富含迷迭香酸的夏季香菜提取物(Satureja hortensisl .)保护Jurkat T细胞免受氧化应激

摘要

夏季开胃菜(Satureja hortensisl唇形科)在世界上一些地区被用作香料和民间药物。抗炎和细胞保护作用美国hortensis并且其富含甘氨酸酸性的酚醛馏分在动物试验中已经证明。然而，在细胞模型中对罗斯马卡酸的先前研究产生了有争议的结果。在这项研究中，我们调查了夏季咸味提取物对H的影响₂O.₂-激发人淋巴母细胞Jurkat T细胞。LC-MS分析证实了酚类组分中存在迷迭香酸和橙皮苷、柚皮苷等类黄酮。添加25µM或50µM的H₂O.₂对于细胞培养引起的氧化应激，表现为超氧化物和过氧基的产生，降低细胞活力，G0 / G1停滞，增强的细胞凋亡。乙醇和含水提取物显着减轻这种应力美国hortensis并通过部分纯化的甘氨酸馏分。含水的施用美国hortensis提取物可使细胞过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性提高一倍。H₂O.₂并通过添加进一步增强美国hortensis提取物或rosmarinic acid馏分。H.₂O.₂-Challenged Jurkat细胞可以作为研究细胞抑制植物营养效应的细胞机制的模型。

1.介绍

夏季开胃菜(Satureja hortensis)是一种草本植物唇形科在世界的几个地区烹饪和民间医学中使用的家庭[1］.在乔治亚州，一种干燥的磨碎的夏季美味(当地名称)Kondari.)是最受欢迎的香料之一，可以单独使用，也可以作为混合香料的配料。此外，从古代起，它在当地就被认为是一种治疗肠胃问题的民间抗菌药[2］.佐治亚种植了夏季咸菜的本地品种[3.］.

夏季咸味的叶子富含酚类化合物，特别是甘氨酸和黄酮类化合物，其占这些叶子的高抗氧化能力[4.那5.］.在我们对格鲁吉亚香料的之前的研究中，我们发现了Kondari.具有最高的总酚含量水平和最高的亲水抗氧化能力水平[6.］.Rosmarinic（α结果表明，- o -咖啡酰-3,4-二羟基苯基乳酸(- o -caffeoyl-3,4- di羟基苯基乳酸)是夏香和其他一些植物乙醇提取物中的主要化合物唇形科草药 [4.］.迷迭香酸是一种苯丙酸衍生物，是植物界第二常见的咖啡酸酯。

动物研究显示出抗炎活动美国hortensis提取物及其多酚馏分，特别是[7.那8.］.这种活性可能至少部分地与迷迭香酸有关，其抗炎和抗过敏特性已在动物和人体试验中得到证实[9.那10.］.Osakabe等人。[10.提示迷迭香酸的抗过敏作用可能有两个独立的机制:清除活性氧和调节炎症反应。例如，迷迭香酸的肾保护作用与提高抗氧化能力有关，包括提高谷胱甘肽含量和抗氧化酶的活性[11.］.

然而，迷迭香酸发挥抗炎作用的细胞机制尚不完全清楚，需要进一步研究。人淋巴母细胞t细胞Jurkat系是一种有效的t细胞生长因子白介素2 (IL-2)的组成物，是研究免疫信号转导的一种流行模型[12.］.Jurkat细胞可以在氧化代谢物的反应中仿死健康和炎症T细胞，例如过氧化氢[13.］.因此，研究的效果美国hortensis提取物的T细胞的增殖和活性可能有助于我们理解其抗炎和细胞保护作用的机制。虽然H.₂O.₂在抗原依赖的淋巴细胞活化中起重要作用[14.， H₂O.₂诱导氧化应激并损害T细胞活性，导致慢性炎症和细胞死亡。

Jurkat细胞对H的反应₂O.₂是依赖的。可通过细胞抗氧化系统修复的可逆氧化变化发生在H.₂O.₂浓度为20. μ细胞凋亡的第一个迹象出现在50岁μM.₂O.₂[15.］.相对高的推注剂量h₂O.₂(150μM)诱导Jurkat细胞凋亡，但低浓度H₂O.₂（2 μm）抑制凋亡过程[16.］.在暴露于100的Jurkat细胞中观察到细胞凋亡和坏死 μM.₂O.₂[17.]，虽然坏死更常见于500 μM.₂O.₂[18.］.尽管它在动物实验中有良好的细胞保护作用，但浓度高达150μm的rosmarinic酸未能防止h₂O.₂- 介导的Jurkat细胞凋亡，显示出抗氧化性质[19.］.此外，即使在没有外源过氧化氢的情况下，据报道罗马啶酸诱导Jurkat细胞的凋亡[19.那20.］.

在先前的研究中观察到的rosmarinic酸的促rosmarinic酸的偏差行为差异及其众所周知的抗氧化剂和抗炎特性妨碍了Jurkat细胞作为研究该植物营养素的作用方式的模型。在目前的工作中，我们重新审视了夏季咸味提取物和富含甘氨酸富酸的酚类级分的影响₂O.₂- 挑战Jurkat细胞。

2。材料和方法

２.１.植物材料

一种格鲁吉亚地方植物美国hortensis在从商业供应商购买的种子附近的第比利斯附近的实验情节中生长。将植物以其植物态（种子萌发后55天）收获，其特征在于酚类化合物含量，最高的黄酮含量和最大的抗氧化活性（I.Chkhikvishvili，未发表的数据）。收集的植物材料在25-30℃下在阴影中风干。将干燥的物质储存在封闭的玻璃容器中，以冷却干燥的地方。

２.２.提取和纯化

将干燥的植物材料（1g样品）用氯仿，乙酸乙酯和乙醇的植物材料与溶剂的比例依次萃取。每步的持续时间为24小时。通过在90℃下浸泡20分钟并随后逐渐冷却至室温，用水萃取残余物。将该水提取技术直接应用于干燥的植物材料制备“总水性提取物”。在低于40℃的温度下真空蒸发除去溶剂，并将提取物在-80℃下储存直至使用。为了纯化酚类级分，通过聚酰胺柱渗透总含水萃取物。用水洗涤柱，用96％乙醇洗脱纯化的级分。

２.３.液相色谱-质谱(LC-MS)分析

将纯化的酚类级分的样品溶解在HPLC级甲醇中，并通过Millex-HV Duropore（PVDF）膜过滤（0.22 μm)注入LC-MS仪器前。质谱分析进行了使用Ultraperformance LC-Quadruple飞行时间(UPLC-QTOF)仪表(水总理QTOF,米尔福德,妈,美国),与UPLC列连接在线PDA检测器(Acquity水域),然后一个女士探测器配备一个电喷雾离子源(ESI)(用于ESI-negative模式)。分离时间为2.1 × 50 mmμM UPLC BEH C18列（Waters Acquity）。

色谱和MS参数如下：流动相由水（相A）和0.1％甲酸中的0.1％甲酸（乙腈（B相）组成。线性梯度方案如下：100％至95％超过0.1分钟，95％至5％超过9.7分钟，以超过3.2分钟，然后返回初始条件（95％a）4.2分钟。流速为0.3毫升分钟^-1柱温保持在35℃。用QTOF Premier质谱仪检测洗脱化合物的质量。UPLC-MS运行在以下设置:毛细管电压2.8 kV，锥电压30 eV，碰撞能量5 eV。氩被用作碰撞气体。的m / z范围为70至1,000d。使用甲酸钠和Leu-enkephalin作为锁定质量校准MS系统。MassLynx软件版本4.1（Waters）用于控制仪器并计算精确的群众。

２.４.细胞培养与实验设计

从Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen（DSMZ，Braunschweig，德国）获得人T细胞白血病淋巴管型Jurkat细胞（DSMZ ACC 282）。在37℃下在5％加湿的CO下在37℃下在悬浮培养物中生长细胞₂在生物活性介质RPMI 1640（Gibco，Grand Island，NY，USA）中，含有灭活的胚胎牛血清（Sigma，St.Louis，Mo，USA），L-谷氨酰胺（4毫米），青霉素（100u ml^-1)、链霉素(100 U mL^-1）.实验在细胞密度为0.3 ~ 0.6 × 10的条件下进行^6.细胞ml.^-1．为了模拟氧化应激条件，H₂O.₂(Sigma)加入Jurkat培养物，达到25和50的浓度μm，对应于低和中间应力严重程度[15.］.在不受重臂的控制处理中，将水加入样品中而不是H.₂O.₂．的美国hortensis以2mg ml的速率将提取物加入培养物中^-1作为H.₂O.₂加入。

在单独的试验中，细胞预处理的影响美国hortensis提取对随后H₂O.₂研究了氧化应激。细胞悬液(2 × 10^6.细胞ml.^-1)美国hortensis迷迭香酸馏分如上所述。孵育期结束后，用1500 g离心5分钟收获细胞，清洗，在新鲜培养基中重悬，H₂O.₂．通过如下所述的自由基产生和细胞活力评估对氧化应激的细胞反应。

2．5．过氧化氢清除能力

能力美国hortensis测试在没有细胞的情况下清除过氧化氢的萃取物以检查这种非生物的可能贡献₂O.₂分解实验结果。H.₂O.₂-提取物的清除能力由Ruch等人进行了测试[21.］.过氧化氢溶液50μM在磷酸盐缓冲液（pH7.4）中制备。酚类提取物（2mg ml^-1）在蒸馏水和50 μM双氧水加入到含有灭活胎牛血清(Sigma)、l -谷氨酰胺(4mm)、青霉素(100 U mL)的生物活性培养基RPMI 1640 (GIBSO)中^-1)、链霉素(100 U mL^-1）.10分钟后，在含有双氧水培养介质的空白溶液中测定双氧水在230 nm处的吸光度．过氧化氢清除的百分比美国hortensis计算提取物。试验显示H减少17％₂O.₂浓度因与之互动而美国hortensisrosmarinic acid馏分。

2.6。电子顺磁共振（EPR）光谱

的影响美国hortensis提取物对自由基生成的影响₂O.₂使用电子顺磁共振（EPR）方法研究了挑战和未经充电的细胞。EPR光谱在ReDiopectrometer，RE 1307（EPSI，Chernogolovka，俄罗斯）上注册。用旋转陷阱检测过氧基自由基α-phenyl-tertbutylnitrone (PBN;(50毫米在0.6 × 10^6.在微波功率（20mV）的室温下在0.5mL培养基中的细胞。用旋转捕集器5,5二甲基-i-Pyrrolyn-IV-氧化物（DMPO）（DMPO）（Sigma）（0.6×10为50mm）检测超氧化物自由基^6.在微波功率（20mV）的室温下在0.5mL培养基中的细胞。

2.7。细胞活力和增殖

采用MTT细胞增殖实验测定细胞活力。细胞悬液(2 × 10^6.细胞ml.^-1）与h孵育₂O.₂和美国hortensis如上所述的制剂。孵育后，通过以1500g离心收获细胞5分钟，洗涤，重新悬浮在新鲜培养基中。8 mg ml^-1将3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT) (Sigma)缓冲液(140 mM NaCl, 5 mM HEPES, pH 7.4)以30的速率加入细胞悬液中μL / 100μL悬液和混合物在37℃5% CO中孵育4 h₂的气氛。在此孵育后，小心地去除上清液，从MTT产生的彩色福玛氮晶体溶解在100μL二甲基亚砜（DMSO）。在570nm下测量溶液的吸收值。使用流式细胞术研究不同细胞周期相之间的Jurkat细胞的分布。通过使用亲脂性阳离子试验3,3'-二己基氧基碳键氰酸盐（DIOC），通过流式细胞仪测定细胞培养中的线粒体跨膜电位（ΔΣ）（DIOC_6.)，由Zamzami等人描述[22.］.

2.8。抗氧化酶

通过将细胞悬浮液以500g离心，然后在裂解缓冲液（pH7.9）中均化细胞沉淀物来制备Jurkat细胞提取物。由1.5mM MgCl组成的细胞沉淀物₂，10 mm KCl，1毫米二硫代酚，1 μG ml.^-1Leupeptin，1 μG ml.^-1抑肽酶和10mm HEPES。缓冲液的体积是沉淀物体积的两倍。用27号针将悬液穿过10次细胞裂解。获得的匀浆在10,000 g离心20分钟。上清液用于测定酶活性水平。用分光光度法测定了过氧化氢酶(EC 1.11.1.6)的活性₂O.₂在240 nm处[23.］.一种过氧化氢酶活性的单位定义为分解1的酶量 μ摩尔H₂O.₂每分钟。使用NADPH和苯脲甲磺酸盐（PMS）试剂测定超氧化物歧化酶（SOD; EC 1.15.1.1），用于在560nm处测定分光光度法测量的蓝色甲磺酸盐（NBT）。24.］.一个单位的SOD活性定义为氧化1nmol每分钟的酶量。两种酶的活性以每毫克蛋白质的单位表达。使用总蛋白质微利用套件（Sigma）来确定蛋白质含量。

2.9。白细胞介素分析

Jurkat细胞通过与50孵育来预测 μg/mL植物血凝素(PHA)在37℃下培养5分钟，并与未受刺激的Jurkat细胞(40%受刺激细胞和60%未受刺激细胞)培养24小时。使用ELISA试剂盒(Bender Medsystems, Vienna, Austria)和Multiscan microplate reader (LabSystem, Helsinki, Finland)检测促炎和抗炎细胞因子IL-2和IL-10。

2.10。统计数据

试验分5个重复进行。使用IBM SPSS Statistics程序对所得结果进行统计分析，包括计算均值和标准差。通过使用学生量表对治疗结果与未治疗对照进行两两比较，分析均数差异的统计学意义T.- 最低．

结果

３.１.分析美国hortensis提取物

HPLC分析结果表明，黄芩醇提物中含有大量酚类化合物美国hortensis，甘氨酸和阿魏酸是主要化合物。此外，许多酚酸（咖啡酸，P.- 在乙醇提取物中暂时鉴定出在乙醇萃取物中鉴定出乙糖苷（儿茶素，epicateChin，叶黄素，Apigenin）和糖苷（Rutin，Hesperidin，甲葡糖苷）。rosmarinic酸的部分纯化提供了包含四个主要峰的馏分。与正品标准样品相比，rosmarinic酸的暂定鉴定为馏分最丰富的组分，基于其UV吸收光谱和保留时间。基于LC-MS基于存在质脱的分子离子[M-H]的存在，确认身份^-在m / z359和特征碎片离子m / z123，m / z135，m / z161年,m / z179年,m / z197，按照文献中的数据[25.那26.]和碎片方案（图1）.通过与标准样品比较，LC-MS鉴定出两种黄酮苷为橙皮苷[M - H]^-在m / z609，一个特征的橙皮素片段离子m / z301，基于[M-H]的鼻腔^-在m / z579和一个特征柚皮素片段离子m / z此外，作为芦丁和Apigenin-7-葡糖苷的级分，暂时鉴定出两种更多的黄酮糖苷。

H₂O.₂引起的氧化胁迫，受到S. Hortensis提取物的影响。25或50的加法μM氢过氧化氢导致Jurkat细胞中的氧化应激，其表现为可以通过EPR光谱检测的超氧化物和过氧基的产生。形成的基团的量取决于H的浓度₂O.₂;在没有过氧化氢的情况下没有检测到基团（表1）.

氯仿和乙酸乙酯提取物美国hortensis对细胞的氧化状态仅有有限的影响，略微降低在较高的过氧化氢浓度下检测到的自由基的量。另一方面，在乙醇的存在下，观察到相当大的减轻氧化应激和几乎完全消除基团的存在E. Hortensis.提取。水提物和部分纯化的迷迭香酸部分也具有显著的抗氧化作用，尽管后者的功效明显低于乙醇粗提物。根据这些发现，总水提取物美国hortensis抗氧化剂酶过氧化氢酶和超氧化物歧化酶在Jurkat细胞中的活性加倍，即使在没有外源氢过氧化氢（图2）.

3.2。对Jurkat细胞活力的影响

在没有任何外源性的情况下₂O.₂挑战，添加乙醇美国hortensis对Jurkat细胞的活性有一定的提高。其他美国hortensisMTT试验表明，提取物对Jurkat细胞活力无明显影响(表1)2）.

过氧化氢氧化应激以剂量依赖性方式降低了Jurkat细胞的活力。通过应用乙醇和水性提取物来缓解过氧化氢效应美国hortensis并通过酚类部分。含水美国hortensis提取物是恢复细胞活力最有效的，以在不重读的对照培养中观察到的水平（表2）.

3.3。Jurkat细胞预处理的影响美国hortensis提取物的后续细胞敏感性氧化应激

表中呈现的数据3.证明，通过随后暴露于过氧化氢，Jurkat细胞的预处理与rosmarinic acid馏分的预处理显着降低了细胞产生的氧化应激，如通过自由基产生和细胞活力的下降表达。这种缓解不能归因于提取物的过氧化物清除活性，因为在这种情况下没有提取物与过氧化物的直接接触。此外，罗哌啶酸馏分的直接过氧化物清除能力不超过17％，因此其对细胞保护的贡献相当有限。

3．4．对细胞周期的影响

氧化应激改变了Jurkat细胞的细胞周期相分布，限制细胞增殖并增加了总细胞群中G0 / G1细胞（G0 / G1止血）和凋亡细胞的相对比例。通过添加乙醇来缓解这些趋势美国hortensis因此，处理后的凋亡细胞数量与非应激对照组无显著差异(表1)4.）.添加美国hortensis单独提取，不含双氧水，对Jurkat细胞的细胞周期相分布无显著影响(数据未显示)。H的减轻₂O.₂诱导的细胞凋亡美国hortensis从流式细胞术测定的线粒体跨膜电位指数来看，迷迭香酸部分提取物和部分纯化的迷迭香酸部分也很明显5.）.

3.5。白细胞介素生产

过氧化氢刺激Jurkat细胞产生IL-2和IL-10白细胞介素，并通过加入美国hortensis提取物及其酚类分数（表6.）.

4.讨论

我们的研究证实，Rosmarinic酸是夏季咸味的丰富苯丙烷化合物。据我们所知，Hesperidin和Naringin尚未报告美国hortensis，但他们已被发现Satureja物种 [27.]在这个家庭的其他属，如各种[25.］.

目前的研究首次证明美国hortensis其富含甘氨酸富含的馏分可以保护Jurkat细胞免受过氧化氢引起的氧化应激。这些发现符合抗氧化剂，细胞保护性和抗炎活动美国hortensis[7.rosmarinic acid [9.那10.已被观察到的在活的有机体内在动物和人类中。展示了类似的保护性抗氧化性能美国hortensis应用于h时提取物₂O.₂从健康的大鼠血液中分离的淋巴细胞[28.］.在细胞培养物中，甘氨酸酸保护的人神经元细胞免受过氧化氢诱导的细胞凋亡[29.]并抑制剂量依赖性方式，在Raw264.7巨噬细胞中形成反应性氧和氮物质的形成刺激脂多糖或Phorbol 12-Myristerate 13-醋酸酯[30.］.

另一方面，在之前的一项研究中，迷迭香酸未能保护Jurkat细胞免受H₂O.₂- 介导的氧化损伤并实际诱导它们的细胞凋亡[19.那20.］.细胞培养物中的这种过氧基细胞毒反应与H的产生有关₂O.₂通过酚类化合物与培养基成分（例如，瞬态金属）的相互作用，因此可以被视为文物[31.那32.］.在生长培养基中加入过氧化氢酶或半肌红蛋白会否定这些反应，并使酚类化合物的细胞保护抗氧化潜能得以实现[31.］.

我们的结果与Kolettas等人之间表观差异的一个可能的解释。[19.可能是我们研究中使用的高剂量抗氧化材料可以克服H₂O.₂，或外源性添加，或在细胞培养中由瞬态金属参与产生。事实上，在金属催化体系中，大多数酚类化合物在低剂量时表现出促氧化作用，在较高浓度时则转变为抗氧化活性[33.］.此外，最近表现出高剂量（2-3mm）的咖啡酸和其他苯基丙醇保护来自H的Jurkat细胞₂O.₂-螯合细胞内不稳定铁诱导的DNA损伤[34.］.除了罗哌啶酸外，酚类级分中有效的黄酮抗氧化剂的存在可能进一步增强其抗氧化能力。增强抗氧化酶的活性美国hortensis（数字2）也可能有助于中和过氧化氢。过氧化氢酶和SOD在Jurkat细胞控制氧化应激和凋亡中起重要作用[35.］.类似于我们的发现，含卤霉酸的另一种含水提取物唇形科草本植物，白苏子显示在培养的人静脉内皮细胞中上调这些抗氧化酶的mRNA和蛋白质表达[36.］.

在这项工作中观察到的另一个值得注意的现象是IL-2和IL-10白细胞介素水平的平行增加。IL-2的大量产生是Jurkat细胞系的主要特征[12.］.在免疫反应期间这两个白细胞介素之间存在协同相互作用[37.］.抗炎因子如IL-10可能被释放，以平衡应激情况下促炎细胞因子的急剧增加，从而控制炎症反应的幅度和持续时间[38.］.有趣的是，已显示将富含抗氧化剂的植物材料添加到持久的促炎病症的动物的饮食中，增加了IL-10的水平[39.]或IL-2和IL-10的水平[40]并行随着促炎因子的水平而降低，例如IL-6，TNF-α，和il-1β．此外，这些饮食干预保存了正常的抗氧化酶活性，抑制脂质过氧化，并增加了处理的动物中的HDL水平，导致疾病的缓解和增强的免疫力。甘氨酸在脂多糖刺激的巨噬细胞模型中增加了IL-10的分泌[41.］.

添加了美国hortensis提取液或其酚组分均能恢复H₂O.₂-Challenged Jurkat细胞，减轻了G0 / G1逮捕，并控制了这些细胞的凋亡。总共，这些现象符合细胞反应对氧化应激的一般方案，这意味着低剂量的反应性氧物种促进细胞增殖，中间剂量导致生长停滞，并且严重的氧化应激最终通过凋亡或坏死机制导致细胞死亡[42.］.显然，增加了美国hortensis提取物缓解了通过过氧化氢施加在细胞上的氧化应激。这些效果可能归因于罗马啉酸和其他酚类化合物的直接自由基清除活性，以及​​间接机制，例如增强抗氧化剂酶和抗炎信号传导分子的释放，例如IL-10。

5。结论

目前的研究表明，富含甘氨酸的酸性提取物美国hortensis可以保护Jurkat细胞免受过氧化氢引起的氧化应激。这些发现与在动物和人类中观察到的甘氨酸的抗氧化剂，细胞保护和抗炎活性。因此，H₂O.₂-Challenged Jurkat细胞可以用于研究植物营养素的细胞保护作用的细胞机制的模型。然而，应该牢记这些结果，这些结果以相当高的甘氨酸溶于甘氨酸来实现，这可能会克服培养相关的工件。需要进一步研究，以优化实验系统。

致谢

作者感谢Mira Weissberg博士，植物科学研究所，Volcani Centre，Aro，用于执行LC-MS分析。以色列合作伙伴承认“科学院，移民部，以色列（Kamea计划）的吸收中心的财政支持。

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