文摘
目标。之间的关系来验证Egr-1和静脉移植物再狭窄和探讨相关机制。方法。小鼠静脉移植模型建立了Egr-1淘汰赛(KO)和野生型小鼠(WT)。静脉移植的小鼠病理检查和免疫组织化学分析。内皮细胞(ECs)刺激通过使用计算机控制的循环应力单元。BrdU染色和PCR检测ECs核扩散活动和Egr-1 ICAM-1 mRNA表达,分别。免疫印迹分析也用于检测Egr-1的表达和细胞间粘附molecule-1 (ICAM-1)的蛋白质。结果。静脉移植的流明Egr-1 KO小鼠比WT老鼠更广泛。ECs扩散后机械拉伸刺激抑制了Egr-1淘汰赛()。在静脉移植和ECs WT老鼠机械拉伸刺激后,信使rna表达和蛋白质Egr-1和增加ICAM-1显示()。然而,ICAM-1表达显著抑制的ECs Egr-1基因敲除小鼠()。结论。Egr-1可以促进ECs扩散,导致静脉移植物再狭窄ICAM-1的上调表达。静脉移植物再狭窄的一个关键因素,它可能是一个目标CABG手术后再狭窄的预防。
1。介绍
冠状动脉旁路移植(CABG)是一种最有效的治疗冠状动脉疾病(CAD)。然而,一些研究显示,大约10%的静脉移植物闭塞冠脉搭桥术后一个月内,只有50%的冠状动脉绕道手术静脉移植仍然畅通无阻的10年(1]。因此,如何提高静脉移植的效率随着时间的推移,在心脏手术是一个挑战。的一些机制的闭塞静脉移植已确定。
正常血管内皮细胞(ECs)发挥核心作用在调节内膜的增长(2,3]。冠脉搭桥术后,静脉移植墙壁维持血压,远高于通常的静脉压力,和静脉移植物的墙壁通常由脉动的拉伸(受伤4- - - - - -6]。这些压力导致内皮功能障碍,即初始因子诱导增殖的内膜增厚7]。这些伤害诱导ECs扩散的变化,细胞因子分泌,血小板聚集,白细胞粘附,参与急性血栓形成的发病(7,8]。这个功能障碍的ECs然后激活血管平滑肌细胞(VSMCs)迁移到内膜,转变成一个增殖表型。细胞外基质的合成和积累这些激活smc形成动脉粥样硬化发展的矩阵(9,10]。最后,激活ECs, smc产生吸引趋化因子,招聘和留住单核细胞向内皮细胞和细胞外基质,在那里他们转变成巨噬细胞参与动脉粥样硬化斑块的发展(9,10]。在一起,这三个机制参与内膜的增殖增厚,最终,在介入治疗失败11,12]。
最近的研究表明,三个家庭的附着力因素参与再狭窄:(1)免疫球蛋白超科(包括细胞间粘附molecule-1 (ICAM-1)和血管细胞粘附molecule-1 (VCAM-1), (13- - - - - -15)(2)整合素家族(包括巨噬细胞1抗原(MAC-1)和淋巴细胞功能相关antigen-1 (LFA-1)) (16,17),(3)selectin家庭(包括E-selectin) (18]。增加ICAM-1表达特征的早期血流机械剪切应力引起的内皮功能障碍(19,20.]。ICAM-1 VCAM-1参与淋巴细胞吸引和保留,在VSMCs迁移和增殖和形成的动脉粥样硬化斑块21,22]。与内皮功能障碍[sICAM-1水平负相关23]。最近,一些研究表明,sICAM-1可以作为生物标志物预测二级CAD患者心血管疾病(24,25]。
早期生长反应蛋白1 (Egr-1)立即早期基因家族中的一员,也是一个重要的转录因子。最近的研究表明,Egr-1参与细胞内信号和多个基因的调控包括生长因子、信号转导基因、转录因子和致癌基因。其他研究也显示,Egr-1扮演着一个重要的角色在细胞生长,发育,分化和伤口愈合26- - - - - -28]。我们的初步研究表明,Egr-1与再狭窄密切相关,和静脉移植狭窄的程度Egr-1敲除小鼠(KO)明显低于野生型小鼠(WT),表明Egr-1可以促进静脉移植物狭窄。然而,这种效应的机制对静脉移植物狭窄Egr-1不清楚。据我们所知,没有这样的信息已经被报道。因此,本研究进一步验证了Egr-1对静脉移植物再狭窄的影响和研究相关的机制。我们希望这项研究能提供有价值的信息对静脉移植物再狭窄的预防和治疗。
2。材料和方法
2.1。动物
我们使用男性Egr-1 KO小鼠作为描述(29日)和WT C57BL / 6 j小鼠(公司至关重要的河流,北京),年龄在8到12周。所有动物都是管理的指导方针北京甄医院,首都医科大学。实验协议批准北京甄医院心脏外科,首都医科大学。在实验之前,老鼠一直在一周24°C,在12小时光/暗周期和正常饮食。在实验组中,Egr-1 KO小鼠作为捐赠者,同窝出生仔畜Egr-1 KO小鼠作为接受者。在对照组,WT C57BL / 6 j小鼠作为捐赠者,与同窝出生仔畜WT C57BL / 6 j小鼠作为接受者。Egr-1 KO小鼠起源于C57BL / 6 j×129背景和与C57BL / 6 j应变back-crossed至少10代。动物实验是通过北京理工心脏、肺和血管疾病。
2.2。小鼠静脉移植模型
我们使用静脉移植模型如前所述,邹et al。30.]。总之,老鼠使用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。右颈总动脉从周围组织解剖尽可能远(远侧地和步骤)。我们结扎颈总动脉在中点缝合线和分裂。远端和近端部分结合在袖口,我们控制动脉流入和流出使用夹子放在袖口的处理。缝合线被移除;远端和近端动脉在袖口的管状体和翻转使用缝合固定。因此,有袖的静脉段(从供体小鼠下腔静脉)是嫁接在袖口和担保与缝线的位置。最后,关闭切口使用3 - 0涤纶(杭州AiPu医疗产品有限公司、浙江、中国)。
我们测试的开放手术后静脉移植。如果嫁接船脉冲大力也没有出血,我们认为手术是成功的。几分钟内如果没有脉动血流恢复或者怀疑血栓形成,手术被认为是手术失败(30.]。我们收获的静脉移植3 h, 1天,1周,2周,4周后手术。
虚假的手术组的小鼠(虚假)麻醉和他们的脖子是雕刻的,但未行手术的颈动脉。
2.3。机械拉伸刺激
ECs孤立于下腔静脉内皮细胞(IVCECs)和腔静脉Egr-1 KO和WT老鼠关在杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM)与10%胎牛血清(的边后卫)37°C和95%的空气和5%的有限公司2。然后我们镀ECs硅胶elastomer-bottomed和collagen-coated板块(美国Flexcell,麦基斯波特,PA)。计算机控制的循环应力单元(美国Flexcell,麦基斯波特,PA)用于主题ECs机械拉伸(循环变形是60周期/分钟,伸长率为15%)(31日,32]。
2.4。衡量ECs的扩散
我们执行BrdU疣状根据制造商的协议(罗氏分子系统,而CA,美国)。总之,ECs培养12小时中含有0.4%的边后卫同步,然后用10%的边后卫,在DMEM培养和刺激机械拉伸24小时。在细胞培养的最后4小时37°C, BrdU是补充道。与PBS洗了三次后,细胞被固定用4%多聚甲醛10分钟,洗了三次PBS,暴露于0.3% Triton x - 100为5分钟,洗了三次,PBS。细胞在37°C 2 M盐酸处理30分钟,然后用0.1四硼酸钠10分钟,并与PBS洗了三次。细胞培养在10%胎牛血清在一夜之间被孵化前30分钟在4°C antimouse BrdU单克隆抗体。最后,细胞治疗fluorescence-labeled山羊antimouse免疫球蛋白在室温下1 h。PBS是用作负控制。DAPI专门用于染色细胞核。阳性细胞的平均百分比BrdU决心在4或5不同领域使用徕卡DMI4000B荧光显微镜(徕卡,位于德国)100×放大。 Count was repeated 4 times.
2.5。实时rt - pcr
总RNA提取ECs与机械拉伸刺激,使用试剂盒试剂(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)。RNA纯度决定使用吸光度在260和280海里(A260/280)。后评估RNA浓度、总RNA reverse-transcribed成互补DNA(互补)使用合成第一链cDNA工具包(Fermentas生命科学)。鼠标Egr-1扩增,引物,5′CAG CAG有条件现金援助TCG CTA ACC-3′,和反向5′cca CTG GGC亚美大陆煤层气有限公司(CGT AA-3′。鼠标ICAM-1扩增,引物,5′gg TGT手枪ATC CGG标签3′和反向,5′有条件现金援助TCT亚美大陆煤层气有限公司TGG TTG棉酚CA-3′。向前,5′tga CTT CAA CAG CGA CAC CCA-3′,为鼠标GAPDH和反向引物5′CAC有条件现金援助GTT GCT GTA GCC AAA-3′。所有参与反应初始变性为15秒95°C,紧随其后的是45周期95°C的5 s和60°C 30年代。特定的信使rna定量实时PCR是由使用SYBR预混料交货Taq II(豆类生物,大连,中国)TP800实时PCR系统(豆类生物,大连,中国),根据制造商提供的指导方针。结果分析比较阈值使用周期,如前所述[33]。
2.6。免疫印迹分析
腔静脉的ECs Egr-1 KO WT老鼠刺激和机械拉伸,然后细胞溶解在缓冲区里帕(50更易/ L三,150更易与L氯化钠,5更易/ L EDTA, NP-40 1%, 1%钠脱氧胆酸盐,0.1% SDS, 1更易与L Phenylmethanesulfonyl氟化物(PMSF), 10 ug / mL抑肽酶,1更易/ L衣饰归宿4在4°C),以及离心机15分钟(12000 rpm)。蛋白质浓度测定采用BCA后化验设备(HyClone-Pierce、犹他州、钙、美国),等量的蛋白质(40μg) 8% SDS-polyacrylamide凝胶分离和转移到PVDF膜(微孔、马萨诸塞州、钙、美国)。非特异性网站在每个污点被封锁在TBS 5%脱脂奶粉稀释0.05%渐变20 (TBST)。一夜之间,膜被孵化与初级抗体il - 1、il - 4, TGF -β和肿瘤坏死因子-α(Abcam,剑桥,英国)在4°C。由TBST洗后,蛋白质与HRP-labeled透露免疫球蛋白(皮尔斯抗体,热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)在室温1小时。膜使用ECL开发系统(Amersham)和分析使用生物电泳图像分析系统(复日科技公司,上海,中国。
2.7。免疫组织化学
免疫组织化学进行4μ米厚formalin-fixed,石蜡包埋组织部分。Deparaffinized部分处理3%过氧化氢为30分钟30°C和1%柠檬酸溶液中煮20分钟后洗在PBS。羊血清阻断后10%(美国向量实验室,伯林盖姆,CA) 30分钟,部分是主要抗体孵育Egr-1(美国Epitomic,旧金山,CA)和ICAM-1一夜之间(Abcam,剑桥,英国)。洗后用PBS,部分二次抗体孵育(山羊antirabbit,向量实验室、伯林盖姆、钙、美国)40分钟30°C,最后avidin-biotin复杂(美国向量实验室,伯林盖姆,CA) 10分钟。免疫原性是可视化使用3、3′-diaminobenzidine(美国向量实验室,伯林盖姆,CA)为2分钟。部分与苏木精复染色,在酒精脱水,并与Histo-clear清除。消极的控制,同样的协议是用于抗原稀释剂而不是主要抗体。彩色幻灯片被认为与光学显微镜、图像捕获和阳性细胞百分比的静脉移植进行了分析使用NIS元素BR软件(尼康仪器有限公司、日本)。
2.8。统计分析
结果意味着±SEM。组间比较分析单向方差分析其次是Bonferroni /邓恩事后分析。所有使用SPSS 17.0统计分析(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。一个值< 0.05被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。在静脉移植Egr-1 KO降低狭窄
演示的病理生理重要性机械stretch-activated Egr-1,我们构建小鼠静脉移植模型Egr-1 KO小鼠和WT老鼠。我们收获了静脉移植和分析通过他在手术后4周染色。如图1的腔静脉移植在WT Egr-1 KO小鼠都窄,与下腔静脉腔的WT老鼠(μ米和μ米,μ米和μm;)。然而,腔静脉移植的Egr-1 KO小鼠更广泛的近两倍,相比之下,在WT老鼠(μ米和μm;)。
(一)
(b)
3.2。Egr-1 KO抑制ECs扩散引起的机械拉伸刺激
研究之间的联系Egr-1 KO和机械stretch-induced ECs增殖,我们从静脉分离出ECs WT Egr-1 KO小鼠。如图2机械拉伸刺激24 h后,BrdU-positive细胞WT /圣ECs与WT相比增加了7.6倍。然而,扩散在Egr-1 KO抑制细胞(%的WT /圣;)。
(一)
(b)
3.3。机械拉伸增加Egr-1表达式
静脉移植的收获是用来衡量Egr-1 mRNA水平。Three-h在WT老鼠被放置到颈动脉后,ECs隔绝静脉显示显著增加Egr-1 mRNA水平,手术的价格相比虚假的集团(褶皱;)(图3(一个))。Egr-1 mRNA表达的时间进程的ECs WT小鼠机械拉伸刺激评估。早在被刺激后10分钟,Egr-1 mRNA水平增加,达到一个峰值在60分钟(褶皱与0分钟;)。Egr-1 mRNA回到基线后90分钟(图4 (b))。Egr-1蛋白质达到了一个峰值在90分钟(褶皱与0分钟;)(图4 (c))。
(一)
(b)
(c)
(一)
(b)
(c)
3.4。Egr-1 KO抑制ICAM-1表达式
ICAM-1在血管损伤后炎症中扮演一个重要的角色13]。我们研究了在ICAM-1 Egr-1表达的作用。静脉ECs WT和Egr-1 KO小鼠孤立和机械拉伸刺激从0到3 h。3 h后,机械拉伸WT ECs ICAM-1 mRNA表达增加,并显著抑制ECs Egr-1 KO小鼠(%的WT /圣;)(图4(一))。ICAM-1蛋白质含量的ECs Egr-1 KO小鼠显著降低,与WT ECs的老鼠相比,机械拉伸刺激后24 h (%的WT /圣;)(图4 (b))。随后,我们探讨是否Egr-1调节ICAM-1在小鼠静脉移植模型。我们收获静脉移植手术后从WT Egr-1 KO小鼠3 h。WT静脉移植的小鼠,ICAM-1 mRNA显著增加,而WT老鼠虚假手术集团(褶皱;)。Egr-1 KO显著降低ICAM-1表达式(从WT %的静脉移植小鼠3 h手术后;)(图4 (c))。免疫组织化学显示Egr-1和ICAM-1阳性细胞百分比的同时减少从Egr-1 KO小鼠静脉移植手术后4周,小鼠相比,从WT (%与%,%与%;)(图5)。
(一)
(b)
4所示。讨论
在这项研究中,我们发现,刺激内皮细胞表达Egr-1机械拉伸显著增加,ECs核扩散活动明显改善。我们还发现Egr-1 mRNA表达改变随着时间的推移;它增加了机械拉伸刺激了十分钟后,刺激了60分钟后达到高峰,然后逐渐下降。早期冠脉搭桥手术后,静脉移植是在高动脉血压;然后突然血流动力学变化和机械拉伸刺激可能会损害内皮细胞。Egr-1 mRNA表达的增加刺激了十分钟后表明Egr-1后立即在内皮细胞表达细胞受损,后来引起一系列病理生理变化。Egr-1属于立即早期基因而不是长期的基因。显然,它的表达并不是持续而长期的基因表达。因此,Egr-1 mRNA表达达到峰值后下降。据报道,Egr-1表达式的持续时间随不同的刺激34- - - - - -36]。Egr-1表达调节时,它可能是受负面反馈监管机构如c-fos [37),磷酸酶抑制剂(38),而自由基拾荒者(39]。
机械拉伸刺激后,Egr-1的表达和ICAM-1 ECs WT老鼠的细胞明显增加,而表达ECs细胞或静脉移植物的ICAM-1 Egr-1 KO小鼠显著抑制。与此同时,内膜的增生是大大减少静脉移植物的Egr-1 KO老鼠。它建议Egr-1表达式可以上调ICAM-1表达,增加炎症细胞粘附,加重血管炎症,导致静脉移植物再狭窄。然而,Egr-1淘汰赛不完全抑制内皮层增厚,内膜的增生表明其他因素可能参与内膜的增生的过程。据报道,机械应变能增强NF -κ活动和NF - BκB可以增加内膜的增生,导致再狭窄通过调节IGF-1R转录(29日]。
除了机械应变刺激,静脉移植也受到氧化应激损伤。氧化应激细胞凋亡是多种心血管疾病的关键,它被发现在血管损伤后内膜的增生引起的各种有害因素(40]。CABG手术后静脉移植,特别是吻合,渗透了巨噬细胞和脂质沉积所覆盖41]。巨噬细胞激活炎症可能产生过多的活性氧(ROS),并增加interleukin-8(引发)和单核细胞趋化蛋白1 (MCP-1),这又加重炎症(42]。缺血再灌注的反应不仅在手术过程中产生过多的活性氧,导致血管壁细胞的氧化损伤,但也直接调节Egr-1表达式(43]。ROS可能上调Egr-1表达式通过激活蛋白激酶的家庭K同功酶和增殖蛋白激酶/细胞外signal-regulated激酶(MEK / ERK)通路(44),增加血管壁脂质沉积。ROS的低密度脂蛋白(LDL)沉积形成氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)蛋白质,促进VSMC增殖通过激活半胱天冬酶家族蛋白质和调停NF -κB信号通路,最终导致内膜的增生和狭窄45]。
总之,Egr-1静脉移植物再狭窄中发挥了重要作用。可能导致静脉移植物再狭窄可能通过上调ICAM-1,加重血管炎症,促进内皮细胞增殖。作为一个静脉移植物再狭窄的关键因素,Egr-1可用于预防和治疗的一个有效的目标基因。
5。结论
我们的研究结果表明,Egr-1扮演了一个角色在再狭窄上调ICAM-1 ECs静脉移植,这可能为静脉移植物再狭窄的预防提供新的线索在冠脉搭桥,导致新策略来改善冠状动脉绕道手术病人的预后。然而,具体机制仍需阐明,以及确切的ECs与smc在再狭窄的关系。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
承认
这项研究得到了国家自然科学基金(81070202)。