核ROS量化显示的荧光强度降低的DPI或plumbagin为50%左右。这种效应可以调节细胞增殖也通过调制的DNA的稳定性。事实上,ROS也可以激活衰老细胞的生存和途径取决于它的浓度和本地化52- - - - - -54]。评估nNox4-generated ROS能否诱导核DNA损伤,我们研究核H2A疫源地。它最近已被证明,H2AX磷酸化的状态是至关重要的,以确定DNA损伤后细胞存活(55]。

获得的活性氧产量减少,人工合成或自然Nox4抑制剂(DPI和Plumbagin),降低了组蛋白的磷酸化形式的染色H2AX,氧化应激的标记derived-DNA损害(图6 (b))。

3.4。Plumbagin Nox4核相互作用的影响

我们调查的影响Nox4抑制先前观察到核Nox4绑定网络(图2 (b))。DPI或获得的Nox4-derived ROS减少,plumbagin孵化24小时,在总溶解产物减少ERK的表达,但P-ERK水平保持不变(图7(a))。Coimmunoprecipitation Nox4显示实验,在plumbagin面前,Nox4绑定P-ERK减少(图7(b))。这个数据证实Nox4之间的联系和ERK1/2细胞核内,如图所示也在VSMC Nox4专门增加核磷酸化ERK1/2 [27),但强调直接关联的调制核激酶活性形式的ROS来源,Nox4。

也与一些nucleoskeleton分子似乎modulable Nox4抑制。事实上,CoIP Nox4 matrin 3中展示了一个减少绑定在样本plumbagin处理(图7(b))。Matrin 3,一个丰富的蛋白质内部的核矩阵,与各种功能活动。虽然很多网站发生近端核仁,核仁的内部没有明显的染色检测。另一方面,matrin 3已经证明在网站绑定DNA称为脚手架/矩阵附件区域通过与染色质重塑的相互作用来调节基因的表达。Matrin 3一直也参与转录组通过RNA加工机械和结构组织(56]。Matrin 3可以对接地方核ROS信号可能发挥其功能在特定核转录/ pre-mRNA调制域。

14-3-3蛋白可以结合多种功能不同的信号蛋白,包括激酶、磷酸酶,扮演重要的角色在一个广泛的重要监管流程,如促有丝分裂的信号转导和细胞周期控制。

有共同的主题,14-3-3蛋白调节不同的信号通路。14-3-3可以控制蛋白质的位置通过阻止核导入/导出或膜易位或两者兼而有之。此外,14-3-3可能与其它信号蛋白结合的靶蛋白,调节其衬底从[泛素化和降解57]。

Nox4活动抑制的影响通过plumbagin可能导致Nox4封存14-3-3绑定,CoIP实验为14-3-3(图所示7(c))。事实上,更长的潜伏期(72 h)与plumbagin诱发Nox4减少核内存在,而matrin 3(图模式不变7(d))。事实上,图像显示的双重染色matrin3(绿色)和Nox4(红色)。在控制情况下,叠加产生橙染色,表明高红色信号的存在,而在示例plumbagin叠加的原因只有一个绿色染色,由于anti-Matrin 3标签。

4所示。结论

我们发现Nox4同种型表达在人类AFSC,有趣的是,它到细胞核。共焦分析表明Nox4在核浆领域,不仅在核细胞膜,这表明Nox4可能参与调节DNA-mRNA ROS在特定的核区域生产加工机械。细胞周期阻滞在文化通道,AFSC表现出反向增殖率加上Nox4存在进入细胞核。此外,血清饥饿会导致同样的效果。此外,免疫沉淀反应分析表明Nox4与ERK信号,暗示在核信号通路中的作用。

抑制Nox4活动,获得与plumbagin诱发核活性氧产量下降和DNA损伤。此外,plumbagin敞口减少之间的绑定nNox4 nucleoskeleton组件。也同样的效果观察与phospho-ERK绑定,尽管核ERK和P-ERK不变。更长的潜伏期与plumbagin可能调节Nox4核表达,通过控制蛋白质定位或/和降解途径介入。综上所述,我们建议nNox4监管可能干细胞增殖的重要病理生理的影响通过核信号的调制和DNA损伤。

缩写

AFSC:	羊水干细胞
BSA:	牛血清白蛋白
DABCO:	1,4-Diazabicyclo(2.2.2)辛烷
DAPI:	4′,6-Diamidino-2-phenylindole
DPI:	Diphenyleneiodonium
EDTA:	乙二胺四乙酸
msc:	间充质干细胞
PBS:	磷酸缓冲盐
TBS:	Tris-buffered盐水
TxTBS:	triton - x - 100。

利益冲突

作者报告没有利益冲突。

作者的贡献

玛丽安娜Guida准备在体外文化和执行几乎所有的实验;Tullia Maraldi设计实验,进行实验,并起草论文;Elisa Resca参与如果实验;弗朗西斯卡Beretti IP进行实验;曼Zavatti进行统计分析;劳拉据参与分析的实验;乔凡尼b . La萨拉收集羊膜液体和病人的知情同意;为由De波尔参与起草手稿。

确认

作者感谢博士Fabrizia弗兰奇(Laboratorio di遗传,Ospedale圣玛丽亚Nuova, Viale复兴运动,80年,42100 Reggio Emilia,意大利)提供的羊水细胞样品,感谢Christopher j . Chang博士和布莱恩·c·迪金森,化学系,加州大学伯克利分校,美国,轻轻地提供核过氧化翡翠1。这项工作是支持由MIUR普林斯顿2009防:200938 xjla_002和MIUR FIRB Accordi di Programma 2010 Prot: RBAP10Z7FS。

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