文摘

在这项研究中,3 BRL细胞治疗不同的Cd浓度(0、10、20和40μmol / L) 12 h和preincubated有或没有N-acetyl-L-cysteine (NAC) 30分钟(2更易/ L),和细胞治疗与Cd(0到20μmol / L),使用p38抑制剂(SB203580)、物(c-Jun NH2-terminal激酶)抑制剂(SP600125)和细胞外signal-regulated激酶(ERK)抑制剂U0126 30分钟,然后用20μmol / L Cd 12 h。氧化酶活力Cd细胞生存能力下降,SOD和浓度的方式。MDA水平增加,活性氧生成、核凝结收缩,分散在细胞形态被NAC抑制。Cd-induced凋亡被预处理与SB203580减毒,SP600125, U0126。免疫印迹结果显示,南汽预孵化影响Cd-activated MAPK通路,p38和ERK的磷酸化。Cd治疗伯灵顿的mRNA水平升高和降低的mRNA水平bcl - 2,分别。同样的效果被发现在蛋白质表达水平。这些结果表明,氧化应激和MAPK通路参与Cd-induced凋亡和职业之间的平衡——和凋亡基因(伯灵顿和bcl - 2)在Cd-induced凋亡是很重要的。

1。介绍

镉(Cd)是一种最有毒的环境和工业污染物。急性或慢性暴露于污染物诱发干扰在几位器官和组织1]。职业和环境Cd污染来源于采矿、冶金行业,和制造商的nickel-Cd电池、颜料、塑料稳定剂。人类中毒的重要来源包括香烟和食物,水,和空气污染。在细胞水平上,Cd增殖和分化的影响。它还会导致细胞凋亡。国际癌症研究机构已经把Cd列为致癌物质(2]。

大量研究显示,Cd是一个强大的诱导物的氧化应激(3),导致氧化毒性在肉用仔鸡,骨组织,鲶鱼,银主要鼠近端肾小管细胞,等等(4- - - - - -9]。Cd减少细胞生存能力通过活性氧(ROS)调解的机制(10和通过氧化应激导致细胞凋亡8]。N-acetyl-L-cysteine (NAC)是一种自由基清除剂用于确定在Cd-induced ROS的参与细胞凋亡和抑制肾近端小管损伤引起的长时间接触Cd。因此,氧化应激有重要功能Cd-induced毒性(11]。然而,氧化应激和凋亡机制的贡献Cd-induced毒性值得进一步调查。

在氧化stress-mediated凋亡的通路,增殖蛋白激酶(MAPKs)在细胞凋亡给予更多的关注。MAPKs,包括细胞外signal-regulated激酶(erk),压力激发了蛋白激酶(c-Jun NH2-terminal激酶或物),和p38 MAPK,属于一个家族对丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,协调众多复杂的细胞程序,如细胞增殖、分化,细胞死亡,以应对不同的刺激12- - - - - -14]。ERK激活生长因子,是重要的细胞生存如增殖、分化、和发展。相比之下,物和p38 MAPK参与细胞凋亡,促进细胞死亡速率(15,16]。几项研究表明,Cd激活MAPKs在神经细胞(17,18),不成熟的海马(19),和人类视网膜色素上皮细胞(20.]。Cd激活p38 MAPK和物在C6鼠胶质瘤细胞(21]。杨et al。22)建议Cd诱发的细胞凋亡垂体前叶在活的有机体内和在体外。ERK和p38 MAPK通路被发现参与上述过程。同样,hasse还et al。23)报道,单核细胞/巨噬细胞治疗Cd刺激ERK和p38 MAPK磷酸化。200 u - 937 promonocytic细胞治疗μmol / L CdCl22 h诱导细胞凋亡,快速p38 MAPK磷酸化和后期ERK的磷酸化(24]。这些报告表明,MAPK家族成员被激活的Cd暴露根据细胞类型,Cd浓度,和Cd暴露时间。在Cd-induced MAPK激活细胞凋亡的可能功能确定使用MAPK抑制剂,如p38 (SB203580)、ERK (U0126)和物(SP600125)。然而,Cd的机制激活的家庭成员MAPKs BRL 3细胞系和Cd目标是否其他信号通路负责3 BRL细胞生存仍然未知。

bcl - 2蛋白和信使rna表达水平的家庭成员,如伯灵顿和bcl - 2, Cd-induced细胞凋亡进行调查。Apoptotic-related蛋白bcl - 2家族的成员。这些蛋白质调节线粒体外膜透化作用,可以是proapoptotic(伯灵顿、贝克和坏)或凋亡(bcl - 2、Bcl-xL Bcl-w)。伯灵顿调节线粒体通路通过触发凋亡因子的释放,如细胞色素c (cyt c),从线粒体随后死亡信号(25]。bcl - 2是一种抗凋亡蛋白,通过控制线粒体膜透性调节细胞凋亡和抑制半胱天冬酶活动通过防止cyt c从线粒体释放到胞质或绑定apoptosis-activating因素损坏(26,27]。鉴于细胞凋亡bcl - 2家族成员的重要性,伯灵顿的监管和bcl - 2在Cd-induced凋亡决定是必要的。

基于这些考虑,本研究调查了Cd是否能诱导细胞凋亡。3 Cd上BRL细胞的影响和可能的氧化压力的函数,MAPK通路,bcl - 2家族成员在Cd肝毒性也决定。我们使用BRL细胞观察3 Cd的影响并探讨可能的氧化压力的函数,MAPK通路,bcl - 2家族成员在不同浓度诱导细胞凋亡的Cd和南汽。

2。材料和方法

2.1。材料

醋酸镉(CdAC2),2 -二乙酸7-dichlorofluorescein (DCFH-DA)、青霉素、链霉素,赫斯特33258年装备买来Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。异硫氰酸荧光素(FITC)膜联蛋白V凋亡检测试剂盒购自BD生物科学Pharmingen(美国圣地亚哥,CA)。杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)和胎牛血清(的边后卫)获得Gibco实验室(美国纽约大岛)。(3)- 4 5-Dimethylthiazol-2-yl 2, 5-diphenyl-tetrazolium溴化(MTT)和胰蛋白酶来自Amresco Inc .(梭伦,哦,美国)。丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD),谷胱甘肽过氧化物酶(氧化酶)试剂盒购自建成生物工程研究所(中国南京)。bicinchoninic酸(BCA)蛋白质分析工具包提供了Beyotime生物技术研究所(江苏,中国)。抗体antirat物、P-JNK ERK P-ERK, p38, P-p38,伯灵顿,bcl - 2,β肌动蛋白和辣根过氧化物酶(合)共轭山羊antirabbit免疫球蛋白g从细胞信号技术获得,Inc .(丹弗斯、马、美国)。Radio-immunoprecipitation化验(里帕)裂解缓冲来自Solarbio中国有限公司(中国,北京)。柯达x射线胶片从伊士曼柯达公司购买。(美国罗彻斯特,纽约)。细胞培养板得到从康宁公司(美国纽约康宁)。PrimerScript RT试剂盒和SYBR预混料交货Taq来自豆类生物Inc .(志贺、日本)。硝化纤维素(NC)过滤膜是笼罩Gelman科学(美国纽约港口华盛顿)。增强化学发光(ECL)从ECL微孔检测设备有限公司(美国伯灵顿,MA)。其他试剂使用本地可用的分析级。

2.2。细胞培养和治疗

使用BRL 3 a-immortalized鼠肝细胞通道10至20(中国科学院细胞、上海、中国)。3 BRL细胞在DMEM培养基培养(美国Gibco)补充100 U /毫升青霉素,100μg / mL链霉素,10%的边后卫。这些细胞被孵化有限公司在37°C下潮湿的5%2美国大气(热)。

3 BRL细胞被播种密度的2×105细胞/毫升6 -或96孔板。CdAC2溶解在distilled-deionized水原液和稀释与nonserum培养基不同浓度之前添加到细胞培养。

2.3。细胞生存能力分析

3 BRL细胞治疗0,10、20和40μmol / L Cd 12 h。在另外两个试验中,细胞与2更易/ L NAC preincubated 30分钟然后孵化20μmol / L Cd 12 h。通过MTT测定细胞生存能力评估。潜伏期后,细胞与肝癌和孵化最终浓度为0.5毫克/毫升4 h在37°C丢弃之前的媒介。然后,150年μL的DMSO溶液添加到每个好,盘子里是彻底搅拌10分钟瓶。光密度(OD)的测量在490 nm sunrise-basic ELISA读者(Tecan、奥地利)。细胞生存能力表示为OD的比例控制。

2.4。细胞形态分析

3 BRL细胞治疗0,10、20和40μmol / L Cd 12 h。在另外两个试验中,这些细胞被孵化2更易与L NAC 12 h和L pre-incubated 2更易与南京汽车30分钟,其次是孵化20μmol / L Cd 12 h。治疗后,图像被倒置相差显微镜(德国徕卡)配备快速成像系统。

2.5。赫斯特33258年染色

使用赫斯特33258年核形态进行了分析。3 BRL细胞治疗0,10、20和40μmol / L Cd 12 h。在另外两个试验中,这些细胞被孵化2更易与L NAC 12 h和L pre-incubated 2更易与南京汽车30分钟,其次是孵化20μmol / L Cd 12 h。后的培养基被治疗。这些细胞被洗两次磷酸盐(PBS)和固定在4%甲醛在4°C 10分钟。固定细胞被洗,沾5μg / mL赫斯特33258年在黑暗中在室温下15分钟,然后用PBS洗两次。细胞核形态学观察摄像头的荧光光显微镜下使用450 nm - 490 nm的过滤器。

2.6。测定细胞凋亡

3 BRL细胞被播种到six-well盘子。细胞凋亡检测使用一个细胞凋亡检测设备根据制造商的指示。3 BRL细胞治疗0到20μmol / L Cd 12 h。在其他三个实验中,这些细胞被pre-incubated 10μmol / L SB203580 SP600125, U0126 30分钟,其次是孵化20μmol / L Cd 12 h。治疗后,3 BRL细胞收集,并于100年暂停μ包含5 L的绑定缓冲μL (FITC膜联蛋白V和5μL (propidium碘(π)染料溶液。在黑暗中孵化后25°C,持续15分钟,400年μL(绑定缓冲了。然后,细胞分析FACSAria流式细胞分析仪(美国正欲,圣何塞,CA)激发和发射波长的488和605海里,分别。至少10000个细胞/样品登记。象限定位在膜联蛋白V /π点阴谋。生活(膜联蛋白V /π−−),早期凋亡(膜联蛋白V + /π−),晚期凋亡(膜联蛋白V + / PI +)和坏死(膜联蛋白V−π/ +)细胞是杰出的。因此,总凋亡比例包括细胞的百分比与荧光膜联蛋白V + /π−π膜联蛋白V + / + (28]。

每个独立的实验需要设置三个样本:无污点的细胞,FITC膜联蛋白V,和π。每个实验至少重复三次。

2.7。ROS的决心

使用稳定的细胞内ROS水平测量nonfluorescent DCFH-DA分子。乙酸分子被动扩散进入细胞,可以通过细胞内酯酶裂解产生极性二醇,保留在细胞内。相对ROS生产表示为荧光的荧光变化与相应的控制。

3 BRL细胞治疗0,10、20和40μmol / L Cd 12 h。在另外两个试验中,这些细胞被孵化2更易与L NAC 12 h和L pre-incubated 2更易与南京汽车30分钟,其次是孵化20μmol / L Cd 12 h。治疗后,收集细胞,孵化20μ摩尔在37°C / L DCFH-DA在黑暗中20分钟,然后用PBS洗两次。细胞分析在FACSAria流式细胞分析仪(美国becton dickinson)激发和发射波长的488和525海里,分别。

2.8。测定SOD活性、氧化酶活力和MDA水平

的分解产物的氧化降解细胞膜脂质,脂质过氧化的MDA通常被认为是作为一个指标。脂质过氧化是评估通过分光光度法测定MDA浓度产生的颜色与MDA在硫代巴比土酸的反应。MDA浓度表达nmol /毫克蛋白的吸光度计算硫代巴比土酸活性物质在532海里。SOD是超氧化物清道夫。确定总SOD活性的抑制率超氧化物radical-dependent cyt c减少。化验,xanthine-xanthine氧化酶系统作为过氧化物离子的来源,和吸光度决心在550海里。的值表示为U /毫克的蛋白质。氧化酶活力评估根据装备的指令通过反应H2O2+ 2谷胱甘肽→2 h2O + GSSG(氧化谷胱甘肽)。在412 nm的吸光度测定,酶活性表达为U /毫克蛋白(28,29日]。

3 BRL细胞治疗0,10、20和40μmol / L Cd 12 h。在另外两个试验中,这些细胞被孵化2更易与L NAC 12 h和L pre-incubated 2更易与南京汽车30分钟,其次是孵化20μmol / L Cd 12 h。200年治疗细胞颗粒状,细胞溶解μL细胞溶菌作用的解决方案(包含0.1 Tris-HCl和0.1% triton - 100)评估协议后脂质过氧化SOD,氧化酶和MDA测定试剂盒。

2.9。免疫印迹分析

3 BRL细胞治疗0,10、20和40μmol / L Cd 12 h。在另外两个试验中,这些细胞被孵化2更易与L NAC 12 h和L pre-incubated 2更易与南京汽车30分钟,其次是孵化20μmol / L Cd 12 h(只在ERK -和P38-related组)。治疗后,这些细胞被冷PBS洗两次,提取到里帕在冰上裂解缓冲了30分钟,然后用3 W 15 s。细胞溶解产物在12000 g离心10分钟在4°C。蛋白质含量是决定用BCA蛋白质化验设备。溶菌产物整除稀释了6×十二烷基硫酸钠(SDS)样品缓冲和煮10分钟。总共30μ克蛋白质从每个治疗12% SDS-polyacrylamide凝胶分离,然后electrophoretically转移到NC膜(民意调查,美国)。被封锁在室温下2 h后5%脱脂牛奶与0.1% Tween-20 TBS (TBST),一夜之间,膜被孵化在4°C与相应的主要抗体:兔子anti-rat抗体(物、P-JNK ERK P-ERK, p38, P-p38,伯灵顿,和bcl - 2)在1:1000年,兔子anti-ratβ在5000年1:肌动蛋白抗体。洗后用TBST(6×5分钟),膜被孵化与HRP-conjugated山羊anti-rabbit免疫球蛋白(的稀释1:5000)在室温下2 h。额外的洗后,膜是可视化使用ECL检测设备根据制造商的指示,然后暴露于x射线胶片。乐队是由标准的卷扫描微测密度术正常化措施β肌动蛋白。

2.10。定量实时聚合酶链反应(PCR)的巴克斯和bcl - 2

3 BRL细胞治疗0,10、20和40μmol / L Cd 12 h。治疗后,从3 BRL细胞RNA提取使用AXYPrep源总RNA miniprep工具包(美国Axygen)根据制造商的指示。的OD比率(OD260 / OD280)样本评估在1.8和2.0之间。互补脱氧核糖核酸的合成,900 ng总RNA的反向转录使用PrimerScript RT互补DNA试剂盒gDNA橡皮擦。RT反应后,每个样品进行了一式三份,每个反应混合物准备使用SYBR预混料交货Taq总量的20倍μl . 96孔板,cDNA片段的伯灵顿,bcl - 2,和β肌动蛋白聚合酶链反应一式三份分别放大使用ABI PRISM7500序列检测系统(美国应用生物系统公司)。反应条件如下:95°C 2分钟;5 s 95°C;40 95°C的周期5 s, 59为34°C年代,15秒和95°C;1分钟60°C;并为15秒95°C。相对基因表达在每个反应的量化计算与2−ΔΔCt方法根据制造商的指示(ABI棱镜7500序列检测系统,应用生物系统公司,美国)。

引物序列(表1根据基因的互补脱氧核糖核酸序列)的设计。所有引物合成了英杰公司中国公司(上海,中国)。

表1
实时PCR引物。
2.11。统计分析

结果统计表示为±SD方法。意义是由单向方差分析评估后适当的归一化数据转换和平衡的方差在必要时。统计分析了使用SPSS统计17.0 (SPSS Inc .)、美国); 和 分别被认为是指示意义和较高的意义。所有分析都是一式三份。

3所示。结果

3.1。细胞生存能力

确定适当浓度的Cd机制研究中,我们测量了Cd照射对细胞生存能力的影响。如图1,Cd (0μ摩尔/升到40μmol / L)浓度的方式降低细胞生存能力。20的细胞生存能力μmol / L Cd组大约有50%的的控制。因此,20μmol / L Cd的抑制效应的实验中使用。NAC(仅2更易/ L)没有明显改变细胞生存能力与控制。然而,预培养2更易/ L NAC 30分钟20减毒引起的细胞生存能力的降低μ20 mol / L Cd相比μmol / L Cd组。


图1
细胞的可行性3 BRL细胞治疗Cd和南汽。细胞治疗0μ摩尔/升到40μmol / L Cd和预处理的有或没有2更易为12 h / L南汽。数据作为三个独立实验的均值±SD表现一式三份。显著差异:* ,* * ,而控制。# ,# # ,而20μmol / L Cd组。
3.2。Cd对细胞形态的影响

相差显微镜观察在暴露于Cd(10浓度增加μ摩尔/升到40μmol / L)显示形态变化显示细胞质收缩,四舍五入,损失的细胞的完整性。NAC(2更易/ L)仅对细胞形态无显著影响与控制。Pre-incubation 2更易与L NAC 30分钟可以减弱引起的细胞毒性维持细胞完整性20μ20 mol / L Cd相比μmol / L Cd组。

apoptosis-related蛋白质和基因的检测后,BRL 3赫斯特33258年染色后观察细胞凋亡。显著的形态学变化观察细胞暴露于10μ摩尔/升到40μmol / L Cd 12 h。正常对照组的细胞出现一轮和同质核,而处理10μ摩尔/升到40μmol / L Cd表现出典型的凋亡特征,如等离子体膜起泡,细胞收缩,碎片,核染色质凝聚。细胞的荧光强度与赫斯特33258年表明,未经处理的细胞染色显示均匀分散的染色质结构。然而,细胞治疗NAC(2更易/ L)仅显示与控制细胞相比没有明显的变化。Pre-incubation 2更易与L NAC可以减弱的变化,如异常(图核内容2)。


图2
Cd和南汽诱导3 BRL细胞形态学变化。培养细胞暴露在0、10、20和40μmol / L Cd 12 h (a, b, c, d)。在另一个实验中,细胞与2更易/ L NAC pre-incubated 30分钟和孵化20μmol / L Cd或只有孵化2更易与L NAC 12 h (f和e)。(A)在治疗后,图像被奥林巴斯倒置相差显微镜。(B)之后,这些细胞被固定,沾染了赫斯特33258年,然后在荧光显微镜下观察。箭头表示形态变化(起泡细胞染色质凝结或碎片)3 BRL细胞的细胞核。酒吧规模:100μm。
3.3。Cd对细胞凋亡的影响

MAPK信号在Cd-induced凋亡的参与调查。流式细胞仪是用来区分MAPK抑制剂在细胞凋亡和坏死的影响与膜联蛋白双染色后V-FITC和π。Pre-incubation 10μmol / L SB203580 SP600125, U0126治疗前30分钟20μmol / L Cd显著降低细胞凋亡率为10.47%,14.43%,和11.47%,分别在3 BRL细胞与相应的20.6%相比20μmol / L Cd对照组(图3)。


图3
流仪分析BRL细胞治疗后3 Cd和MAKP抑制剂。细胞凋亡检测使用一个细胞凋亡检测设备。3 (A) BRL细胞治疗0到20μmol / L Cd 12 h (a和b)。在其他三个实验中,这些细胞被pre-incubated 10μmol / L SB203580 SP600125, U0126 30分钟,其次是孵化20μmol / L Cd 12 h (c, d, e)。(B)凋亡比例显示,10μmol / L p38抑制剂(SB203580),物抑制剂(SP600125)和ERK抑制剂(U0126)可以显著降低细胞凋亡。数据作为三个独立实验的均值±SD表现一式三份。显著差异:* ,* * ,而控制。# ,# # ,而20μmol / L Cd组。
3.4。Cd对ROS生成的影响

ROS生成表示为测量荧光强度在细胞分析。代表ROS在图所示的结果4。Cd (10μ摩尔/升到40μmol / L)增加ROS浓度的方式生产的水平,而pre-incubation 2更易与L NAC显著降低ROS生成由20μmol / L Cd。


图4
Cd和NAC对活性氧的影响3代BRL细胞。培养细胞暴露在0μ摩尔/升到40μmol / L Cd和预处理的有或没有2更易为12 h / L南汽。数据作为三个独立实验的均值±SD表现一式三份。显著差异:* ,* * ,而控制。# ,# # ,而20μmol / L Cd组。
3.5。Cd对SOD活性的影响、氧化酶活力和MDA水平

评估细胞内氧化剂和抗氧化剂状态、SOD活性、氧化酶活力和MDA水平进行评估在3 BRL细胞(图5)。治疗组MDA水平与20μ摩尔/升到40μmol / L Cd都显著高于对照组。Cd (20μ摩尔/升到40μmol / L)明显降低SOD活性。相比于20μmol / L Cd组,SOD活性显著增加集团pre-incubated 2更易与南汽。治疗组的氧化酶活力与10μ摩尔/升到40μmol / L Cd明显低于对照组。细胞中的氧化酶活力pre-incubated 2更易与L NAC明显高于细胞治疗20μmol / L Cd。

(一)
(一)
(b)
(b)
图5
Cd和NAC对MDA水平的影响(A), SOD活性,氧化酶活力在3 BRL细胞(B)。细胞治疗0μ摩尔/升到40μmol / L Cd和预处理的有或没有2更易为12 h / L南汽。数据作为三个独立实验的均值±SD表现一式三份。显著差异:* ,* * ,而控制。# ,# # ,而20μmol / L Cd组。
3.6。p38 Cd对蛋白表达的影响,ERK和物

与抗体免疫印迹分析,以确定Cd MAPKs的磷酸化的影响。Cd暴露在蛋白表达的影响也被观察到。免疫印迹分析表明,治疗3 BRL细胞Cd 12 h一些变化引起的。健壮的磷酸化p38和物(1/2)观察到治疗组10μ摩尔/升到40μmol / L Cd,而减少的磷酸化ERK被发现在治疗组10μ20 mol / Lμmol / L Cd。与此同时,40岁μmol / L Cd没有明显改变44 kD ERK的磷酸化但显著升高42 kD ERK的磷酸化。可以增加和p38磷酸化ERK磷酸化可以抑制NAC pre-incubation相比20μmol / L Cd组。

伯灵顿大幅提高蛋白质水平被发现在治疗组10μ摩尔/升到40μmol / L Cd。显著减少观察bcl - 2蛋白水平在治疗组10μ摩尔/升到40μmol / L Cd。(图所示的数据6)表示为比例的控制(为100%)。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图6
(一)Cd和NAC对ERK和p38磷酸化的影响3 BRL细胞。(b) Cd的效应物磷酸化和伯灵顿和bcl - 2蛋白表达水平3 BRL细胞。(c)定量分析的免疫反应性的磷酸化ERK和p38蛋白质3 BRL细胞治疗。(d)免疫反应性的磷酸化物的定量分析,伯灵顿,bcl - 2蛋白在3 Cd-treated BRL细胞。每个值表示为磷/总MAPK比例的磷酸化和OD的比伯灵顿和bcl - 2对β肌动蛋白。显著差异:* ,* * ,而控制。# ,# # ,而20μmol / L Cd组。
3.7。的影响在bcl - 2 mRNA水平的伯灵顿和Cd

转录伯灵顿和bcl - 2中观察到的变化3 Cd-treated BRL细胞。Bax mRNA水平显著升高的治疗组和10μ摩尔/升到40μmol / L Cd,峰值在10μmol / L Cd组。bcl - 2 mRNA水平在治疗组10μ摩尔/升到40μmol / L Cd显著下降。图7显示的相对定量实时PCR基因表达水平的关系β肌动蛋白。


图7
伯灵顿的相对定量实时PCR和bcl - 2基因表达水平的关系β肌动蛋白。细胞治疗0μ摩尔/升到40μmol / L 12 h。数据作为三个独立实验的均值±SD表现一式三份。显著差异:* ,* * ,而控制;# ,# # ,而20μmol / L Cd组。

4所示。讨论

在目前的研究中,Cd被证明是有毒3 BRL细胞,导致细胞生存能力降低,增加氧化应激。此外,MAPK通路和伯灵顿基因家族在Cd-induced凋亡关键功能。抗氧化剂NAC减毒的这些变化。因此,ROS海拔Cd-induced细胞凋亡的早期事件。

在这项研究中,10μ摩尔/升到40μmol / L Cd显著降低细胞生存能力。这一发现可能归因于凋亡细胞死亡。陈等人。17)报道,引起神经细胞凋亡是10μmol / L Cd,而Iryo [30.CCRF-CEM细胞治疗5中)观察细胞凋亡μmol / L Cd。5μmol / L Cd减少颗粒细胞数量和生存能力,导致染色质凝聚和DNA碎片(28]。因此,Cd在剂量高于5μmol / L对细胞有害在体外可能是因为细胞凋亡的诱导。

细胞凋亡是一个主要的模式Cd的消除受损的细胞毒性和之前坏死(31日]。在目前的研究中,形态学观察和流仪评估显示,Cd诱导3 BRL细胞的凋亡。这个观察是兼容的报告Coonse et al。32),证明了Cd治疗后细胞凋亡的发生人类Saos-2 osteoblast-like细胞系。此外,形态和生化分析表明,Cd诱发小鼠成纤维细胞的细胞凋亡33]。

Cd毒性的机制被认为会干扰细胞粘附和信号,氧化应激、细胞凋亡、基因毒性,细胞周期扰动(34]。尽管Cd在任何细胞或组织的整体效应可能是由于合作的几种机制,只有一个可能机制占主导地位在一个特定的细胞类型(28]。在这些研究中,引起的毒性表现Cd与氧化压力有关,包括脂质过氧化和活性氧的生产。先前的研究发现氧化应激可以诱导Cd。此外,Cd-induced凋亡是由氧化应激在LLC-PK1 [11]。艾登et al。31日)表明,Cd诱发氧化应激,导致生物大分子的氧化变质。Cd可能影响骨骼组织通过氧化/抗氧化平衡障碍,导致氧化应激(5]。ROS报道具有重要功能在细胞凋亡的起始。贝尔坦公司和averbeck2确认Cd可以引发活性氧生成。NAC是一种抗氧化剂和活性氧清除剂,能有效地阻止Cd-induced ERK的活化,物,和p38信号网络,防止Cd-induced细胞死亡,并显著降低Cd-induced人类晶状体上皮细胞毒性和人类视网膜色素上皮细胞(17,20.,35]。这些发现证明了细胞凋亡和细胞内ROS之间的联系。同样,陈显示Cd诱导活性氧生成,导致PC12细胞凋亡和SH-SY5Y细胞。预处理与南汽回收Cd-induced ROS和防止细胞死亡,这表明Cd-induced凋亡是由活性氧生成。因此,可以利用抗氧化剂预防Cd-induced疾病(17]。目前的研究表明,Cd引起活性氧生成和南汽Cd-induced ROS升高。ROS拾荒者、SOD和氧化酶被耗尽。脂质过氧化产物,MDA积累3 BRL细胞暴露于Cd。南汽升高SOD和氧化酶的活动。本研究的结果符合之前的报道,表明氧化应激的主要功能3 BRL细胞暴露于Cd。Cd的有毒影响最有可能是由于过量的自由基的形成,导致氧化应激,导致细胞损伤。同样,Cd可以抑制SOD和氧化酶在人类胚胎肾细胞,建议加强ROS水平(36]。Cd治疗MDA水平显著增加和减少氧化酶和SOD活动从鸡卵泡颗粒细胞28]。Cd暴露增加MDA含量,减少氧化酶SOD活动在额叶皮层和海马(37]。此外,增加曝光的酵母细胞Cd MDA水平。相比之下,SOD和氧化酶活动也高Cd-exposed细胞(7]。目前的研究发现,南汽不能阻止MDA。这些差异可能是依赖于细胞类型,刺激,Cd浓度,和Cd暴露时间。

MAPKs酶是重要的信号在控制细胞生存、增殖和分化。他们还参与细胞的许多方面的监管。兵,目前认为是激活生长因子,对细胞增殖、分化、和发展。相比之下,物和p38参与细胞凋亡,促进细胞死亡速率(15,16]。先前的研究表明,MAPK通路的激活负责Cd-induced各细胞的凋亡。据报道,Cd激活MAPKs人类视网膜色素上皮细胞(20.)和人工晶状体上皮细胞(35]。几项研究指出,Cd激活MAPKs在神经细胞(17,18]。目前的结果显示,治疗3 BRL细胞10μ摩尔/升到40μmol / L Cd 12 h导致p38的健壮的磷酸化和物(1/2)。与此同时,p38磷酸化NAC预孵化而抑制了20μmol / L Cd组。目前的研究结果表明,Cd 3 BRL细胞的凋亡诱导至少部分通过激活p38和物(1/2),可以抑制磷酸化NAC pre-incubation。因此,p38和物(1/2)参与Cd-induced细胞凋亡。此外,氧化应激可能躺p38的上游,表明其激活的关键功能。在10到20 Cdμmol / L减少ERK的磷酸化。相反,40μmol / L Cd没有明显改变44 kD ERK的磷酸化但显著升高42 kD ERK的磷酸化。增加了NAC pre-incubation ERK磷酸化,是先前的发现矛盾。ERK参与在几个细胞增殖和凋亡的规定(38]。兵也伴随着两个明显对立的过程。ERK在细胞增殖已经广泛的参与,以及它的功能在postmitotic细胞发生分化。根据细胞类型和刺激,兵也作为负调节细胞增殖和凋亡在其活动高度增加(38,39]。分析,这些明显的差异导致了多个函数更精确的理解和规定ERK (40]。目前的结果显示控制和40之间没有明显的变化μmol / L Cd组44 kD ERK的磷酸化。相比之下,42 kD ERK的磷酸化作用显著增加。这些结果表明,低浓度Cd导致非常规ERK的磷酸化,从而导致细胞凋亡信号。高镉浓度可以激活ERK的磷酸化。这是按照理论声称,最后细胞激活ERK的结果是依赖于细胞类型,诱发ERK的刺激,和ERK激活的时间41]。

探讨MAPK磷酸化和细胞凋亡之间的关系,与SB203580 3 BRL细胞进行预处理,SP600125, U0126治疗前30分钟20μmol / L Cd。与这些抑制剂预处理明显阻塞Cd-induced凋亡,表明p38, ERK和物参与3 BRL细胞暴露于Cd和MAPK通路在细胞凋亡是氧化应激的下游通路。同样,在人类promonocytic细胞,p38-specific抑制剂SB203580可以减弱细胞凋亡24]。SH-SY5Y和PC12细胞,抑制ERK (U0126)和物(SP600125),但不是p38 (SB203580),部分从Cd-induced保护细胞凋亡。CCRF-CEM细胞,治疗与ERK抑制剂U0126抑制Cd-induced ERK活化和细胞凋亡,而人们活动的抑制与SB203580无法保护细胞免受细胞凋亡(30.]。相比之下,SB202190 p38抑制剂,减少细胞毒性和高镉浓度诱导细胞凋亡42]。总之,一些MAPK抑制剂抑制细胞死亡和凋亡取决于Cd和抑制剂的浓度。这一发现表明,物、ERK和p38独立参与Cd-induced细胞死亡和细胞凋亡。这些结果强烈表明MAPKs 3 Cd-exposed BRL细胞有不同的功能,MAPK抑制剂可以防止Cd-induced毒性,即使其他信号通路参与Cd-induced毒性。三个主要的细胞凋亡通路参与哺乳动物细胞:线粒体,死亡受体-,内质的reticulum-mediated细胞凋亡。几项研究显示通过线粒体细胞凋亡,死亡受体,内质网途径在Cd曝光。Coutant et al。43建议Cd-induced细胞凋亡可以发生在通过caspase-dependent Boleth细胞系和独立通路。Cd-induced LLC-PK1细胞凋亡研究通过活性氧,mitochondria-linked信号通路(11]。内质网(ER)压力信号和线粒体途径调解Cd-induced睾丸生殖细胞凋亡(44]。光盘可以通过线粒体途径诱导细胞凋亡在人类胚胎肾细胞(36]。细胞凋亡通常是由coeffects控制不同的信号通路而不是任何单一途径。因此,在体外研究线粒体、死亡受体和ER在3 Cd-exposed BRL细胞通路在未来应优先。

bcl - 2家族成员被发现在调节mitochondrial-mediated凋亡起着重要的作用。bcl - 2家族是基于函数分为两组。第一组的成员,bcl - 2和Bcl-xL等抗凋亡活动和保护细胞免受死亡。相比之下,伯灵顿,不好报价,第二组的成员,显示pro-apoptotic活动(45]。此外,bcl - 2被观察到促进细胞生存保护外部线粒体膜的完整性,防止从线粒体释放cyt C,诱导细胞死亡(26]。伯灵顿是一个21 kDa蛋白质,促进线粒体膜透性,导致凋亡细胞死亡(46]。目前的研究显示,伯灵顿的增加和减少bcl - 2蛋白表达和mRNA水平。同样,周et al。11透露,bcl - 2蛋白表达可以显著减少,伯灵顿蛋白表达可以增加早在12 h后在LLC-PK1细胞暴露于Cd。Cd引发更高的伯灵顿表达和抑制凋亡bcl - 2表达从鸡卵泡颗粒细胞28]。这些结果表明,伯灵顿和差别,或者对这些基因bcl - 2通过Cd占其职业——或者对3 BRL细胞抗凋亡的影响在体外。

5。结论

光盘可以提高氧化应激和激活MAPK通路。抑制p38、物和ERK保护Cd-induced凋亡的细胞。3 BRL细胞的细胞凋亡也与bcl - 2家族有关。本研究部分阐述肝毒素的机制在体外暴露在Cd和提供机会Cd-induced肝脏疾病的治疗药物的发展。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是由中国国家自然科学基金会的资助(31101866号,31172373)和项目优先资助的学术程序开发江苏高等教育机构(PAPD)。