文摘

这项研究调查了假设急性高血糖(HG)块缺血预处理(IPC)通过抑制一种蛋白激酶磷酸化。简短的HG约400 mg / dL是诱导C57BL / 6小鼠经腹腔内注射20%的葡萄糖(2 g /公斤)。所有的老鼠进行了40分钟的小伙子闭塞和60分钟再灌注。IPC协议2周期5分钟缺血和5分钟缺血再灌注前索引。结果。控制老鼠,梗塞大小(如果)为51.7±2.0(%风险地区)。如果50%至25.8±3.2(预处理减少与控制)。在HG老鼠,如果是58.1±2.3显著加剧。然而,IPC的作用完全消失在HG老鼠。血糖与胰岛素正常化IPC前5分钟恢复保护作用。管理CCPA指数缺血前模仿IPC的效果。CCPA的保护作用,而不是变时性的效果,完全消失在HG老鼠。心脏组织一种蛋白激酶的磷酸化指数提高了缺血IPC或CCPA但被HG两组显著抑制。规范化的血糖与胰岛素一种蛋白激酶磷酸化的抑制HG逆转。结论。HG废除预处理通过抑制一种蛋白激酶磷酸化的保护作用。血糖与胰岛素就可以恢复正常化预处理的保护作用。

1。介绍

围术期高血糖通常出现在接受心脏手术的患者(1- - - - - -3]。高血糖在心肺旁路死亡率和发病率的一个独立危险因素在糖尿病和非糖尿病的患者(3]。越来越多的临床证据表明,急性高血糖(或应激性高血糖)是独立与较大的心肌梗死(MI)的大小和左心室功能受损患者在糖尿病和非糖尿病患者(4- - - - - -6]。动物实验也表明,MI的大小增加应对海拔在血糖水平7,8]。

缺血预处理是一个强大的内源性保护机制对心肌缺血/再灌注损伤,这是短暂的缺血和再灌注前长时间的指数心肌缺血和再灌注9]。然而,糖尿病和急性高血糖的心血管效应已被证明,以抵消缺血性和药理预处理在动物和人类7,10- - - - - -12]。高血糖的预处理的封锁的机制仍有待定义。胰岛素在临床上已用于治疗急性或应激性高血糖。这也是众所周知,胰岛素产生有益的预处理效果对心肌缺血/再灌注损伤(13,14]。在高血糖的设置,只有一些相互矛盾的结果已报告在preconditioning-mimetic胰岛素的影响。动物研究报道,急性高血糖的恶化的不利影响心肌梗死或缺血性预处理的封锁是独立的胰岛素(7,15]。然而,其它的研究似乎支持使用胰岛素在高血糖的患者恢复预处理效果或动物(16,17]。现在众所周知,激活腺苷₁受体(₁R),通过缺血性预处理或特定的受体激动剂,触发对心肌缺血/再灌注损伤保护作用[18- - - - - -24]。然而,急性高血糖在阻塞的作用₁R途径在很大程度上是未知的。

目前的研究工作在活的有机体内小鼠模型的心肌缺血和再灌注损伤评估₁R信号和高血糖的一种蛋白激酶磷酸化的抑制脑缺血预处理,以及评估胰岛素的作用恢复缺血预处理对小鼠急性高血糖的影响。

2。材料和方法

这项研究符合指导实验室动物保健和使用的发表的美国国立卫生研究院(第八版,修订2011)和协议下进行批准的弗吉尼亚大学动物保健和使用委员会制度。

2.1。代理和化学物质

氯化三苯基四唑(TTC)和2-chloro-N (6) -cyclopentyladenosine (CCPA)从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州)。酞青蓝是购自Heucotech有限公司(沙,PA)。Clinical-grade胰岛素是购自Eli莉莉(印第安纳波利斯,)。

2.2。动物和实验协议

七十二C57BL / 6小鼠(参与周大)从杰克逊实验室购买用于这项研究。三个老鼠死亡,三个老鼠排除由于酞青蓝染色的技术故障。其余的老鼠,共有66个,被分配到8种不同的群体进行了40分钟的缺血和再灌注如图60分钟1。额外4代表这些老鼠/组8组治疗同样和安乐死提供索引缺血前心脏组织。

腹腔注射20%葡萄糖所致急性高血糖是50分钟前小伙子闭塞的剂量2μL / g体重(8]。缺血预处理是应用于小鼠生理盐水后30分钟,或葡萄糖注射液的两个周期5分钟缺血再灌注和5分钟。在来的老鼠,胰岛素是通过颈外静脉注射前10分钟缺血预处理或之前指数小伙子闭塞(nonpreconditioned老鼠)剂量的0.2 - -0.4×10⁻³单位/ g(0.1单位/毫升,2 - 4μL / g)使血糖水平正常化。CCPA-treated组,CCPA管理前20分钟指数小伙子闭塞的剂量25μ通过颈外静脉克/公斤。

2.3。心肌缺血/再灌注损伤和梗塞大小的测量

老鼠进行40分钟的心肌梗塞后的60分钟再灌注之前详细(8,25,26]。简单地说,老鼠与戊巴比妥钠麻醉(100毫克/公斤i.p。)和口头插管。人工呼吸是维持FiO₂每分钟0.80,100年中风,体积0.2到0.5毫升中风。通过左胸心脏被曝光。7丝缝合被周围的小伙子在1毫米级不如左心耳,和一个小气球遮光板由微内径聚乙烯管(一小部分Inc .、西雅图、佤邦)贴在童子。缺血和再灌注引起的膨胀或收缩型气球,分别。心电图监测围手术期使用PowerLab仪表(科罗拉多斯普林斯,ADInstruments有限公司)。再灌注后的小鼠安乐死60分钟,心是通过升主动脉插管灌注TTC 3到4毫升的1.0%。小伙子当时reoccluded相同的缝合用于心肌梗塞,然后10%酞青蓝灌注(RR)来确定风险区域。左心室然后切成5到7横片重和数码拍照来确定梗死大小RR的百分之一。

2.4。免疫印迹

总蛋白提取使用里帕从实验组显示缓冲区,和蛋白质浓度由BCA蛋白质分析(热科学,罗克福德,IL)。西方的屁股都是按照标准的程序执行。20毫克的蛋白质sds - page分离了12%。转让后,硝化纤维膜(Bio-Rad大力神,CA)探测主要抗体探测pan-AKT或phospho-AKT S473(细胞信号技术,贝弗利,MA)在1:1000稀释。二次抗体(Promega,麦迪逊,WI)被应用于1:5000稀释在屏蔽解决方案在TBS-T牛奶(1%)。蛋白质是可视化增强化学发光底物(热科学,罗克福德,IL)其次是微密度分析使用FluorChem 8900成像系统(αInnotech,圣克拉拉,CA)。

2.5。统计分析

所有数据提出了均值±SEM(平均数标准误差)。Peri-ischemic心率变化进行了分析使用重复测量方差分析后跟Bonferroni成对比较。所有其他数据比较使用单向方差分析紧随其后以及与Bonferroni调整未配对的数据。

3所示。结果

3.1。围手术期心率变化

表1报告心率变化之前、期间和之后小伙子闭塞。小伙子闭塞后心率显著增加,升高直到早期再灌注。之间没有显著差异在心率控制和治疗的老鼠。在小鼠缺血性预处理,小伙子闭塞后心率也显著增加。第一周期的再灌注,多达40%的老鼠发达短暂的心动过速的心跳达到从1000年到1500年的bpm。这持续了几秒钟,自发地回到基线。心动过速的发生没有任何预处理组之间不同。然而,这种类型的心律失常在长时间后未见指数小伙子闭塞。

3.2。急性高血糖和胰岛素正常化的老鼠

血糖水平与传统血糖仪监测(它、汽车控制地中海。Inc .)、加拿大)通过刺穿尾静脉。一个腹腔内丸注入20%的葡萄糖(10μL / g或2 g葡萄糖/公斤体重)实现瞬态400和500 mg / dL之间的血糖水平在20到30分钟(表1)。静脉注射的胰岛素剂量的0.2 - -0.4×10⁻³单位/ g规范化血糖水平100 - 200 mg / dL在5分钟()。

3.3。急性高血糖加重心肌缺血/再灌注损伤

三组小鼠(图1,前三组)进行了40分钟的小伙子闭塞60分钟再灌注紧随其后。平均血糖水平在小伙子闭塞168±27 mg / dL saline-treated控制老鼠(对照组),438±51 mg / dL高血糖的老鼠(HG组),和467±47 mg / dL前胰岛素注射和140±12 mg / dL胰岛素治疗后小鼠在HG +来(HG +胰岛素组)(见表1)。在危险地区没有统计学差异(RR, %的LV)其中三组小鼠((左列在图2)。梗塞大小控制老鼠为51.7±2.0 RR (%)。在HG老鼠,梗塞大小显著加剧了59.5±2.3(增加15%,与控制)。梗塞大小相似的增强在HG +胰岛素老鼠和HG老鼠(57.4±2.2,与控制,数据2和3)。

3.4。急性高血糖废除的影响缺血性预处理和胰岛素恢复它

如表所示1,血糖水平在缺血性预处理或索引缺血被可比euglycemic和高血糖的组。胰岛素治疗血糖水平回到euglycemic返回基线。在危险地区没有统计学差异(RR, %的LV)组((左列在图4)。缺血性预处理减少梗塞大小为25.8±3.2%(减少了50%,与控制)。这种infarct-limiting效应完全消失在HG + Pre-C老鼠(58.0±1.5%,对HG老鼠)。正常化血糖与胰岛素5分钟前的预处理过程,部分恢复预处理对心肌梗死的保护作用(33.0±3.7%,对控制或HG老鼠)。心从平行组小鼠收获指数前40分钟小伙子闭塞。磷酸化Akt的比例相对于总Akt在心脏组织在Pre-C老鼠被发现显著增强,但显著抑制HG老鼠和HG + Pre-C老鼠相对于虚假的控制。然而,与胰岛素血糖正常化前预处理协议逆转HG在一种蛋白激酶磷酸化的抑制效果(图5)。

3.5。急性高血糖废除腺苷的保护作用₁受体激动剂

CCPA是有选择性的₁R受体激动剂和诱发缺血保护作用如果应用索引。初步剂量反应研究CCPT显示严重心动过缓euglycemic老鼠100剂量μ克/公斤和50μ克/公斤,破坏生存在缺血/再灌注。此外,HG老鼠不能容忍CCPA缺血期间这两个剂量而死。一剂CCPA 25μ克/公斤因此选择当前的研究。虽然这个剂量显著低于其他动物模型在文献中报道,严重的心动过缓发生静脉注射后约30秒,然后慢慢改进。euglycemic老鼠CCPA心率下降,从413±310±23胜/分钟(减少了25%,)。心率缓慢增加回指数缺血前的基线。心率在基线HG老鼠不同,控制老鼠,而CCPA降低心率从401±14到258±21次/分钟(减少了36%,)。HG小鼠心率增加到345±15之前指数缺血,这仍然远远低于基线()。血糖水平小伙子闭塞168±27之前控制老鼠,CCPA-treated老鼠,和355年186±8±23 CCPA-treated HG老鼠(mg / dL与控制)。CCPA-treated老鼠,梗塞大小相当的Pre-C组(19.0±2.8和25.8±3.2,%的RR)和显著低于控制老鼠(19.0±2.8和51.7±2.0,)。然而,infarct-sparing CCPA效果消失在HG老鼠(55.0±4.2,与控制;参见图6)。心从平行组小鼠收获前40分钟小伙子闭塞。CCPA磷酸化的比例增加到总Akt在心脏组织euglycemic控制老鼠逾2倍((图),但不是在HG老鼠7)。

4所示。讨论

越来越多的证据表明,急性高血糖(或压力)是一个独立的心血管发病率和死亡率的预测(3,27- - - - - -29日]。急性或应激性高血糖与增加氧化应激(8,30.- - - - - -33),炎症(34- - - - - -37,激活逆境应答激酶信号(29日,35]。梗塞通常是更大的压力或糖尿病引起的高血糖患者(4,5,29日,38),和动物急性高血糖维持明显更大的实验性缺血/再灌注后梗塞比euglycemic控制(7,8,10,11]。此外,急性高血糖完全废除缺血预处理的保护作用,否定一个强大的内生心血管机制,使心肌细胞更容易缺血/再灌注损伤(7,9,10,39,40]。药物预处理据报道也被严重抑制高血糖(7,15,39,41]。缺血性预处理的高血糖的封锁机制尚不清楚。几行高血糖的证据指向3可能的目标可能废除预处理效果:(1)增加活性氧的生产(41,42),(2)抑制PI3-Akt通路(43,44),(3)抑制K_{三磷酸腺苷}渠道(17,45]。然而,MAP激酶似乎并没有受到急性高血糖的事件(12,39]。

高血糖否定缺血预处理的保护作用,最重要的是,似乎干扰胰岛素的有益的影响(7,15]。但是,其他的研究也报道说,政府的胰岛素可能恢复缺血或药理预处理[16,17]。胰岛素本身就是一个preconditioning-mimetic并发挥其有益的影响通过激活PI3-Akt通路(13,44,46]。临床,积极治疗与胰岛素似乎改善一系列与急性高血糖和相关的代谢和生理影响似乎是合理的,如果正常,否则不能维护。然而,越来越多的临床证据表明,急性高血糖(或应激性高血糖)是独立与较大的心肌梗塞大小有关,在糖尿病和非糖尿病患者左心室功能受损患者(4,5]。胰岛素的潜力来减轻对高血糖的影响心肌缺血/再灌注损伤是目前不清楚,虽然临床试验glucose-insulin-potassium (GIK)治疗急性心肌梗死肯定是相关的。GIK疗法可以改善心血管性能冠状动脉手术后(2]。此外,最近的一次临床试验使用早期静脉GIK管理局疑似急性冠脉综合征患者复合端点的报道明显降低心脏骤停或住院死亡率在安慰剂组(4.4%和8.7%)(47]。因此而GIK治疗最初被设计成提供平衡代谢支持缺血性心肌细胞,有可能的有利影响血糖/ normoglycemic夹也可能涉及的机制研究在当前的研究中。本研究采用行之有效的在活的有机体内小鼠模型探讨胰岛素的作用在治疗急性心肌缺血/再灌注损伤和恢复缺血预处理在急性高血糖的影响。

在当前的研究中,所有的老鼠进行了40分钟的小伙子闭塞和60分钟再灌注。小伙子闭塞的40分钟时间被选为最大灵敏度急性高血糖的不利影响和Pre-C的心血管效应。长小伙子遮挡会减少我们的敏感性检测梗死恶化由于高血糖,而短遮挡会减少我们的敏感性检测心脏保护。60分钟再灌注的选择是基于我们之前的研究显示,老鼠心肌梗死达到> 95%的最后60分钟内(24小时)大小再灌注(48]。急性高血糖又证明了加剧心肌梗塞大小之前报道小鼠模型中30分钟小伙子闭塞和60分钟再灌注(8]。血糖水平正常化缺血发作之前未能抵消梗塞恶化继发于急性高血糖(图的短暂的插曲2)。我们之前的研究表明,急性高血糖增强小鼠氧化应激和加重心肌梗塞大小通过激活NADPH氧化酶(8]。尽管胰岛素是通过preconditioning-mimetic心血管效应(13,44,46),其有益效果的设置急性高血糖(图消失了2)。急性高血糖的梗塞夸大效果保留即使血糖水平是规范化缺血的发作之前,表明一旦高血糖引发炎性信号通路(8仅靠胰岛素),反转的高血糖不能阻止正在进行信号转导。急性高血糖也使心肌细胞容易受到损伤通过抑制一种蛋白激酶的磷酸化(图5)。然而,胰岛素的保护作用可能是高血糖的不利影响所掩盖。

在缺血预处理的研究中,我们的研究结果支持先前的研究显示,急性高血糖完全废除的影响缺血性预处理对心肌缺血/再灌注损伤(7,9,10,39,40]。高血糖施加这种影响通过抑制一种蛋白激酶的磷酸化(数字4和5)。我们所知,这是第一个报告显示,缺血预处理对心肌梗塞的高血糖的损失是与一种蛋白激酶的磷酸化的抑制有关。与其他报告(7,15),我们的研究表明,血糖正常化前预处理协议完全恢复缺血预处理(图的心血管效应4)。通过规范血糖,胰岛素帮助恢复一种蛋白激酶的磷酸化缺血性预处理。Akt是一个重要的调停人的细胞生存和长期以来一直与缺血预处理(49]。胰岛素可以激活PI3K-Akt通路和对抗氧化应激,可能通过增加没有释放50- - - - - -52]。高血糖的底层机制抑制一种蛋白激酶磷酸化,无论是直接或间接高血糖的影响,没有在本研究调查。我们发现胰岛素没有直接保护作用在急性高血糖的设置,但可以恢复限制心肌梗死缺血预处理的效果。这种现象进一步证实了我们的结论:急性高血糖激活炎症反应,另一方面降低了内部在心肌细胞防御机制。

高血糖在预处理的效果很可能直接影响心肌细胞的葡萄糖。高血糖在阻断腺苷没有直接影响₁受体(₁R)激活,这是一个良好的中介的缺血性预处理。我们的数据表明,急性高血糖块缺血性预处理的干扰信号通路下游₁R但不是₁R激活本身因为高血糖阻塞CCPA(数据的保护作用6和7),但不是CCPA引起的心动过缓。

目前的研究提供了间接的证据表明一种蛋白激酶磷酸化的抑制急性高血糖负责废除缺血性预处理的心血管效应。然而,这些结果明确保证未来调查急性高血糖如何抑制一种蛋白激酶的磷酸化,以及Akt的下游信号转导途径撒谎。未来的研究使用转基因小鼠和siRNA-mediated降价预期进一步阐明急性高血糖的影响在这个clinicallyrelevant信号转导通路。

总之,目前的研究清楚地表明,急性高血糖加重心肌缺血/再灌注损伤和完全废除缺血预处理的保护作用通过抑制一种蛋白激酶磷酸化。胰岛素治疗规范化血糖水平未能抵消高血糖的不利影响但可以恢复缺血预处理的心血管效应。

资金

这项研究是由国立卫生研究院R01 HL a 092305 -欧文·l·克隆亚麻和布伦特法语。