文摘

连续治疗有机硝酸盐引起硝酸盐宽容和内皮功能障碍,这是参与蛋白激酶C (PKC)信号通路和NADPH氧化酶激活。我们决定是否长期管理与硝化甘油妥协异丙酚的保护作用与肿瘤坏死因子(TNF)诱导内皮细胞PKC -毒性β2依赖NADPH氧化酶激活。主要培养的人脐静脉内皮细胞和肿瘤坏死因子-治疗或治疗α(40 ng / mL)单独或在特定的PKC -β2抑制剂CGP53353 (1μ米))、硝化甘油(10μ米),异丙酚(100μ米)、异丙酚+硝酸甘油或CGP53353加硝化甘油,分别为24小时。肿瘤坏死因子-α过氧化物的含量增加,氮氧化合物(硝酸盐和亚硝酸盐),丙二醛,和硝基酪氨酸生产,伴随着p-PKC -蛋白表达增加β2、gP91phox和内皮细胞凋亡,而所有这些变化被硝化甘油进一步加强。CGP53353和异丙酚分别降低TNF -α诱导氧化应激和细胞毒性。肿瘤坏死因子- CGP53353完全预防α诱导氧化应激和细胞毒性在硝化甘油的存在与否,而异丙酚的保护作用被硝化甘油中和。得出硝化甘油组成的保护作用对肿瘤坏死因子-异丙酚α刺激内皮细胞,主要通过PKC -β2依赖NADPH氧化酶激活。

1。介绍

缺血性心脏病是许多地区死亡的主要原因。心肌梗死的死亡率仍然是重要的尽管外科技术进步和药理疗法。有机硝酸盐(硝酸甘油、精氨酸等)仍然是有用的药物,被广泛用于预防和治疗缺血性心脏病100多年(1,2]。然而,这些药物也被认为是诱导硝酸宽容经过长时间,连续的,或高剂量管理,从而导致废除临床或血流动力学反应有机硝酸盐(3),随后引起内皮功能障碍(4]。硝酸据报道,宽容和血管内皮功能障碍与增加生产活性氧(ROS)通过机制,包括增加蛋白激酶C (PKC)和NADPH氧化酶激活,以挪士解偶联在血管内皮4- - - - - -6]。有趣的是,循环proapoptotic炎性细胞因子(如肿瘤坏死因子(TNF)α),这期间增加心肌违规和动脉粥样硬化,可以促进活性氧的生产后续的诱导心肌细胞凋亡和内皮细胞凋亡7]。进一步研究表明TNF -α诱导人类内皮细胞凋亡涉及PKC激活的8]。尽管这些观察,是否有机硝酸盐加剧TNF -α诱导内皮细胞凋亡和底层机制PKC施加负面影响在这个病理仍不明朗。

的麻醉剂异丙酚表现出抗氧化性能(9),显示各模型对缺血再灌注损伤保护作用[10- - - - - -12]。我们之前报道,异丙酚剂量依赖性降低TNF -α诱导细胞凋亡的主要培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs) [13]。我们的进一步研究表明,补充精氨酸加剧了TNF -α诱导细胞毒性增强氧化应激和nitrative压力,由异丙酚治疗中和(14]。它是未知的,然而,是否通过抑制PKC -异丙酚达到这些效果β2,PKC同种型TNF -可能发挥重要作用α诱导人类内皮细胞凋亡(15]。感兴趣的,异丙酚可以激活PKC -αPKC -δPKC -ε和PKC -ξ在心肌细胞(16- - - - - -18),这可能代表一个重要的细胞机制propofol-induced保护心肌缺血再灌注损伤的设置。然而,在这些研究中,异丙酚PKC——的影响β2还没有报道,它也没有被调查在内皮细胞硝酸宽容的条件。硝酸在目前的研究中,我们假设有机硝酸盐引起的公差包括异丙酚的保护作用与肿瘤坏死因子-α诱导内皮细胞的毒性。我们的数据表明,硝化甘油补充促进PKC -β2激活HUVECs受到TNF -α刺激,后来增加了NADPH氧化酶的活化和损害的保护作用对肿瘤坏死因子-异丙酚α诱导的损害。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

主要培养HUVECs将准备使用建立过程如前所述[13]。短暂,细胞胶原酶消化从脐静脉0.1% (w / v) 37°C, 20分钟后他们培养0.1% (w / v) gelatin-coated烧瓶中199年补充10%胎牛血清,15 mg / L ecg, 2毫米谷氨酰胺,青霉素100单位/毫升和100 g / mL链霉素的氛围中5%的股份有限公司2在37°C。媒介是改变了ECs每2 - 3天,直到达到融合。培养细胞被确定为ECs的形态和VIII-related抗原的存在因素是使用间接免疫细胞化学方法检测到所述[19]。HUVECs在文化的纯度高于95%,通道2 - 4被用于这项研究。

2.2。实验条件

当细胞被70%的融合,培养细胞被随机分为以下组:细胞不治疗(对照组,场骗局)或接受40 ng / mL TNF -α(肿瘤坏死因子-α集团(T)单独或TNF -α在1μ(TNF - M CGP53353(本金保证产品)α+本金保证产品组,T + C), 10μM硝化甘油(NTG) (TNF -α+ NTG集团,T + N), 100年μ异丙酚(TNF -α+异丙酚组、T + P)或NTG +异丙酚(TNF -α+ NTG +异丙酚组T + N + P), NTG + CGP53353 (TNF -α+ NTG + CGP53353集团,T + N + C),分别为24小时。在特定群体,培养细胞用异丙酚预处理前30分钟其他治疗方法。肿瘤坏死因子-的浓度α用于诱导细胞凋亡在本研究选择的基础上我们的先前的研究13),这表明TNF -α40 ng / mL的剂量能明显诱导血管内皮细胞凋亡。NTG采用的浓度是根据研究[20.,21),这表明,NTG的剂量10μ米可以诱导硝酸宽容。PKC -浓度的选择β2抑制剂是基于1μM CGP53353可以选择性地抑制PKC -β2激活在我们之前的研究22]。在我们的初步研究,100剂量的异丙酚μ米逆转肿瘤坏死因子-α(40 ng / mL)诱导细胞损伤,但在100剂量的异丙酚μ米本身没有造成明显的细胞凋亡在目前的实验条件下没有TNF -α刺激。因此,我们选择100的浓度μM作为进一步的治疗剂量的异丙酚机械的研究。

2.3。细胞毒性测定

将评估细胞毒性测定乳酸脱氢酶(LDH)释放(建成有限公司、南京、中国)在中除了细胞生存能力的测量使用3 - (4 5-Dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)分析根据制造商的指示。

2.4。测定脂质过氧化

丙二醛(MDA)的含量,这是一个标志的脂质过氧化反应,测量评估ECs的氧化损伤。均质化后冰生理盐水,MDA水平的细胞样本的上层清液是由硫代巴比土酸比色法使用MDA测定工具包(建成有限公司,南京,中国)作为描述(23,24]。结果表示为nanomole每毫克蛋白(nmol /毫克蛋白)。

2.5。确定的水平 , ,硝基酪氨酸

培养细胞均质在冰冷的PBS和离心机在3000克15分钟在4°C为上层的集合。浮在表面的蛋白浓度测定通过洛瑞检测设备(Bio-Rad、钙、美国)。亚硝酸盐的浓度( )和硝酸盐( ),一氧化氮(NO)的稳定的终端产品,是由格里斯反应如前所述[13]。氮氧化物含量表示为μmol / L的蛋白质。心肌 生产决定通过lucigenin化学发光法(25,26]。在上层清液样本含有黑暗lucigenin (5μ在96孔酶标M)和阅读光度计(GloMax Promega)。发光,表示为意味着光单位(MLU) /分钟/ 100μg蛋白,被记录为5分钟。心肌硝基酪氨酸水平(μg /毫克蛋白)在收集上清液测定化学发光检测通过硝基酪氨酸按照制造商的协议分析工具(美国微孔)。

2.6。通过流式细胞仪检测细胞凋亡

从凋亡细胞核DNA片段的丢失和核DNA内容可以很容易地用流式细胞术与特定核酸染色后荧光染料。简单地说,细胞( )收获和加工所描述(14]。然后Annexin-V-fluos染色的细胞进行分析使用流式细胞分析仪(贝克曼库尔特,沥青,CA)根据制造商的协议。电子补偿所需的仪器排除两个发射光谱的重叠。所有测量在同一仪器进行设置。

2.7。免疫印迹分析

培养细胞在细胞溶菌作用均质缓冲区包含Tris-HCl(20毫米,pH值7.4),氯化钠(150毫米),EDTA (l毫米),EGTA (l毫米),β-glycerolphosphate(1毫米),焦磷酸钠(2.5毫米),特里同x - 100 (1%)、PMSF(1毫米)、德勤(l毫米),亮抑酶肽(1μ抑肽酶(1 g / mL)μg / mL)和胃酶抑素(1μg / mL)。匀浆是离心机在4°C 1000 g 10分钟收集上层清液总蛋白制剂。等量的蛋白质结合5×SDS加载缓冲区,煮5分钟,然后通过10% SDS - page分离,随后转移到PVDF膜免疫印迹分析。5%无脂牛奶的膜被封锁在室温下2小时,然后孵化一夜之间在4°C主要抗体p-PKC -β2(ser660)(1: 1000年,细胞信号技术),PKC -β2(1:1000年,细胞信号技术),和gP91phox(1: 500年,圣克鲁斯生物技术)。与TBST清洗后,膜与适当的二次孵化辣根过氧化物酶(合)共轭抗体(1:5000 - 1:10000年,细胞信号技术)和发展与增强化学发光试剂(美国通用电气医疗集团)。GAPDH膜随后被reblotted(1: 2000年,细胞信号技术),结果是规范化GAPDH正确加载。

2.8。统计分析

所有的数据都表示为均值±S.E.M.意义被单向方差分析评估(方差分析)其次是图基的测试。GraphPad棱镜软件程序(GraphPad软件公司,圣地亚哥,美国)是用于统计分析。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。细胞生存能力和LDH释放

培养的内皮细胞的细胞毒性评估通过MTT实验和LDH释放。如图1(一)肿瘤坏死因子-后,细胞生存能力显著降低α刺激与控制,由异丙酚治疗逆转。硝化甘油的补充,进一步加剧了TNF -α降低诱导细胞的可行性。异丙酚的治疗有所改善,但不恢复细胞的生存能力受到TNF -α刺激在硝化甘油。相比之下,选择性的PKC抑制剂——CGP53353β2,逆转肿瘤坏死因子诱导的细胞生存能力降低α有或没有硝化甘油的存在。

(一)
(一)
(b)
(b)
图1
细胞生存能力(a)和LDH释放(b)。主要培养的人脐静脉内皮细胞要么不治疗(通过传代形成细胞(控制、场骗局)或接受TNF -α(仅40 ng / mL) (T)或与TNF -α在硝化甘油(10的存在μ米)(T + N)、异丙酚(100μ米)(T + P)、CGP53353 (1μ米)(T + C),异丙酚+硝酸甘油(T + N + P)或者CGP53353 +硝化甘油(T + N + C),分别为24小时。所有结果都表示为均值±S.E.M。 ,* 与反对。相比,T + N, T + P T + C和C T + N +, * * 与反对。相比,T + P、T + C和T + N + C。

刺激与肿瘤坏死因子-α导致显著增加LDH释放的介质培养HUVECs(图1 (b))。添加硝化甘油进一步增加TNF -α诱导LDH释放。异丙酚和TNF - CGP53353显著恢复α诱导LDH释放。相比之下,异丙酚减少但不能逆转的LDH释放水平硝化甘油的存在。

3.2。内皮细胞凋亡

刺激HUVECs与TNF -α导致显著显著增加凋亡指数(图2)。肿瘤坏死因子-硝化甘油进一步增加α诱导细胞凋亡的死亡。另一方面,CGP53353和异丙酚显著减毒细胞肿瘤坏死因子诱导细胞凋亡α。异丙酚减毒但不阻止了硝化甘油和TNF -α诱导细胞凋亡的死亡,这是深刻的减少CGP53353的治疗。凋亡指数从TUNEL染色结果的模式是类似于通过流式细胞术(数据没有显示)。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
(f)
(f)
(g)
(g)
(h)
(h)
图2
流式细胞术结果的代表人物(一)- (g)和细胞凋亡率衡量流式细胞术(h)。流仪分析中描述的方法进行。主要培养的人脐静脉内皮细胞要么不治疗(通过传代形成细胞(控制、场骗局)或接受TNF -α(仅40 ng / mL) (T)或与TNF -α在硝化甘油(10的存在μ米)(T + N)、异丙酚(100μ米)(T + P)、CGP53353 (1μ米)(T + C),异丙酚+硝酸甘油(T + N + P)或者CGP53353 +硝化甘油(T + N + C),分别为24小时。(一)- C (g)的代表,T, T + N, T + P T + N + P T + T + N + C和C,分别。所有结果都表示为均值±S.E.M。 ,* 与反对。相比,T + N, T + P T + C和C T + N +, * * 与反对。相比,T + P、T + C和T + N + C。
3.3。过氧化物和MDA生产

活性氧的生产发展和进步中发挥着重要作用的硝酸宽容和内皮功能障碍(4),我们测量过氧化物和MDA生产,这是一种脂质过氧化作用的标志。如图3,超氧化物和MDA水平显著增加HUVECs受到TNF -α刺激与对照组相比,由异丙酚的治疗或预防CGP53353。添加硝化甘油进一步提升超氧化物和MDA的生产,由异丙酚治疗但逆转CGP53353中和治疗。

(一)
(一)
(b)
(b)
图3
肿瘤坏死因子的影响,α、硝化甘油和CGP53353 MDA (a)和(b)过氧化物生产。主要培养的人脐静脉内皮细胞要么不治疗(通过传代形成细胞(控制、场骗局)或接受TNF -α(仅40 ng / mL) (T)或与TNF -α在硝化甘油(10的存在μ米)(T + N)、异丙酚(100μ米)(T + P)、CGP53353 (1μ米)(T + C),异丙酚+硝酸甘油(T + N + P)或者CGP53353 +硝化甘油(T + N + C),分别为24小时。所有结果都表示为均值±S.E.M。 ,* 与反对。相比,T + N, T + P T + C和C T + N +, * * 与反对。相比,T + P、T + C和T + N + C。
3.4。氮氧化物和硝基酪氨酸生产

我们下一个确定的生产氮氧化物和HUVECs硝基酪氨酸。刺激肿瘤坏死因子-α氮氧化物和硝基酪氨酸生产的水平增加,硝化甘油进一步增加了水平(图4)。异丙酚治疗对氮氧化物产量没有影响细胞受到TNF -α或结合硝化甘油的刺激,但显著降低TNF -α诱导生产硝基酪氨酸。相比之下,TNF - CGP53353预防α诱导氧化氮生产和nitroglycerine-mediated氮氧化物产量的增加和逆转肿瘤坏死因子-α诱导生产硝基酪氨酸是否在硝化甘油。

(一)
(一)
(b)
(b)
图4
肿瘤坏死因子的影响,α、硝化甘油和CGP53353氮氧化物(a)和硝基酪氨酸(b)生产。主要培养的人脐静脉内皮细胞要么不治疗(通过传代形成细胞(控制、场骗局)或治疗肿瘤坏死因子-α(仅40 ng / mL) (T)或与TNF -α在硝化甘油(10的存在μ米)(T + N)、异丙酚(100μ米)(T + P)、CGP53353 (1μ米)(T + C),异丙酚+硝酸甘油(T + N + P)或者CGP53353 +硝化甘油(T + N + C),分别为24小时。所有结果都表示为均值±S.E.M。 (一)* 与反对。相比,T + N, T + P T + N + T + C、P和* * 与T + N相比,T + P和T + N + P;(b) * 与反对。相比,T + N, T + P T + C和C T + N +, * * 与反对。相比,T + P、T + C和T + N + C。
3.5。蛋白质的表达p-PKC -β2和gP91phox

我们之前发现PKC -β2激活TNF -中发挥了至关重要的作用α在内皮细胞诱导氧化应激(27,进一步的研究表明,gP91phox但不是p22phox TNF -发挥了重要作用α诱导活性氧的生产和HUVECs凋亡[15]。因此,我们目前的研究测量p-PKC的蛋白表达β2gP91phox, NADPH氧化酶膜单元之一,催化过氧化物的生成和活性氧的主要来源在心血管系统(28]。如图5的蛋白质表达p-PKC -β2和gP91phox显著增加HUVECs受到TNF -α刺激作为对照组的相比,由异丙酚的治疗或预防CGP53353。添加硝化甘油p-PKC——进一步增加了蛋白表达β2gP91phox,由异丙酚治疗中和但CGP53353治疗逆转。

(一)
(一)
(b)
(b)
图5
肿瘤坏死因子的影响,α的蛋白表达、硝化甘油和CGP53353 p-PKC -β2(a)和gP91phox (b)。主要培养的人脐静脉内皮细胞要么不治疗(通过传代形成细胞(控制、场骗局)或接受TNF -α(仅40 ng / mL) (T)或与TNF -α在硝化甘油(10的存在μ米)(T + N)、异丙酚(100μ米)(T + P)、CGP53353 (1μ米)(T + C),异丙酚+硝酸甘油(T + N + P)或者CGP53353 +硝化甘油(T + N + C),分别为24小时。所有结果都表示为均值±S.E.M。 ,* 与反对。相比,T + N, T + P T + C和C T + N +, 与反对。相比,T + P、T + C和T + N + C。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们研究了异丙酚的保护作用与肿瘤坏死因子-α人类脐静脉内皮细胞诱导毒性硝酸存在与否的宽容。我们表明,异丙酚抑制或阻止TNF的不利影响α培养的内皮细胞的刺激。此外,我们的研究结果表明,长期治疗与硝化甘油进一步加剧了TNF -α通过促进PKC诱导细胞毒性β2激活,随后增加NADPH氧化酶的活化,并最终中和异丙酚的保护作用。这是第一个研究表明PKC -的作用β2在硝酸硝化甘油诱导激活宽容,妥协异丙酚在内皮细胞的保护作用受到TNF -α刺激。

内皮功能障碍是与多种心血管疾病,如高胆固醇血症、动脉粥样硬化、高血压、糖尿病和心脏衰竭(见审查(29日])。关系一直建议之间存在炎症和内皮功能障碍(30.]。肿瘤坏死因子-α最重要的促炎细胞因子之一,是众所周知的增加内皮细胞活性氧产量和随后诱导内皮功能障碍(31日]。这也证明了我们本研究表明TNF -α导致显著增加LDH的释放和细胞凋亡,伴随着超氧化物和氮氧化物产量增加,脂质过氧化产物MDA的水平升高,并增加生产硝基酪氨酸、硝化产品由peroxynitrite-mediated硝化酪氨酸残基的蛋白质。所有这些变化除氮氧化物生产被抑制或预防异丙酚、麻醉与证明抗氧化性能(9]。然而,异丙酚的精确机制减弱TNF -α诱导氧化应激、内皮功能障碍尚不清楚。

内皮细胞NADPH氧化酶是血管过氧化物的主要来源,是与各种血管疾病(附带的氧化应激32,33]。NADPH氧化酶gp91phox包含两个膜结合型子单位(Nox2)和p22phox细胞质子单元,如p47phox p67phox和低分子量G蛋白(rac 1和rac 2) [34]。许多蛋白激酶通路参与了NADPH氧化酶激活的规定,其中PKC家族似乎在这一过程中发挥重要作用[35]。PKC -β激活已被证明在NADPH氧化酶激活扮演重要或关键角色(36,37]。有趣的是,PKC -β2是最好是调节在没有人类的心38),它是伴随着TNF -水平上升α生产(39和NADPH氧化酶激活40]。因此,PKC -β2和NADPH氧化酶相互作用可能起着至关重要的作用在调节细胞损伤情况与肿瘤坏死因子-增加有关α生产,如AMI、心脏衰竭和糖尿病,以及在使用体外循环心脏手术。在目前的研究中,异丙酚预防肿瘤坏死因子-α诱导的超表达p-PKC -β2和gP91phox内皮细胞。的兴趣,PKC的选择性抑制剂β2CGP53353已经与异丙酚类似的效果。因此,我们认为,异丙酚保护内皮细胞虽然抑制PKC -β2激活信号通路,包括NADPH氧化酶的抑制作用。

虽然有报道PKC参与NADPH氧化酶激活TNF -后α刺激培养HUVECs [8硝酸),特别是在公差条件,涉及的主要或特定的PKC同种型和精确的调节机制仍然未知。我们之前的研究已经表明PKC -β2但不是PKC -δ同种型途径激活ROS生产中扮演了主要角色在这种情况下(15]。然而,一项新发现在目前的研究表明,PKC -β2激活参与NADPH氧化酶激活条件下硝酸宽容,一个众所周知的现象,临床或血流动力学反应有机硝酸盐(如硝酸甘油、精氨酸)减毒或废除经过长时间,连续的,或硝酸高剂量治疗(见审查(2])。在目前的研究中,补充的硝化甘油进一步增加了内皮细胞的凋亡和激活PKC -β2诱导肿瘤坏死因子-α刺激,伴随着增强gP91phox和ROS水平生产,逆转的选择性抑制PKC -β2CGP53353。这表明,过度激活PKC -β2和随后激活NADPH氧化酶苍白的一个关键的角色在硝酸宽容引起副作用。感兴趣的,异丙酚治疗逆转过氧化物水平的增加,MDA,硝基酪氨酸,PKC蛋白表达升高β2gP91phox, LDH释放以及细胞凋亡后的内皮细胞肿瘤坏死因子-α刺激。然而在硝化甘油政府的存在,异丙酚减毒,但不能完全阻止这些变化引起的肿瘤坏死因子-α刺激。这意味着长期用硝酸甘油治疗中和异丙酚的保护作用。

总之,从目前的研究结果表明,硝酸容忍进一步加剧了TNF -α诱导人血管内皮细胞损伤,以及通过PKC - ROS增加生产β2依赖激活内皮NADPH氧化酶,异丙酚被硝化甘油损害政府的保护作用在实验设置与持久性相关TNF -α刺激。进一步的研究需要执行与赤字的内皮细胞靶向激酶酶来源于基因敲除动物或基因沉默与特定的反义确认当前研究的结果。

作者的贡献

Shaoqing Lei,等候苏写的论文。Shaoqing Lei,等候苏、徐金近Zhengyuan夏,中原夏,惠民Liu Qing-jun杨Yun Du,鑫桥进行了研究。Shaoqing Lei,等候苏Zhengyuan夏,夏中原,惠民刘了讨论和审查/编辑稿件。夏家刘、杨Qing-jun和Zhengyuan设计研究,回顾了数据,修订后的手稿。Shaoqing Lei和苏等候了同样的工作。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

本研究由国家自然科学基金支持的中国(国家自然科学基金委81270899,81270196)和部分心血管麻醉医师协会(SCA)研究起动器。