槲皮素诱导线粒体介导的细胞凋亡和保护人类胶质母细胞瘤U373MG细胞自噬

文摘

槲皮素是一种饮食类黄酮与已知的抗肿瘤效应对几种类型的癌症通过促进凋亡细胞死亡和诱导细胞周期阻滞。然而,U373MG恶性神经胶质瘤细胞突变型p53表达对24 h槲皮素治疗。在这项研究中,槲皮素的抗癌效果评估这是U373MG细胞和槲皮素被发现显著有效的抑制癌细胞增殖U373MG细胞浓度的方式在48和72 h的孵化。槲皮素诱导U373MG通过凋亡细胞死亡,细胞数量的增加证明了sub-G1阶段,支离破碎的细胞核,线粒体膜电位降低,蛋白水解激活caspase-3和caspase-7 caspase-3和9活动的增加,降解的聚(ADP-ribose)聚合酶蛋白。此外,槲皮素激活物和p53的表达增加,转移到线粒体,同时导致线粒体细胞色素c的释放到胞质。我们还发现槲皮素诱导自噬。自噬抑制剂预处理与氯喹,大力增强U373MG细胞凋亡,表明槲皮素诱导保护性autopagy U373MG细胞。

1。介绍

胶质母细胞瘤是最常见的原发性脑肿瘤成年人和最致命、最成功治疗肿瘤。绝对低发病率结合发病率高,不良反应率,生存时间短造成临床试验执行的实际问题(1]。只有不到30%的病人患有这种毁灭性疾病存活12 - 15个月,即使接收多通道治疗如手术切除、化疗和放疗相结合,和辅助化疗2]。这些观察强调需要替代疗法有效地预防和治疗胶质母细胞瘤。

槲皮素是一种抗氧化类黄酮无所不在地分布在植物。其抗癌效果已被归因于抗氧化活性,抑制酶的活化致癌物质,修改信号转导途径,与受体的相互作用和其他蛋白质(3]。槲皮素是一种抗癌剂在许多癌症模型(4- - - - - -12]。几项研究已经报道,槲皮素通过抑制胶质母细胞瘤治疗的疗效增加PI-3-kinase-Akt通路(13),诱导细胞凋亡,减少细胞凋亡抑制蛋白(XIAP) [14),阻塞信号传感器和转录激活3 (STAT3) [15),G2检查站逮捕细胞的细胞周期,和减少神经胶质瘤细胞的有丝分裂指数16]。这种胶质母细胞瘤细胞中槲皮素的影响似乎依赖于肿瘤坏死细胞类型,因为联合应用factor-related凋亡诱导配体(TRAIL)和槲皮素强烈降低U87MG的可行性,U251 A172, LN229神经胶质瘤细胞,但不能减少U373MG细胞的生存能力(17]。抵抗quercetin-TRAIL-mediated U373MG细胞凋亡的原因并不完全理解。灭活p53在quercetin-TRAIL-mediated凋亡并不重要,因为敏感U251和完全抗U373MG细胞p53突变。

还存在细胞凋亡是细胞程序性死亡的,是半胱氨酸蛋白酶切割目标蛋白质在天冬氨酸。p53是一种转录因子,诱导proapoptotic基因的表达(18,19,激活p53诱导肿瘤抑制细胞凋亡是一种重要的机制。线粒体突变型p53的本地化和证据表明p53 transcription-independent或mitochondria-targeted凋亡问题受到越来越多的重视。p53的一小部分把之前线粒体线粒体膜电位的变化,细胞色素c的释放和激活还存在的20.- - - - - -22]。先前的研究表明细胞相互之间可能发生线粒体和核p53。Heyne et al。23]表明p53基因突变作为一个单体的蛋白质存在于线粒体和唐et al。24]表明,突变型p53把线粒体UVB-irradiated小鼠皮肤细胞癌。Mahyar-Roemer et al。25]表明p53突变体存在于线粒体凋亡信号独立的。历经甲级et al。26)报道,p53结合Bcl-xL通过dna结合域和突变型p53 R273H不能绑定Bcl-xL,因此无法直接激活细胞凋亡的线粒体途径虽然是局部或线粒体。然而,通过transcription-independent p53突变也可以诱导细胞凋亡通路,p53突变体和野生型p53是暂时性的位于线粒体和线粒体膜电位的变化(27]。此外,一些这样的转录受损p53突变体(例如,结构性突变R175H和DNA突变体接触R273H和C277F)贝克体外结合,这是与他们oligomerize Bak和诱导细胞色素的能力从孤立的线粒体释放28]。我们质疑突变型p53 R273H影响线粒体功能在人类神经胶质瘤胚细胞瘤细胞。

在这里,我们解决的问题是否自噬与细胞凋亡有密切关系在U373MG槲皮素引起的细胞。自噬是一种进化保守和基因编程的过程,降低长寿细胞蛋白质和细胞器。自噬的作用在癌症非常复杂而有争议的。自噬被认为是肿瘤抑制在癌症发展但在癌症恶化[有利于肿瘤细胞的生存29日]。另外,自噬可以防止肿瘤细胞死亡在营养不足,通过抑制细胞凋亡,细胞凋亡在自噬是预防30.- - - - - -32]。无论他们促进细胞存活或细胞死亡,两个进程进行复杂和分子相声知之甚少33)和诱导细胞凋亡和抑制保护性自噬已成为癌症治疗的一种有效手段。,目的是探索槲皮素的有效抗癌活性,我们重新评估,诱导细胞死亡的槲皮素在不同浓度和孵育时间和检测自噬在p53突变quercetin-induced凋亡的作用U373MG细胞。我们的研究结果首次证明槲皮素抑制U373MG细胞通过调节凋亡和自噬的扩散通量。Quercetin-induced U373MG细胞的细胞毒性增强,自噬被槲皮素治疗前。因此,抑制自噬必须考虑治疗方法减少U373MG核扩散和槲皮素治疗的一个有前途的战略使敏感细胞。

2。材料和方法

2.1。试剂

杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM) trypsin-EDTA,胎牛血清(的边后卫)、青霉素、链霉素,Alexa萤石488山羊anti-rabbit免疫球蛋白(H + L)和赫斯特33342年染料从英杰公司购买生活技术,Inc .(美国纽约大岛)。二甲基亚砜(DMSO)和麻省理工获得Amresco(美国克利夫兰,哦)。槲皮素、氯喹、propidium碘(π)、吖啶橙,LC3II抗体购自西格玛化工有限公司(圣路易斯,密苏里州,美国)。物、phospho-JNK p53, Beclin-1,细胞色素c,裂解聚(ADP-ribose)聚合酶(PARP)和caspase-3, 7和9抗体从细胞信号技术获得的(美国贝弗利,MA)。多克隆anti-caspase-8购买从研发系统(明尼阿波利斯,美国)。BD Mitoscreen (JC-1)装备从收购BD生物科学(美国新泽西富兰克林湖)。BCA蛋白质分析工具得到从皮尔斯(美国罗克福德,IL)和聚偏二氟乙烯(PVDF)膜从微孔购买(贝德福德,妈,美国)。荧光安装媒介购买从DAKO(伊利、英国)。其他试剂均为分析纯。

2.2。细胞培养

人类胶质母细胞瘤U373MG Tae-Hoo易教授提供的细胞被好心的美国生物技术,韩国庆熙大学(34]。U373MG细胞在DMEM培养含有10% (v / v)热灭活的边后卫,青霉素100单位/毫升和100μ克/毫升链霉素。细胞保持湿润5%股份有限公司₂孵化器在37°C。

2.3。细胞生存能力

槲皮素的影响在U373MG细胞生存能力是由MTT-based试验(35]。简而言之,对数生长期细胞收集和转移到微量滴定板(1×10⁴细胞/毫升)。细胞与不同浓度的槲皮素和/或孵化氯喹24、48和72 h。然后,0.1毫克的MTT被添加到每个和孵化4 h在37°C。中被移除,DMSO (150μL)被添加到每个溶解甲瓒晶体。盘子是读立即在570 nm日出标(Tecan、萨尔茨堡、奥地利)。可行的细胞的百分比是基于以下公式计算:的平均值(对照组−治疗组、对照组)×100%。所有结果评估在每个浓度一式三份。

2.4。细胞形态、核分裂和酸性泡状细胞器

U373MG细胞被置于12-well板块在3×10⁴细胞/毫升,用不同浓度的槲皮素和/或使用氯喹。48小时后,10μ米赫斯特33342年DNA-specific荧光染料或吖啶橙,lysotropic染料,添加到每个好,盘子被孵化10分钟37°C。染色细胞一个奥林巴斯荧光显微镜下观察(日本东京)。

2.5。流仪结果

细胞(1×10⁴细胞/毫升)镀在60毫米板和槲皮素处理(0 - 100μ米)48 h。细胞被收割,用磷酸盐(PBS),固定在70%乙醇,水化2毫米EDTA-PBS核糖核酸酶处理(25 ng / mL),和彩色propidium碘(40μ流式细胞术的g / mL)。这些细胞被沾染了10μ米吖啶橙、收获和维护在2毫米EDTA-PBS含有10%的边后卫来检测自噬。我们跟着的制造商的协议JC-1线粒体膜检测。总之,细胞治疗使胰蛋白酶化和洗1×分析缓冲区,沾JC-1 15分钟在37°C有限公司₂孵化器,洗两次1×测定在室温下缓冲。所有分析使用FACScaliber流式细胞分析仪(BD生物科学)。10000细胞/样本数据进行了分析与CellQuest软件(BD生物科学)。每个实验至少重复三次。

2.6。半胱天冬酶的活动

Caspase-3和9活动测量使用协议后的比色测定商用设备从西格玛化工有限公司和Biovision(美国加利福尼亚州圣何塞),分别。短暂,细胞细胞溶解后48 h槲皮素治疗有或没有氯喹、和整除(10μL)的上层清液被放置在一个96孔酶标包含反应缓冲区。基质添加,微型板块孵化在一夜之间37°C。活动监控是线性的p硝基苯胺在衬底上生成并与一个线性标准曲线相同的微型板块。

2.7。细胞分数和免疫印迹分析

U373MG细胞收集和清洗两次冷PBS治疗后各种槲皮素浓度。细胞被细胞溶解在裂解缓冲(50毫米Tris-HCl, pH值7.5,150毫米氯化钠,1%诺乃清洁剂p 40, 2毫米EDTA, EGTA 1毫米,1毫米衣饰归宿₃德勤,氟化钠10毫米,1毫米,1毫米PMSF, 25岁μg / mL抑肽酶,25岁μg / mL亮抑酶肽)和保存在冰30分钟。30分钟的溶解产物是离心机在13000 rpm和4°C,和上层清液储存在-70°C到使用。胞质和线粒体的提取是准备使用分数裂解缓冲(75毫米氯化钠,8毫米Na₂HPO₄,1毫米Na₂H₂阿宝₄250毫米蔗糖1毫米EDTA,和350年μg / mL洋地黄皂苷)。细胞溶解细胞被保存在冰然后离心机离心10分钟15分钟在15000 rpm和4°C。浮在表面的胞质分数。颗粒与裂解缓冲洗后,细胞溶解在裂解缓冲准备整个溶解产物。蛋白质浓度测定用BCA化验设备。整除的溶解产物(30 - 70μg蛋白)分离通过10 - 15%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳和转移到PVDF膜使用甘氨酸转移缓冲(192毫米甘氨酸,25毫米Tris-HCl, pH值8.8和20%甲醇,v / v)。阻止5%脱脂奶粉后,膜与初级孵化4 h抗体,紧随其后的是一个额外的30分钟孵化与二次抗体在牛奶含有Tris-buffered盐水和0.1%渐变20。人类anti-caspase-3 -caspase-7 -caspase-8, PARP裂解,细胞色素c,物,phospho-JNK, p53, HSP60, LC3II,和Beclin-1抗体用于1:1000稀释作为主要的抗体,和辣根peroxidase-conjugated山羊反人类的免疫球蛋白是利用二次抗体在1:5000稀释。膜被暴露在x射线胶片。发现了蛋白质乐队使用WEST-ZOL +免疫印迹检测系统(基因内区,京畿道,韩国)。

2.8。统计分析

所有结果都表示为±标准差。单向方差分析进行了使用SPSS版本。12.0为Windows 2004包(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。被认为是显著的。所有分析都是一式三份。

3所示。结果与讨论

3.1。槲皮素诱导凋亡U373MG细胞死亡

MTT试验进行了探讨槲皮素在人类胶质母细胞瘤U373MG细胞的细胞毒性的影响。如图1(一)48或72 h孵化与槲皮素减少U373MG细胞生存能力剂量依赖性的方式。观察细胞生存能力明显下降后48 h(27.63%)和72年(20.52%)的200年孵化的浓度μ米,而细胞生存能力(图24小时孵化后59.17%1 (b))。各种形态变化,如细胞收缩和冷凝以及染色质碎片显然是指出在凋亡细胞死亡。U373MG细胞治疗与不同浓度的槲皮素被赫斯特33342年染色后荧光显微镜检查评价槲皮素诱导的细胞凋亡的影响。如图1 (b)细胞显示明显的形态学变化,如浓缩和支离破碎的染色质和凋亡的身体治疗后形成的25岁,50岁,75年和100年μ槲皮素。此外,诱导细胞凋亡是表示的积累sub-G1-phase U373MG槲皮素治疗后细胞。显著增加sub-G1-phase细胞中没有观察到24小时治疗(从0 1.02%μ在100米至2.05%μ米)。然而,槲皮素浓度显著增加sub-G1人口非独立48 h后治疗(从0 0.46%μ在100米至8.48%μM;表1)。线粒体膜电位中断由于细胞凋亡(图1 (c)剂量依赖性的方式)。因为caspases-9和3是细胞凋亡的关键刽子手,我们量化使用商用工具酶的活动。因此,槲皮素剂量依赖性增加caspase-9和3活动(数据1 (d)和1 (e))。这些结果表明,槲皮素通过内在U373MG细胞发生凋亡通路通过激活caspase-3 caspase-9。

3.2。槲皮素对Apoptosis-Related蛋白表达的影响

apoptosis-related蛋白质的表达和激活的槲皮素治疗后还被西方墨点法进行进一步确定quercetin-induced细胞凋亡的机制。caspase-7和3前体蛋白质含量的下降,和proteolytically裂解caspase-7 3以及PARP水平增加,尽管没有多少改变caspase-8水平(图中可观察到2(a))。物被激活,p53蛋白磷酸化水平剂量依赖性增加槲皮素治疗后(图2(a))。物是一种增殖蛋白激酶(MAPKs)调节细胞增殖、分化和细胞凋亡36]。物直接或间接调节p53和目标基因的表达水平37]。由几个分子证据表明p53诱导细胞死亡通路独立直接涉及目标基因和转录的激活信号(21]。在我们的研究中,p53表达增加浓度依赖性,但下游p53蛋白的水平,彪马保持不变(数据未显示)因为U373MG p53突变细胞系。我们的结果表明,突变型p53在U373MG细胞可以通过transcription-independent通路诱导细胞凋亡,细胞色素c的水平增加了胞质分数,而线粒体细胞色素c的水平减少分数(数字2(b)和2(c))和线粒体膜电位下降(图1 (c))。虽然需要额外的实验来确定p53-Bcl-2 / xL交互发生完全理解quercetin-induced p53突变glioblastoma-derived细胞U373MG细胞的死亡,我们推测,结果类似于以前的数据在C33A细胞p53突变是暂时性的,位于线粒体和线粒体膜电位的变化(27]。

3.3。槲皮素在U373MG细胞诱导自噬。

我们检查了槲皮素的影响在其他细胞反应与细胞死亡,以更好地了解其抗癌效果。吖啶橙染色法是用于分析的形成酸性泡状细胞器(AVOs)或autophagolysosome液泡,之间发生融合的结果自噬体和自噬溶酶体作为一个关键的特性38]。中被发现含有大量AVOs U373MG槲皮素处理细胞(图3(一个))。流式细胞仪分析显示AVOs形成于17.35%的U373MG细胞治疗25μ槲皮素和33.9%的U373MG细胞处理75μM槲皮素,略有减少(30.04%)发生在100年U373MG细胞治疗μM槲皮素(图3 (b))。这些数据符合我们的免疫印迹分析结果的自噬蛋白LC3标志。lipidated形式的转换LC3 LC3-II (LC3-I),这是一个autophagosomal标记,将本地化和聚合LC3-II的自噬体(39]。槲皮素诱导处理长篇LC3-I (18 kDa) LC3-II (16 kDa)剂量依赖性浓度高达75μ米,但轻微下降在100年被观察到μM细胞(图处理3 (c))。这些结果表明,自噬在U373MG少主要细胞处理高浓度的槲皮素。LC3相比,Beclin-1表达式保持不变(图3 (c))。虽然在自噬Beclin-1扮演重要的角色,几项研究表明,自噬可能发生Beclin-1-independent的方式(40,41]。我们分析了细胞染上荧光LC3抗体确认槲皮素诱导自噬。据报道,槲皮素可以诱导自噬在许多不同的细胞系,如胃、膀胱、和结肠癌细胞系(6,42,43]。然而,最近的一项研究报道,槲皮素显著但没有影响凋亡诱导自噬的T98G神经胶质瘤细胞系(44),强调神经胶质瘤细胞生物学的异质性;因此,需要全面的多单元的线的研究。P53通常通过transcription-dependent调节自噬和独立的机制。一系列的p53目标基因如DRAM和AMPK积极调节自噬transcription-dependent方式(45]。然而,几项研究已经报道,细胞质p53 transcription-independent方式抑制自噬通过调查不良机制(46- - - - - -48]。需要进一步调查以确定是否增加胞质突变型p53压制在U373MG槲皮素治疗后细胞线粒体自噬通过移位,促进细胞凋亡。

3.4。抑制自噬的氯喹促进U373MG细胞凋亡

多项研究表明,自噬与凋亡相互作用。一些蛋白质,称为自噬蛋白,已经双重功能的自噬和凋亡4,35]。进一步分析槲皮素诱导的自噬信号是否prosurvival prodeath,我们与氯喹治疗U373MG细胞,一个自噬抑制剂,槲皮素治疗前2 h。通过p53氯喹在神经胶质瘤细胞系凋亡通路(49]。氯喹治疗仅显示不影响细胞的生存能力,但与槲皮素联合治疗减少细胞生存能力比槲皮素治疗(图4(一))。此外,与氯喹预处理+槲皮素导致重大sub-G1阶段细胞周期阻滞;sub-G1细胞的百分比是1.45%,5.18%,和18.68%,仅在U373MG槲皮素处理细胞,氯喹,分别用氯喹预处理+槲皮素(表2)。线粒体膜电位值与75年治疗后分别为68.0%和54.3%μM槲皮素单独和与氯喹+槲皮素预处理后,分别(图4 (b))。Caspase-9和3活动略有增加槲皮素治疗的联合治疗比单独(数字4 (c)和4 (d))。免疫印迹结果显示细胞周期分布的一个类似的趋势。我们还证实,抑制自噬促进细胞凋亡增加乳沟caspases-3和7和PARP(图4 (e))。特别是procaspase-8的蛋白水解分裂,并没有发现槲皮素治疗后,氯喹预处理后上升。综上所述,这些数据表明,抑制自噬增强在U373MG细胞凋亡细胞死亡引起的槲皮素。

4所示。结论

我们表明,槲皮素诱导细胞死亡在人类胶质母细胞瘤U373MG细胞系通过凋亡通路,这证实了还存在的乳沟,PARP, sub-G1阶段细胞周期阻滞。槲皮素也激活物和调制p53表达伴随着增加易位p53的线粒体。自噬的诱导U373MG胶质母细胞瘤细胞通过槲皮素被证实LC3II吖啶橙染色法和转换。此外,与氯喹预处理增强内在和外在槲皮素引起的凋亡细胞死亡,这表明槲皮素诱导保护性自噬在U373MG细胞。这些结果表明,槲皮素,用一个自噬抑制剂联合治疗,可能是一个很好的治疗方法以减少U373MG核扩散和可能是一个有前途的战略使敏感细胞槲皮素治疗。

确认

这项研究受到了生物产业技术发展计划、部食品、农业、林业和渔业(110137 - 3),和基本的科学研究项目通过韩国国家研究基金会(NRF)由教育部(2013 r1a1a2a10012017),韩国。

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