PDGF抑制氧化应激诱导Ca^{2 +}过载和Calpain激活神经元

文摘

氧化应激是至关重要的是参与神经系统疾病,如中风的发病机理和退化性疾病。我们先前表明,血小板源生长因子(pdgf)保护神经元免受H₂O₂全身的氧化应激,表示PI3K-Akt和MAP激酶的参与作为一个潜在的机制。Ca^{2 +}超载已被证明调解氧化应激的神经毒性作用,会引起。我们检查了pdgf在H的影响₂O₂全身的Ca^{2 +}过载的主要培养神经元进一步澄清他们的神经保护机制。H₂O₂全身的Ca^{2 +}超载在神经元剂量依赖性的方式,而预处理神经元与PDGF-BB 24小时在很大程度上抑制它。在比较研究中,PDGF-BB的抑制效果比PDGF-AA更有效。然后我们评估calpain激活,诱导的Ca^{2 +}过载和介导的凋亡和nonapoptotic细胞死亡。H₂O₂全身calpain激活神经元剂量依赖性的方式。预处理PDGF-BB完全封锁了H₂O₂全身calpain激活。我们所知,目前的研究第一次表明了神经保护机制通过抑制PDGF对氧化应激的影响^{2 +}calpain过载和失活,表明PDGF-BB可能是一个潜在的治疗神经系统疾病的目标。

1。介绍

氧化应激和会扮演重要的角色在许多神经系统疾病的发病机制,包括缺血性梗死、多发性硬化症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症,和阿尔茨海默氏症,亨廷顿氏舞蹈症和帕金森疾病(1- - - - - -3]。Ca^{2 +}已被证明调解氧化应激的细胞毒性,会引起,和细胞Ca吗^{2 +}过载或胞内Ca的扰动^{2 +}区分这些有害刺激可以引起细胞毒性和触发引起的细胞死亡包括凋亡和坏死细胞死亡(4- - - - - -6];然而,这些细胞损伤机制尚未阐明足够详细的预防和治疗神经系统疾病(7,8]。

钙蛋白酶是中和钙有关的化学已经涉及的半胱氨酸蛋白酶的调节细胞死亡通路包括凋亡和坏死(9,10]。细胞内钙离子浓度升高将hyperactivate钙蛋白酶。钙蛋白酶的激活参与各种病理条件,包括缺血性脑损伤和慢性神经退行性疾病,例如,阿尔茨海默病(9,11]。以前的研究报道,calpain抑制剂在自由基损伤神经模型与线粒体功能障碍(12),凋亡损伤后脊髓损伤(13),和创伤性脑损伤14]。神经变性和细胞凋亡在calpain-1 null是改善小鼠后创伤性脑损伤(15]。因此,抑制钙^{2 +}过载和calpain的激活是一个至关重要的策略来克服神经由氧化应激介导的疾病,会引起。

血小板源生长因子(PDGF)家庭成员,a, b, c, d,组装disulfide-linked homo -或形成,和两个受体酪氨酸激酶,PDGFR -α和- - - - - -β,它可以形成人类heterodimeric受体复合物,已确定(16]。PDGFR -αα以前被PDGF-AA激活,ab, cc, bb, PDGFR -αβPDGF-AB, bb, cc和PDGFR -ββPDGF-BB和dd。

先前的研究表明,PDGF和pdgfr广泛表达在中枢神经系统(CNS) [17- - - - - -19]。神经保护作用已经假设基于大量研究的结果;抑制PDGF-B或条件删除PDGFR -β基因导致增强中枢神经系统的脆弱性会引起或缺血(20.- - - - - -22]。此外,最近的研究表明,PDGF-AA和bb保护培养的神经元对氧化应激和抑制H₂O₂通过PDGFR——全身caspase-3激活α或-β在这些细胞表达23]。在这项研究中,PI3-K / Akt和MAP激酶途径提出了调解神经保护效应。据报道,PDGF-CC通过激活的GSK3beta起到神经保护作用在活的有机体内和体外(24]。然而,神经保护机制PDGFR信号尚未阐明。

我们在此确认另一个由pdgf神经通路介导。PDGF-AA PDGF-BB镇压Ca^{2 +}过载引起的H₂O₂在初级培养小鼠皮层神经元。此外,PDGF-BB减毒的H₂O₂calpain全身的活动,这是一个关键分子的氧化应激引起的神经功能障碍和Ca^{2 +}过载(10]。因此,这项研究提供了一个新颖的见解机制PDGF对氧化应激的神经保护作用。

2。实验程序

2.1。老鼠

我们使用野生型C57BL / 6 j小鼠(制药实验室、富山、日本)。老鼠维持自由进入实验室颗粒食物、水和暴露于12 h光/ 12 h暗周期。所有动物程序根据制度进行动物保健和使用委员会的指导方针下富山大学的一个批准的协议。

2.2。细胞培养

细胞培养建立了如前所述[23]。简单地说,是从新生儿解剖小鼠大脑皮层在产后第一天,保持酶的分离在0.1%胰蛋白酶(Nacalai Tesque,京都,日本)为5分钟37°C,然后用fire-polished巴斯德吸量管机械分离。离心后(150 g×5分钟),细胞在杜尔贝科resuspended修改鹰的媒介DMEM / F12培养基(1:1;卡尔斯巴德,表达载体包含10%胎牛血清(CA)的边后卫;HyClone,日本横滨)和保持在无血清neurobasal中补充1% B27补充(表达载体),2毫米谷酰胺(σ、路易、钼)、青霉素100单位/毫升(表达载体)和0.1毫克/毫升链霉素(表达载体)。细胞被镀在玻璃底文化菜(P35G-0-10-C MatTek,亚什兰,MA)的密度细胞/厘米²确定细胞内钙离子的浓度()。确定calpain活动,细胞被镀上24-well板块(BD生物科学,圣何塞,CA)的密度细胞/厘米²。碗和盘子都是预镀0.001% poly-L-lysine(σ)。每3天新鲜培养基添加和文化被维护。只有不到5%的培养细胞神经胶质因为超过95% MAP-2-positive神经元形态成熟的特性,如神经突延长7天在体外(DIV)。

2.3。药物治疗

重组人类PDGF-AA PDGF-BB买来Chemicon(泰梅库拉,CA)。氧化应激诱导的治疗H₂O₂在DIV 7如前所述[24小时23]。探讨PDGF在H的影响₂O₂全身的神经元是使用PDGF 24 h。后加载Fura-2-AM (Dojindo、熊本、日本),细胞被转移到新媒体包含H₂O₂。PDGF并不包含在这个新鲜的媒介为了避免PDGF提供新鲜的急性效应。确定PDGF在H的影响₂O₂全身calpain活动,神经元使用PDGF 24或48小时暴露在h₂O₂准备在媒体包含PDGF 24 h,然后被处理以确定calpain活动。

2.4。Ca^{2 +}成像分析:确定细胞内钙离子的浓度

被评估为[其它地方描述的那样25,26]。简单地说,1μM Fura-2-AM (Dojindo)准备的解决方案是使用加载缓冲区,HEPES-buffered振铃器解决方案补充0.2%牛血清白蛋白(σ),鹰的最小的必需氨基酸(流实验室,英国萨里郡)、谷酰胺和2毫米。HEPES-buffered振铃器解决方案(pH值7.4)包含118毫米氯化钠,氯化钾4.7毫米,2.5毫米CaCl₂,1.13毫米MgCl₂,1毫米Na₂HPO₄、5.5毫米葡萄糖和HEPES-KOH 10毫米。24小时PDGF预处理后,细胞被洗PBS和装载1μM Fura-2-AM解决方案在室温下15分钟(25°C)。与PBS细胞被洗了两次,然后替换为培养媒体补充有或没有H₂O₂30分钟。数字Fura-2荧光图像,并分析了数字图像处理器(Argus 50 / CA、滨松光子学,滨松,日本)加上一个倒置荧光显微镜(25]。510纳米的比例在340 nm激发发射荧光,在380 nm励磁,F(340/380),作为一个指标在大脑皮层神经元。伪彩色图像的单个细胞,F(340/380)值获得15 - 30分钟后,治疗H₂O₂。

2.5。Calpain活动分析

激活calpain释放到胞质中提取,calpain-1的活动和2测定使用calpain活动分析工具包(Biovision苗必达,CA)根据制造商的指示。短暂,培养神经元孵化了裂解缓冲在4°C为20分钟。阐明细胞溶解产物离心后孵化与反应缓冲区包含基质calpain (Ac-LLY-AFC)在黑暗中1 h在37°C。在衬底的乳沟,fluorogenic部分(7-amino-4-trifluoromethyl香豆素)产生了505海里在400 nm激发荧光发射。荧光发射是衡量标准荧光计(FilterMax F5、分子器件、桑尼维尔CA)。控制反应表现为每个样本的抑制剂calpain-1和2监视任何calpain-independent fluorogenic肽的蛋白水解作用。值控制反应是减去总活动值来具体确定calpain活动对于每个样本。结果表示为相对荧光单位每毫克溶解产物蛋白质。

3所示。统计分析

定量数据被表示为±SEM手段,每个实验至少重复三次。单向方差分析以及Fisher PLSD测试用于统计分析值小于0.05被认为是重要的。

4所示。结果

4.1。PDGF-BB减毒H₂O₂全身的细胞内钙离子浓度增加

pdgf的神经保护效应对H₂O₂已报告之前(23];因此,我们研究了H pdgf的影响₂O₂全身的过载,参与细胞氧化应激损伤(27,28]。在原位伪彩色图像,控制神经元没有暴露在H₂O₂经常显示低,许多神经元表现出高H后₂O₂在15 - 30分钟(图1(一))。神经元的数量显示高H后₂O₂似乎下降了24小时预处理与PDGF-BB 15和30分钟(图1(一))。的手段评估从这些图片证明PDGF-BB预处理没有影响在控制神经元没有H₂O₂曝光(图1 (b))。H₂O₂治疗增加在神经元剂量依赖性的方式5和20μ分别M在15 - 30分钟(图1 (b))。这个H₂O₂全身的完全废除了过载PDGF-BB预处理在所有条件下检查。

(一)

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(c)

(d)

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图1

_{2 2 2 2 2 2} μ _{2 2} μ _{2 2 2 2 2 2} 影响PDGF-AA和PDGF-BB HO全身的增加。确定使用Fura-2-AM荧光染料。(一)代表相对伪彩色图像表示之间的荧光比340和380海里(F340/380)个人皮质神经元H后15 - 30分钟O治疗。后24 h与50 ng / mL PDGF-BB预孵化,神经元含有Fura-2-AM和暴露于不同浓度的hO(5、10和20米)。插入栏显示颜色和荧光强度比值的关系在340年和380海里。(b)直方图分析的意思是F340/380 (a)。三个图片都来自每个好,和每个神经元的F340/380计算的方法。数据表示为±SEM手段来自三个不同的实验。(c)比较PDGF-AA和PDGF-BB的影响过载引起的HO,细胞使用50 ng / mL PDGF-AA或PDGF-BB 24小时接触10紧随其后M HO15到30分钟。(d) (c)的直方图分析。数据表示为±SEM手段三个独立的实验。和与未经处理的控制;与相同的HO接触没有PDGF预处理;和与相同的HO接触PDGF-AA预处理。

然后,我们比较了PDGF-AA和bb的效果过载后H₂O₂治疗。在原位假色影像的相对,许多神经元表现出高后十μM H₂O₂治疗(图1 (c))。PDGF-AA或PDGF-BB预处理似乎减少神经元的数量显示高经过10μM H₂O₂(图1 (c))。分析的意思是表明PDGF-AA或PDGF-BB预处理没有影响在控制神经元没有H₂O₂治疗(图1 (d))。H₂O₂治疗显著诱导超载在15 - 30分钟。PDGF-AA显著抑制这过载。这种抑制是部分H后₂O₂在神经元使用PDGF-AA显著高于控制神经元,而H₂O₂治疗。在神经元使用PDGF-BB显著低于在神经元使用PDGF-AA 15 - 30分钟,类似于控制在30分钟。

4.2。PDGF-BB减毒H₂O₂全身Calpain增加活跃

因为PDGF预处理抑制H₂O₂全身的超载,我们检查是否PDGF抑制calpain激活,这是一个下游的中介过载,导致细胞损伤。我们决定calpain-1和2的活动,这些都是证明的主要亚型calpain家庭调解神经系统疾病(9]。H₂O₂治疗在培养神经元激活calpain剂量依赖性的方式从5μ米到20μM,他们的活动仍然高区段从20相似μM - 80μM H₂O₂(图2(一个))。H₂O₂全身calpain激活神经元进行24 h和PDGF-BB显著降低5到20μM H₂O₂类似的水平,在神经元没有H₂O₂治疗(图2 (b))。尽管H₂O₂全身calpain激活神经元48 h和预处理PDGF-BB似乎比控制下降到较低水平,这一差异不显著(图2 (c))。

(一)

(b)

(c)

(一)
(b)
(c)

图2

_{2 2 2 2 2 2} μ μ _{2 2 2 2 2 2} PDGF-BB对HO全身calpain激活。Calpain-1活动暴露在24小时后测定hO按照实验程序。(一)Calpain活动引发的表示数量的HO(5、10、20、40、80米)暴露增加calpain激活大脑皮层神经元5 - 20的剂量依赖性的方式((b)、(c)) Calpain神经元的活动文化使用50 ng / mL PDGF-BB 24小时前48小时(b)和(c)暴露在hOPDGF-BB完全阻塞calpain活动引起的HO。数据表示为±SEM手段三个独立的实验。和与未经处理的控制;和与相同的HO没有PDGF-BB预处理的敞口。

5。讨论

在目前的研究中,我们研究了PDGF-mediated神经通路对H₂O₂全身的氧化应激。增加胞质钙^{2 +}和随后的calpain激活代表的一个主要潜在通路活性氧化物种(ROS)介导的细胞死亡9]。在目前的研究中,H₂O₂全身的Ca^{2 +}增加与calpain激活的培养神经元被明显抑制PDGF和建议的目标PDGF的神经保护机制。

氧化应激Ca^{2 +}超载在培养的神经元被PDGF-BB明显抑制,在较小程度上,通过PDGF-AA。氧化应激的Ca^{2 +}目前已被证明引发下游几个致命的反应,包括nitrosative和氧化应激、线粒体功能障碍,蛋白酶和磷脂酶激活,高潮在细胞死亡5,28]。这个Ca^{2 +}中央机制的途径可能是受到缺血神经元的死亡和能量不足。Ca^{2 +}螯合剂BAPTA / AM诱导细胞内钙减少^{2 +},几乎完全阻止了H₂O₂全身的细胞凋亡(29日]。因此,Ca的抑制^{2 +}超载可能是机制PDGF-mediated神经保护(30.],这种机制可以对应,至少部分,PDGF-induced抑制神经细胞死亡的暴露在H₂O₂(23]。一项研究表明,神经生长因子和bFGF保护培养的海马神经元通过抑制增加Ca^{2 +}由于葡萄糖剥夺,这是与我们的结果一致31日]。

在目前的研究中,PDGF-AA显著抑制H₂O₂全身的Ca^{2 +}过载。PDGF-BB抑制钙^{2 +}超载比PDGF-AA更有说服力地。PDGF-BB以前显示激活两种PDGFR高水平,而PDGF-AA激活PDGFR -α,但不是PDGFR -β在培养的神经元23]。因此,提出了两种类型的PDGFR调解Ca的抑制效应^{2 +}过载,分别和添加剂的影响两个激活pdgfr或许可以解释更多比PDGF-AA PDGF-BB的有力影响。另外,独特的下游信号这两个pdgfr可能占PDGF-AA和bb的不同的效果;例如,PDGFR -β被证明有说服力地激活PI3-Akt通路,而它激活MAP激酶途径类似程度的PDGFR -α,如在PDGFR -β基因敲除研究培养神经元(23]。

Calpain已被证明是由活性氧或激活NMDA-induced Ca^{2 +}过载(32]。Calpain 1 (μ-calpain)和calpain 2 (m-calpain)作为一个酶原存在异质二聚体(80 kDa-29 kDa)在静息细胞,激活Ca^{2 +}在自溶的处理(产生一个异质二聚体78 kDa-18 kDa) (9,10]。这激活calpain进一步扰乱线粒体Ca^{2 +}新陈代谢,在诱导中起着关键作用独特类型的细胞死亡包括细胞凋亡、坏死,自噬(9,10,33];例如,calpain-1介导的乳沟autophagy-related基因5,这是一个关键开关从保护性自噬细胞死亡的凋亡刺激(33]。在我们先前的研究在相同的实验条件研究中,PDGF-BB抑制凋亡和nonapoptotic细胞死亡引起的H₂O₂(23]。因此,这些发现表明,抑制PDGF对calpain活动可能对应于PDGF的神经保护效应包括凋亡和non-apoptotic prosurvival机制。

证据是积累显示Ca^{2 +}过载和calpain调解excitotoxic神经元损伤的激活9,34- - - - - -36]。PDGF-B主要培养神经元免受NMDA-induced会(37]。我们报道了PDGF-B mRNA表达的抑制反义寡核苷酸夸大NMDA-induced会在新生鼠的大脑20.)的表达水平降低,成年鼠大脑神经元PDGFR -β有更多病变NMDA-induced后会引起或低温伤害(21]。因此,PDGF在Ca的影响^{2 +}过载和calpain激活所示本研究可能对应于抑制会PDGF的潜在机制。一个向内Ca^{2 +}当前是诱发氧化应激后通过NMDA受体和瞬时受体电位(TRP)频道,这属于一群离子通道(1,38]。PDGF镇压内部Ca^{2 +}电流通过NMDA受体(39,40),这可能是参与PDGF的antiexcitotoxic效应;然而,进一步的研究需要阐明PDGF在神经细胞代谢的影响30.]。

一个以前的报告表明,PDGF-AA和PDGF-BB保护海马神经元受葡萄糖剥夺或暴露在羟基radical-promoting代理,FeSO₄由于诱导抗氧化酶(41]。一种蛋白激酶的激活和MAP激酶被证明调解prosurvival影响神经元接触H₂O₂全身的氧化应激(23]。通过激活GSK3beta [PDGF-CC发挥神经保护作用24]。因此,目前报道的影响^{2 +}和calpain代谢被认为是小说PDGF的神经保护机制。Calpain和Ca^{2 +}海拔已被证明调解两个急性和慢性细胞死亡,如缺血/创伤性脑损伤和老年痴呆症,分别为(9,10]。我们的研究发现PDGF作为一个潜在的治疗干预神经元氧化应激。还需要进一步的研究来探讨PDGF-BB在氧化应激引起的神经细胞死亡的途径。

PDGF-BB的内在神经营养因子在大脑中大量表达,调节大脑反应侮辱(17,42]。在平行于持续的临床I / II期临床试验的PDGF-BB帕金森患者(43),进一步的基础研究需要针对PDGF-BB找出有效的治疗策略。

确认

作者感谢病理部门的成员和生命科学研究中心,富山大学动物管理的讨论和仔细。这个项目是由教育部科学研究补助金,文化,体育,科学和技术,日本合同批准号。23590444 (Yoko Ishii)和23590444 (Masakiyo地区)。

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