Tanshinol变弱氧化应激的有害影响成骨细胞的分化通过Wnt / FoxO3a信号

文摘

现在有越来越多的证据表明氧化应激的关键作用的开发和发展骨质疏松症。我们确认此自然抗氧化剂Tanshinol对抗氧化应激的保护作用在成骨细胞的分化和底层机制。我们的结果表明,过氧化氢(H₂O₂)导致积累活性氧(ROS),减少细胞活力、细胞周期阻滞和细胞凋亡caspase-3-dependent方式,和抑制成骨细胞的分化。Tanshinol逆转这些有害的氧化应激引发的后果。此外,氧化应激条件下,Tanshinol抑制FoxO3a转录因子的激活和其目标基因的表达Gadd45a和过氧化氢酶(CAT)同时抵消的抑制Wnt信号和目标基因的表达Axin2,碱性磷酸酶(ALP),Osteoprotegerin(功能)。这些发现进一步巩固小干扰rna干扰和过度使用FoxO3a Tcf4。结果说明,Tanshinol变弱氧化应激通过下调FoxO3a信号和救助的减少成骨细胞的分化通过upregulation Wnt信号在氧化应激。目前的研究结果表明,Tanshinol所带来的益处可能采用了新颖的治疗方法在最近公认的利基条件针对骨质疏松症。

1。介绍

大量的证据表明,“氧化应激”的理论目前已经被提出作为一种新型强化机制的开发和发展骨质疏松症与增加氧化应激,导致骨组织的退行性疾病1,2]。氧化应激的理解目前大量主题的调查,目的是开发新的方法来减少负面影响骨代谢的氧化损伤(3]。在45岁左右开始,两性经验逐步减少骨量和骨质量2],与年龄增长有关的[4),某些疾病,或使用药物,如糖尿病或过度暴露于糖皮质激素(5- - - - - -7]。的证据,但至于生理水平的活性氧(ROS)有助于维持细胞功能(8),人们普遍认为,过多的活性氧积累导致氧化应激和破坏蛋白质,脂类,和DNA,必然地导致细胞死亡(9]。根据目前的了解骨形成阶段的细胞事件在骨重塑的过程中,越来越多的研究人员揭开了潜在机制造骨细胞氧化应激引发一系列有害的事件,最终导致骨质疏松症(10,11]。足够数量的骨形成所需的成熟的成骨细胞的细胞主要是在骨重塑的一集。绝大多数的间叶细胞或间质干细胞,但是,不能分化成成骨细胞谱系细胞发生凋亡的氧化应激的情况下,负责骨形成的障碍12,13]。同时,氧化应激也会导致破骨细胞活动的增加和upregulation破骨细胞分化[14,15]。因此,一个被广泛接受的参与者在骨质疏松症的发病机理是氧化应激,导致进步增加成骨细胞凋亡的发生率,以及压倒性数量的减少造骨细胞和骨形成率。总之,受损的骨重建平衡实质上可能导致氧化应激下骨质流失。

细胞中和活性氧的有害影响调控酶的拾荒者如过氧化氢酶(CAT),同时诱导dna损伤修复基因等Gadd45a,以及几个proapoptotic消除损坏或异常细胞的基因(3]。响应涉及一系列分子事件由激活Forkhead盒O (FoxO)转录因子,它充当一个重要防御机制与氧化应激(11]。哺乳动物foxo由4个分子,包括FoxO1 FoxO3a, FoxO4, FoxO6,参与调节细胞增殖、分化、和各种细胞的寿命3]。几种类型的remolding-related骨组织细胞表达FoxO1-3 FoxO3是主要的一个,而大脑FoxO6仅限于发展中(16,17]。FoxO3a转录因子的激活ROS对抗Wnt信号,一个重要的刺激osteoblastogenesis [11]。重要的是,β连环蛋白不仅是一种基本的FoxO3a共激活剂抗氧化应激,但也是一个必要的中介规范Wnt通路的下游效应Tcf,导致骨量的规定(11,18]。

抗氧化剂,一般用作健康食品或医药代理,已建议在氧化跟压力有利影响的疾病。最近,据报道,内源性抗氧化剂水平下降到一个低学位骨质疏松症患者,和维生素C摄入量显示显著的优势提高骨密度(BMD) (19]。到目前为止,政府表现出一个确定的抗氧化的抑制作用在啮齿动物ovariectomy-induced骨质疏松骨质疏松模型(20.]。先前的研究已经证明了D(+)β3,4-dihydroxyphenyl乳酸(Tanshinol,或者叫Danshensu)隔绝丹参Bunge施加的抑制对氧化应激的影响在活的有机体内和在体外模型系统(21- - - - - -24]。我们组的先前的研究表明从长期使用过度prednisone-induced Tanshinol保护骨骨髓损伤通过刺激骨生成和抑制脂肪形成骨髓基质细胞(MSC) (25]。此外,Tanshinol有助于增加Runx2的表达式β连环蛋白mRNA和减少Dickkopf 1 (Dkk1)和过氧物酶体Proliferator-activated受体(PPARγ)mRNA,有助于积极影响成骨细胞的分化在大鼠MSC (26]。此外,白藜芦醇是一种含有多酚酸结构类似于著名的抗氧化剂Tanshinol(图2 (c)),已被用作植物雌激素的调查工具之一来处理骨质疏松症(27- - - - - -30.]。先前的研究表明,白藜芦醇产生保护作用抵消氧化应激通过监管FoxO3a通路(31日,32]。因此,Tanshinol可能废除FoxO3a的激活信号在氧化应激反应,拯救Wnt信号的失调。然而,证据从Tanshinol的影响成骨细胞的分化在氧化应激和底层机制有待阐明。此外,Tanshinol,主要在许多中药有效成分,已广泛应用临床治疗心血管疾病(33]。因此,Tanshinol与临床使用的优势可能是发达国家作为一个潜在的候选人预防和/或治疗骨质疏松症。

基于上述观点,本研究的目的是测试假设Tanshinol变弱的有害影响氧化应激在多能间充质前体C2C12细胞和成骨细胞的分化,底层机制可能参与对抗氧化应激的抑制作用通过促进规范化Wnt信号激活,同时废除FoxO3a C2C12细胞通路的激活和preosteoblastic MC3T3-E1cells。

2。材料和方法

2.1。化学品、试剂、质粒

Wnt3a和Dkk1重组蛋白是购买从研发系统(明尼阿波利斯,美国)。重组人骨形态发生蛋白(BMP-2)获得Peprotech(美国新泽西州Rockyville)。Cignal FoxO3a记者(FoxO3a-luc)和Cignal Tcf记者(Tcf-luc)购买试剂盒(美国马里兰州弗雷德里克)。pcDNA3 -β连环蛋白、pcDNA3-Tcf4 pcDNA3质粒(空向量)控制了从广州启动子(广州,广东省,中国)。FoxO3a核和小干扰rna(炒)控制由上海炒GenePharma(上海,中国)。Dual-luciferase记者从Promega化验设备购买(WI麦迪逊,美国)。高山染色设备和核蛋白质提取工具得到从Beyotime(江苏海门,中国)。活跃caspase-3酶联免疫试剂盒和骨钙素酶联免疫试剂盒购自陀Da(广州,广东省,中国)。LY294002,βFoxO3a连环蛋白,β肌动蛋白抗体购买从细胞信号技术(美国波士顿)。组蛋白H3抗体来自圣克鲁兹(帕索罗伯斯、钙、美国)。赫斯特33258年和氯化锂从Amresco购买(梭伦,哦,美国)。H₂O₂碘化、MTT Propidium(π),茜素红S,和2′,7′二乙酸-dichlorodihydrofluorescein (DCFH-DA)从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。Tanshinol和白藜芦醇(积极的控制,缩写为研究》)从PI&PI购买(广州,广东省,中国)。

2.2。细胞培养、转染和荧光素酶的活动

多能间充质前体C2C12细胞和preosteoblastic MC3T3-E1细胞获得美国类型文化集合(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)和培养在杜尔贝科的鹰的媒介(DMEM)和修改α修改鹰的介质(α分别-DMEM)。媒体补充10%胎牛血清(的边后卫)和1%的青霉素、链霉素、谷氨酰胺和1%的丙酮酸钠。细胞与显示荧光素酶记者cotransfected瞬变结构连同核或超表达结构。负控制用于炒RNA或空载体质粒。细胞被镀在96 -孔板的密度细胞/厘米²和转染共有0.3μ0.2 g RNA和/或μ克DNA为16小时。转染细胞被刷新新的媒体和培养更多8小时。随后,细胞被培养的血清饥饿的边后卫2% 4小时和治疗有或没有Tanshinol 1小时,紧随其后的是车辆控制”(体质)、“H₂O₂和/或相关试剂,24小时浓度表示。荧光素酶活性测定使用Dual-Luciferase记者分析系统根据制造商的指示。

2.3。细胞生存能力分析

细胞被镀在生长媒体在96孔板中。镀后24小时内,细胞治疗表示试剂和培养表示时间顺序。孵化后不同治疗,细胞培养进一步4小时37°C刷新媒体包含MTT(5毫克/毫升)。然后,甲瓒晶体在二甲基亚砜(DMSO)和可溶性吸光度测量的波长570 nm使用标(热费希尔科学,万塔,芬兰)。

2.4。成骨细胞的分化表型特征

C2C12细胞的密度被播种细胞/厘米²。在融合,细胞培养的成骨的中含有5%的边后卫和BMP-2 (100 ng / mL)表示试剂的存在与否。媒体改变了每3 - 4天。确定承诺造骨细胞,高山染色是在第三天使用高山颜色开发工具包。彩色细胞图像通过Eclipse E800显微镜(尼康、东京、日本)。定量测定的高山活动第三天,细胞细胞溶解在100毫米甘氨酸,MgCl 1毫米₂,1%的Triton x - 100在pH值10。细胞溶解产物受到高山活动使用一个高山分析工具包(南京建成生物技术,中国)。骨钙素分泌的上层的媒体在3天测量使用酶联免疫试剂盒,其他地方的详细描述(34]。高山活动和骨钙素浓度与细胞总蛋白的内容规范化,由一个micro-Bradford试验。衡量矿化活动,细胞染色茜素红S,如前所述[35]。红染色可视化,代表与上述显微镜拍摄的照片。

2.5。氧化压力分析

细胞内氧化应激的探测是DCFH-DA使用流式细胞仪和量化。简单,细胞被胰蛋白酶化收获,贴上DCFH-DA (20μM)为30分钟37°C。随后,细胞暴露在H₂O₂Tanshinol的存在与否或白藜芦醇30分钟,其次是荧光强度才能使用BD FACSCalibur流式细胞仪(美国BD生物科学,圣何塞,CA)。获得的数据进行了分析与CellQuest Pro软件(美国BD生物科学,圣何塞,CA)。

2.6。细胞周期进程和细胞凋亡的测量

流式细胞仪测定细胞周期分布计算细胞染色与前面描述的π(36]。观察凋亡细胞的形态学改变与赫斯特33258 (20μ米)(37],上述显微镜获得的荧光图像。凋亡细胞的核损害正常细胞和一轮完整的核形态被图像1.46 J r统计软件,分别。超微结构的形态学差异正常细胞和凋亡细胞测定使用透射电子显微镜(TEM: h - 7650、日立、东京、日本),如前所述[38]。对裂解caspase-3试验、细胞收获和细胞溶解如上所述。裂解的活性在细胞溶解产物caspase-3决心使用酶联免疫试剂盒和规范化,总蛋白质含量。

2.7。定量rt - pcr检测

RNA分离和定量实时聚合酶链反应(存在)进行如前所述[39]。短暂,每个显示组的总RNA提取使用试剂盒试剂。互补DNA合成(互补),在执行中存在Stratagene Mx3005P QPCR系统(La Jolla、钙、美国)。配对设计引物如下:Gadd45a5′-GGGCTCAGAGATGACTTTGC-3′(向前),5′-TTTTTGTCCCTTTTGCCTTG-3′(反向);猫5′-CCTCGTTCAGGATGTGGTTT-3′(向前),5′-TCTGGTGATATCGTGGGTGA-3′(反向);Axin25′-CTCCCCACCTTGAATGAAGA-3′(向前),5′-ACTGGGTCGCTTCTCTTGAA-3′(反向);高山5′-AACCCAGACACAAGCATTCC-3′(向前),5′-GCCTTTGAGGTTTTTGGTCA-3′(反向);功能5′-GCAGAAGGAACTGCAACACA-3′(向前),5′-ATGGTGAGGTGTGCAAATG-3′(反向);GAPDH5′-ATTGTCAGCAATGCATCCTG-3′(向前),5′-ATGGACTGTGGtcATGAGCC-3′(反向)。PCR结果分析了使用内髓监测分析2.0软件(Bio-Rad实验室、大力神、钙、美国)。相对mRNA表达被量化阈值减去3 -磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)周期()值的感兴趣的基因和表达的价值的协议描述的制造商。

2.8。免疫印迹分析

检测β连环蛋白表达,细胞被里帕缓冲细胞溶解。FoxO3a测量蛋白质,细胞均质FoxO3a总量的测定,进一步提取核提取试剂核FoxO3a根据制造商的指示,如前所述[40,41]。蛋白表达是由化学发光改变使用图像的测量站监控2000毫米(美国伊士曼柯达公司,罗彻斯特,纽约)。

2.9。统计分析

方差分析(SPSS 13.0)是用于检测影响的各种治疗后建立的数据正态分布和方差相等。样品被认为是正态分布。方差齐性的样品比较测试通过使用列文的测试。异质性方差被接受,LSD法是用于执行适当的治疗组两两比较。否则,邓恩的事后测试方法被用来执行成对比较治疗组。除非另有说明,结果表现为±SEM和执行至少一式三份,重复一次。

3所示。结果

3.1。Tanshinol改善细胞生存能力的减少引起的H₂O₂

为了测试Tanshinol对细胞生长的影响,要么C2C12细胞或MC3T3-E1细胞暴露在Tanshinol十倍的浓度变化从0.0001增加至1000人μ一段24小时。结果表明,与实验浓度Tanshinol施加在两个细胞的生长没有抑制效果,增加生存能力是观察到的两个细胞系Tanshinol对待,特别是在1的浓度μ(数据1(一)和1 (b))。

引起的细胞反应H₂O₂取决于细胞损害的严重程度,进一步受剂量的大小的影响。因此,我们研究了C2C12细胞的生存能力处理浓度的增加H₂O₂从0.025毫米到1.2毫米一段24小时。如图2(一个)、细胞生存能力表现出明显的减少趋势在C2C12细胞浓度的方式表示的浓度处理H₂O₂24小时,在高剂量有显著性差异(0.2毫米或以上)的h₂O₂。相比之下,细胞生存能力没有统计变化在C2C12细胞治疗H₂O₂在低剂量(0.1毫米或更低)。接下来,Tanshinol(1的影响μ米)在预防H₂O₂(0.2毫米)全身的细胞死亡是确定在不同时间点从0 h, 12 h, 24小时,36小时,48 h。很明显,24小时治疗1μM Tanshinol可以阻止细胞生存能力的减少引起的H₂O₂(图2 (b))。基于这些结果,H₂O₂剂量的0.2毫米和Tanshinol 1的浓度μ在后续实验中采用。

3.2。Tanshinol变弱氧化应激引发的H₂O₂

众所周知,细胞内ROS生成响应氧化剂刺激导致氧化应激的一系列伴随分子事件。DCFH-DA被广泛用作表明细胞内ROS生成(42]。进一步检查是否Tanshinol与多酚羟基(图2 (c))施加影响抑制细胞死亡涉及抵消H₂O₂全身的氧化应激,我们测量细胞内ROS C2C12细胞暴露于H₂O₂(0.2毫米)。微不足道的荧光在vehicle-treated C2C12细胞,而任意荧光显著增强单元中检测出细胞治疗H₂O₂30分钟,达成适当的7倍高于车辆控制。相比之下,Tanshinol或白藜芦醇治疗导致的中和活性氧积累引起的H₂O₂(图2 (d))。此外,Tanshinol的抗氧化效果与白藜芦醇是没有区别的。总的来说,结果表明,Tanshinol保护C2C12细胞对H₂O₂全身清除ROS生成氧化应激。

3.3。Tanshinol废除对成骨细胞的分化抑制氧化应激的影响

考虑到BMP-2治疗转移C2C12细胞肌原性的分化成骨细胞谱系,我们确定的最佳剂量BMP-2 (100 ng / mL)治疗的高潮高山(一种生物标志物osteoblastogenesis) mRNA表达诱导24 h(图3(一个))。评估的能力Tanshinol或白藜芦醇保护C2C12细胞免受氧化应激过程中成骨细胞的分化,我们进行了短期的成骨细胞分化实验。高山染色及其强度量化表示,车辆控制相比,Tanshinol和白藜芦醇显示显著抑制影响细胞数量的减少染色阳性高山在氧化应激(数字3 (b)和3 (c))。我们下一个验证Tanshinol可以拯救上层清液中骨钙素分泌媒体和高山水平细胞C2C12细胞溶解产物BMP-2模拟的第三天在氧化应激,以及白藜芦醇(数字3 (d)和3 (e))。此外,致力于成骨细胞C2C12细胞进行了茜素红S染色后长期的文化描绘的成骨细胞矿化结节。茜素红S染色显著降低的程度在C2C12细胞暴露于H₂O₂在第十天,Tanshinol或白藜芦醇逆转的拮抗效应₂O₂在成骨的能力(图3 (f))。综上所述,这些在我们的实验证据表明,Tanshinol可能抵消H的有害影响₂O₂在BMP-2引起氧化应激诱导成骨细胞的分化。

3.4。Tanshinol防止H₂O₂全身的细胞周期阻滞和细胞凋亡

上面的调查结果中,鼓励我们继续检查是否减少氧化应激引发的增殖和分化的能力是与细胞周期阻滞和细胞凋亡有关。首先,大幅增加细胞的比例在G0期C2C12细胞暴露于H₂O₂,以及相应的减少人口的细胞S期和G2 / M期。令人鼓舞的是,Tanshinol显示能力扭转细胞周期阻滞在S和G2 / M期,白藜芦醇一样有效,而C2C12细胞仅Tanshinol或白藜芦醇治疗没有明显影响细胞周期进展(图4(一))。

我们下一个评估细胞凋亡形态学的变化使用Hoechst33258染色C2C12细胞的染色质结构。结果表明,C2C12细胞进行了细胞凋亡的特征是染色质缩合、凋亡的身体,和核放大或碎片在治疗H₂O₂12 h(图4 (c))。这些凋亡的形态学改变使用TEM分析进一步证实了超微结构分析。明确凋亡改变发生在C2C12细胞氧化应激刺激下,核突出的特点和肿胀,胞质空泡,染色质着边,膜解体(图4 (d))。与此同时,前12 h Tanshinol或者白藜芦醇减少细胞凋亡的程度在C2C12细胞暴露于h₂O₂(数据4 (c)和4 (d))。Caspase-3需要一些典型特征的细胞凋亡和细胞死亡是必不可少的caspase-3-dependent方式活跃Caspase-3执行最终细胞死亡程序(2]。因此,我们进一步确定,在H caspase-3劈理的活动₂O₂治疗细胞是高于细胞暴露于车辆控制、和Tanshinol可以抑制有害的影响(图4 (b))。总的来说,所有这些证据提供进一步的支持,Tanshinol能够废除C2C12细胞氧化应激引起的细胞凋亡。

3.5。Tanshinol逆转抑制Wnt /β连环蛋白信号通路的条件下氧化应激

基于上述证据,我们下一个被问及Tanshinol提升所需的Wnt信号通路激活成骨细胞氧化应激条件下的承诺。利用免疫印迹,我们合并的减少β连环蛋白(规范Wnt信号转导的一个关键分子)在C2C12细胞暴露于H₂O₂被治疗Tanshinol恢复,就像白藜芦醇(图5(一个))。

阐明的角色Tanshinol upregulation Wnt通路的氧化应激的情况下,我们选择了一个直接测量监控Wnt信号通过改变Tcf-mediated转录使用Tcf-luc记者质粒。正如所料,荧光素酶的相对发光单元(RLU) Tcf-luc C2C12细胞治疗H₂O₂明显拒绝的程度近似一半的RLU细胞处理车辆控制,而且Tanshinol减毒的减少RLU由氧化应激引起的。此外,Tanshinol单独治疗增强Tcf-luc活动的增加,有效治疗Wnt3a,显示超过4倍增加的RLU。重要的是,Tcf转录活动刺激Tanshinol结合Wnt3a达到显著更高的水平(如大数十倍的车辆控制)氧化应激条件下比在正常情况下,表现出一种近似与车辆控制(图相比增加10倍5 (b))。

的差别进一步测试Tanshinol是否改善了对这些Wnt信号转导在氧化应激下,我们对目标基因的信使rna表达水平Wnt信号在应对Tanshinol C2C12细胞氧化应激,使用定量rt - pcr。最少、mRNA的表达水平Axin2,高山和功能基因受到H₂O₂治疗,引起Tanshinol的抑制性影响H₂O₂在这些目标Wnt基因(图的激活5 (c))。总之,这些证据证实,Tanshinol逆转Wnt信号在氧化应激的抑制作用。

3.6。Tanshinol块FoxO3a的激活信号对氧化应激的反应

我们下一个被问及Tanshinol抑制FoxO3a-mediated转录的激活对氧化应激的反应。首先,利用免疫印迹,我们继续验证总FoxO3a和核FoxO3a蛋白被激活在C2C12细胞治疗H₂O₂在24小时内与车辆控制和Tanshinol或白藜芦醇能削弱FoxO3a(图的表达水平的增加6(一))。随后,Tanshinol调节FoxO3a通路的能力被使用FoxO3a-luc记者构造监控。虽然H₂O₂刺激负责FoxO3a-luc的增加,符合前面提到的证据(11),治疗Tanshinol单独施加的抑制作用的FoxO3a-luc RLU近似1/2与车辆控制相比,减少和中和FoxO3a-luc诱发的增加H₂O₂在C2C12细胞(图6 (b))。此外,FoxO3a下游的一个重要目标的PI3K / Akt通路与氧化应激(43]。我们进一步证实FoxO3a-luc明显诱导的转录活动的治疗与特定的PI3K抑制剂LY294002 C2C12细胞H的存在与否₂O₂,Tanshinol块FoxO3a转录活动的激活触发LY294002条件下的氧化应激。

尽管对于相声的假定的角色规范Wnt信号和FoxO3a通路之间的氧化压力下,我们调制β连环蛋白水平化学的影响,进一步研究Tanshinol FoxO3a-luc活动。GSK-3 C2C12细胞使用β抑制剂氯化锂模仿Wnt信号诱导的积累β连环蛋白或LRP5 / LRP6抑制剂Dkk1蛋白阻止Wnt信号转导,分别。符合之前的报道(11,18FoxO3a活动),氯化锂治疗增强C2C12细胞,当细胞接受Dkk1 FoxO3a信号(图上有抑制作用6 (c))。相反,增加H₂O₂刺激RLU FoxO3a-luc活动被废除的Tanshinol不管封锁或激活Wnt信号,就像治疗Tanshinol独自在氧化应激(图6 (c))。

基于监管Tanshinol FoxO3a转录激活的活动在氧化应激反应,我们确定感应FoxO3a目标基因的信使rna表达水平等Gadd45和猫妨碍了Tanshinol C2C12细胞在使用中存在氧化应激(图6 (d))。总之,Tanshinol在FoxO3a通路激活的抑制作用可能是负责抑制氧化应激和Wnt信号参与调控。

3.7。减轻的氧化Stress-Elicited Wnt / Tcf抑制Tanshinol通过FoxO3a介导

在阐明的抑制作用Tanshinol FoxO-mediated转录的激活参与监管的规范化Wnt信号在氧化应激下,我们更加直接的检查是否过度β连环蛋白或可拆卸的小干扰rna干扰的FoxO3a可能增加的影响Tanshinol在C2C12细胞和MC3T3-E1细胞抗氧化压力。事实上,瞬态的FoxO3a击倒两个细胞系对减少FoxO3a转录活动和相应FoxO3a目标基因的信使rna表达水平下降Gadd45a和猫存在与否的H₂O₂治疗(数据7(一),8(一个),8 (c))。相反,Tcf转录因子的激活和Wnt目标基因的信使rna表达水平,等Axin2和高山显示,明显增加由于FoxO3a击倒,而且没有观察到改变Wnt信号在细胞治疗或H₂O₂。令人鼓舞的是,Tanshinol的保护作用Wnt通路在细胞转染时似乎更强烈FoxO3a siRNA比与炒RNA转染的细胞,尤其是在氧化应激条件(数据7 (b),8 (e)和8 (g))。

已经证实在激活FoxO3a Tanshinol活动的抑制作用在C2C12细胞处理氯化锂,我们下一个调查是否规范Wnt信号通过的激活β连环蛋白过度阻碍FoxO-mediated转录。如数据所示7 (c)和7 (d),类似的增加的趋势在Tcf FoxO3a-mediated转录活动中观察到的两个细胞系pcDNA3——对待β连环蛋白。同时,Tanshinol中和Tcf转录活动的减少,同时缓解FoxO3a转录活动的增加。以前的证据表明FoxO和Tcf4争夺互动β连环蛋白FoxO的交互β连环蛋白抑制Wnt / Tcf通路(44]。然后,我们证实FoxO3a的转录活动降低到一个较低的水平细胞pcDNA3-Tcf4处理;相比之下,Wnt / Tcf信号被过度激活的Tcf4 C2C12细胞和MC3T3-E1细胞有或没有治疗H₂O₂(数据7 (e),7 (f),8 (b),8 (d),8 (f),8 (h))。综上所述,这些研究结果提供的证据表明,Tanshinol救援的抑制Wnt /β连环蛋白/ Tcf信号的差别在氧化应激通过对这些基因在C2C12细胞和MC3T3-E1 FoxO3a转录活动。

4所示。讨论

在骨骼组织,过多的活性氧积累和随后的氧化应激激活的开发和进展中扮演分摊的角色骨质疏松症(45,46]。基于证据确凿的证据突出的角色ROS生产在老年性骨质疏松症或继发性骨质疏松症,我们在此证实氧化应激降低成骨细胞的分化,这可能被抗氧化剂获救。以前,我们表明,天然抗氧化剂Tanshinol有可能促进成骨细胞的分化,形成骨基质和骨矿化,从而显示了强烈的保护作用抵消糖皮质激素(GC)全身骨质疏松症(25),如白藜芦醇有效(29日,30.,47- - - - - -49]。这个报告的证据说明Tanshinol改善氧化应激的有害影响的扩散和BMP-2-stimulated成骨细胞的分化在C2C12细胞,多能间充质前体(数字2和3)。此外,我们发现Tanshinol与救济的保护作用的细胞周期阻滞和细胞凋亡的抵抗(图4)。特别,我们延长了工作在本研究确认的保护影响Tanshinol对成骨细胞的分化功能的条件下氧化应激通过激活Wnt信号级联,并说明Tanshinol应对的能力通过抑制氧化应激FoxO3a转录因子(数字5,6,7,8)。

Tanshinol是一种多酚酸组件分离丹参Bunge,其化学结构由几种多酚羟基(图2 (c)),就像白藜芦醇(50),这有助于抑制氧化应激通过调节FoxO3a转录因子(31日,32,51]。底层机制是什么,Tanshinol防止氧化应激过程中成骨细胞的分化?基于本研究的结果和先前的报道,至少有几个可能的机制。首先,我们的研究结果表明,H₂O₂引起氧化应激的增加以及随后导致细胞生存能力下降,与以前的工作相一致的其他人(图2)[52]。此外,本报告提出的进一步的证据表明,凋亡的反应是观察形态学和caspase-3反映出一种潜在的激活细胞死亡机制caspase-3-dependent方式过程中细胞凋亡(图3)。众所周知,细胞凋亡主要是收敛的外在和内在途径激活半胱天冬酶级联的下游效应caspase-3,这是由氧化应激转变成裂解caspase-3然后施加影响细胞死亡的最后阶段,包括细胞收缩,细胞膜磷脂酰丝氨酸(PS), DNA碎片,最终细胞凋亡53,54]。此外,活跃caspase-3有能力坚持一种蛋白激酶,从而抑制PI3K / Akt信号通路,进而迁址foxo蛋白质回核同时激活转录活性和诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡55,56]。简单地说,我们的数据表明分子机制,预防Tanshinol对细胞周期阻滞和细胞凋亡诱导的影响由活性氧可能与监管有关的caspase-3 / FoxO3a通路在氧化应激。未来研究需要解决的问题是Tanshinol会使caspase-3 / FoxO3a通路级联废除激活细胞凋亡,这有助于阐明我们的理解的保护作用Tanshinol FoxO3a的成骨细胞的分化条件下活化细胞对氧化应激的反应。

本研究中的证据表明Tanshinol有助于抑制氧化应激的有害影响BMP-2在C2C12细胞刺激成骨细胞的分化。之前的研究表明,我国TGF -内组成一个亚科β总科和发挥了重要作用在骨骼发育和成年骨内稳态57]。与前面的结果一致(58),连续BMP-2暴露的分化开关转换C2C12成肌细胞向成骨细胞谱系细胞(图3)。此外,治疗Tanshinol改善C2C12细胞成骨分化的衰落刺激下BMP-2氧化应激。的证据在体外先前的研究暗示β连环蛋白是一个需要下游因子BMP-2成骨细胞矿化的Wnt自分泌的方式循环(59]。我们的发现表明治疗Tanshinol C2C12细胞有助于upregulation Wnt信号。综上所述,在这个研究结果表明Tanshinol可能有利于成骨细胞的分化在氧化应激通过Wnt / BMP-2通路级联。

虽然也认为氧化应激刺激FoxO3a信号通路的激活,随后导致竞争的Tcf蛋白质协会的有限β连环蛋白,氧化应激和Wnt信号通路之间的相互作用仍有争议。了多方面的证据支持的功能作用的差别中氧化应激对这些Wnt通路在阿,C2C12 OB-6和/或HEK293细胞(11,18,60),其他研究人员,然而,有一个相反的概念,氧化应激导致激活Wnt /β连环蛋白通路和下游Tcf L细胞信号,NIH3T3或HEK293细胞(61年),内皮细胞(62年,糖尿病性视网膜病变(大鼠模型63年,64年]。,不同于上述证据,从我们的实验结果在C2C12细胞和MC3T3-E1细胞支持Wnt通路下游Tcf信号是由氧化应激,抑制和抗氧化剂Tanshinol逆转的失调Tcf转录活动。找到类似于我们先前建立的工作Tanshinol抑制Dkk1 mRNA水平和刺激的表达β连环蛋白和Runx2鼠骨髓基质细胞分化过程中有或没有GC治疗(26]。然而,Tcf信号通路被激活显著氧化应激在C2C12细胞的结合Wnt3a Tanshinol,大约4倍高于没有氧化应激。也许Tanshinol上调Wnt通路级联与Wnt3a协同改善有害氧化剂对细胞氧化应激下的功能。

之间的差异的结果相反的证据,我们可能是由于不同的实验设计和可能位于不同的机制。一个决定性作用的积极影响氧化应激的外生Wnt3a Wnt信号激活的可能与内源性nucleoredoxin (NRX),作为抑制Wnt /β连环蛋白信号通过协会衣冠不整(Dvl),以及Dvl之间的复杂和wto NRX受损的氧化H₂O₂治疗,导致的Wnt信号级联激活受体卷曲的Tcf转录因子(61年]。的另一个原因Wnt通路的激活在氧化应激可能源自LRP6 Wnt受体的稳定和增加LRP6水平引起的氧化剂,如H₂O₂(64年]。

最终,证据表明FoxO3a siRNA或超表达Tcf4显示了相似的影响Wnt信号的激活和抑制FoxO3a转录活动的C2C12细胞和MC3T3-E1细胞治疗或没有氧化剂刺激。Tcf -和FoxO3a-mediated转录活动,然而,由于过度升高β连环蛋白在细胞氧化应激。先前报道(18,44),它是至关重要的细胞偏离Tcf FoxO3a氧化应激条件下,和一个角色β连环蛋白的抗氧化应激已经强调了在这些研究中。之间有分歧之前的证据和这里的观察报告。一个更有趣的和可能的解释这种差异可能驻留在目前的事实不是这样的β连环蛋白为反动FoxO3a转录因子的激活蛋白在氧化应激,但Tcf转录因子。因此,激活的抑制FoxO3a有助于对抗氧化应激的抑制作用Wnt / Tcf通路可能依赖Wnt信号的能力。有趣的是,似乎Tanshinol FoxO3a活动施加任何影响或Wnt信号在细胞的条件下小干扰rna干扰或FoxO3a Tcf4超表达。同时,双重改善的影响Tanshinol FoxO3a-mediated转录的激活和抑制Tcf-mediated转录中观察到细胞氧化应激。进一步的研究需要解决和扩大目前的发现在活的有机体内。

总之,我们提供了本小说可行分子解释Tanshinol抵消氧化应激的抑制作用于成骨细胞的分化。这些结果强烈支持这样的观点:Tanshinol进行清除ROS,随后变弱氧化应激,FoxO3a信号的差别导致对这些负责caspase-3-dependent细胞凋亡和细胞周期阻滞。此外,Tanshinol上调Wnt信号级联,是通过增加活动的Tcf转录因子氧化应激下成骨细胞的分化。我们的研究表明的有利影响Tanshinol可能作为一种新颖的治疗方法在最近承认的条件下开发的市场定位骨质疏松症。实际上,Tanshinol用作批准药物的主要有效成分治疗心血管疾病的十年来在中国,需要进一步的研究来调查可能的候选人是否在骨质疏松症的预防和治疗性应用程序通过操纵Wnt / FoxO3a通路的骨组织。

利益冲突

所有作者的状态,使他们没有披露,没有利益冲突。

确认

本研究支持的补助金从中国国家自然科学基金(批准号81273518),广东医学院的科技创新基金(STIF201104)和广东省自然科学基金(S2011020005206和2012 b060300027)。Yajun杨的概念和设计,参与收购的数据,数据分析和解释,起草和修改论文,批准的最终版本。实证苏,Dongtao王、陈Yahui参与收购数据和修改纸和批准了最终版本。吴系参与数据分析和起草和批准的最终版本。廖崔,Xuegang太阳,李刚和导致了概念和设计,数据解释和起草和修改论文和批准的最终版本。廖崔和Xuegang太阳接受数据分析的完整性负责。

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