文摘

指定网站的作用合成香豆素衍生物7-hydroxy-3 -(4′羟苯基)香豆素(HHC)和7-hydroxy-3 -(4′羟苯基)dihydrocoumarin (HHDC),评估其对额外的影响,细胞内活性氧(ROS)形成phorbol-myristate-13-acetate人类中性粒细胞(PMA)刺激。我们还研究了希尔顿酒店的影响和可能的分子机制参与HHDC NADPH氧化酶的活化,也就是说,PKC活性,磷酸化的PKC (α,β二世,δ),NADPH氧化酶亚基磷酸化的p40^phox。在不影响细胞毒性,香豆素测试都是有效的抑制剂/中性粒细胞在细胞外产生的ROS水平的食腐动物。HHC明显减少氧化剂生产同时,细胞,PKC活性下降,部分PKC的磷酸化α,β二世。另一方面,我们没有观察到任何PKC的香豆素衍生物对磷酸化的影响δNADPH氧化酶亚基p40和磷酸化^phox,建议参与PMA-dependent细胞内激活过程。符合我们之前的研究,我们假设不同分子结构的希尔顿酒店和HHDC不同物理化学和自由基清除负责各自不同特点对参数测试的影响。

1。介绍

中性粒细胞是第一道防线的关键细胞,但他们也认为强有力的炎症细胞造成组织损伤。因此化合物防止广泛的能力和有潜在危险的中性粒细胞的激活已被建议作为一个重要injury-limiting方式。香豆素类属于群植物衍生的多酚化合物具有广泛的生物化学和药理作用,如抗艾滋病病毒、抗炎、抗氧化、抗菌、抗凝剂和抗癌活动(1- - - - - -4]。在过去几年,自然以及合成香豆素类被广泛研究,其中许多被认为更有吸引力的候选人在治疗的发展。

生产活性氧(ROS)在中性粒细胞吞噬细胞和其他与NADPH氧化酶的活化,multiprotein酶复杂,在先天免疫中扮演着重要的角色。然而过度ROS生成的吞噬细胞参与组织损伤与许多慢性炎性疾病相关(5- - - - - -7]。在休眠细胞,NADPH氧化酶活性及其组件分布在胞液和膜。当细胞被激活时,胞质成分(p40^phox,p47^phox,p67^phox和Rac2)迁移到膜,与膜结合组件(flavocytochrome b558)组装NADPH氧化酶催化地活跃,导致活性氧的交付到细胞外环境中或在吞噬泡(8- - - - - -10]。NADPH氧化酶也激活特定的细胞内的隔间内,导致细胞内ROS生产可能直接参与信号转导。据报道,NADPH氧化酶的胞质部分,p40^phox与细胞色素b associates,特别是在细胞内的膜(10- - - - - -13]。中性粒细胞ROS的本地化生产和其可能的调控从而发挥重要作用的发展有效的治疗方法来控制与慢性炎症相关的损害(8,14]。

蛋白激酶C (PKC)可以激活NADPH氧化酶在几种类型的细胞,如吞噬细胞、心肌细胞、主动脉内皮细胞、血管平滑肌细胞,肾系膜细胞(15,16]。各种各样的PKC刺激过氧化物的产生,包括α,β,δ,ε,ζ(17,18]。中性粒细胞强烈激活PKC激活佛波醇酯,连同几个PKC的表达在中性粒细胞建议PKC在中性粒细胞功能的作用19]。PKC的人类中性粒细胞包含多个同形像,包括Ca^{2 +}/ DG-dependent同形像,α;或者拼接β我和β二世;Ca^{2 +}独立/ DG-dependent同形像δ;和phosphatidylserine-dependent Ca^{2 +}/ DG-independentξ(19,20.]。在无细胞系统,PKCα,β,δ与监管机构的NADPH氧化酶和过氧化物生成(21]。此外,PKCδ已经建议负责细胞内ROS生成在PMA激活中性粒细胞(22]。

相比以前,我们的影响7-hydroxy-3 -(4′羟苯基)香豆素(HHC)和7-hydroxy-3 -(4′羟苯基)dihydrocoumarin (HHDC)刺激吞噬细胞功能和他们的物理化学特性和自由基清除活性化学分析(23]。

指定网站的作用合成香豆素衍生物HHC和HHDC(图1),我们评估其对额外的影响,细胞内活性氧形成PMA刺激人类中性粒细胞。我们还研究了希尔顿酒店的影响和可能的分子机制参与HHDC NADPH氧化酶的活化:PKC活性,磷酸化的PKC (α,β二世,δ),子单元p40磷酸化^phox。

2。材料和方法

Phorbol-myristate-13-acetate (PMA)、鲁米诺(5-amino-2, 3-dihydro-1 4-phthalazinedione) isoluminol (6-amino-2, 3-dihydro-1 4-phthalazinedione)、超氧化物歧化酶、右旋糖酐(平均464.000兆瓦),和蛋白酶抑制剂鸡尾酒:104更易与L AEBSF [4 - (2-aminoethyl)盐酸氟化benzenesulfonyl], 0.085 L更易与抑肽酶,更易与1.53 L盐酸bestatin,更易与1.40 L e - 64 [N - (trans-epoxysuccinyl) -L-leucine 4-guanidinobutylamide], 1.90 L亮抑酶肽更易hemisulfate盐,和4.22更易与L抑肽素在DMSO,买来Sigma-Aldrich化学(Deisenhofen、德国),辣根过氧化物酶(合)和过氧化氢酶从默克公司(达姆施塔特,德国)和Lymphoprep(密度1.077克/毫升)从奈科明制药公司(挪威奥斯陆)。

希尔顿酒店和HHDC Juraj博士提供的请Harmatha研究所的有机化学和生物化学,AVČR,布拉格,捷克共和国,和简Šmidrkal教授化学研究所的技术,乳制品和脂肪技术,AVČR,布拉格,捷克共和国。

希尔顿酒店(1.27毫克)溶解在20的混合物μ氢氧化钠和980 L 1μ136.9 L Tyrode解决方案(Tyrode解决方案包括更易与L氯化钠,2.7 L更易与氯化钾,11.9 L NaHCO更易₃,0.4更易/ L不₂阿宝₄h·2₂啊,1 L MgCl更易₂h·6₂啊,和5.6更易与L葡萄糖,pH值7.4)。股票的解决方案(5更易/ L) Tyrode解决方案给HHC样本,进一步稀释浓度0.01 -100μmol / L。相应的最终浓度的氢氧化钠是0.4 -400μmol / L;在这些浓度,溶剂剂单独没有减少中性粒细胞的活动和生存能力。

所有其他化学物质的分析级可用来自商业来源。

这项工作是由当地伦理委员会批准,实验药理学和毒理学SAS研究所。

2.1。人类中性粒细胞的血液采集和隔离

新鲜血液是在健康志愿者的血库(男性,20 - 50岁)肘前的静脉穿刺,并立即与v / w柠檬酸三钠的3.8%,混合比例的9毫升血液1毫升的柠檬酸,在聚丙烯离心管。红细胞被允许沉积物在3%右旋糖酐溶液(1×g, 25分钟,22°C)和中性粒细胞被梯度离心法分离Lymphoprep (500×g, 30分钟,22°C)。污染低渗的溶菌作用后红细胞、中性粒细胞洗和resuspended钙,magnesium-free磷酸缓冲盐更易/ L: 137氯化钠,氯化钾的2.7,8.1 Na₂HPO₄1.5 KH₂阿宝₄和pH值7.4,最后1×10的浓度⁷细胞/毫升。获得的细胞悬液中含有96%以上可行的细胞,所评估的台盼蓝排斥(24,25]。中性粒细胞激活研究之前,这些细胞被resuspended在磷酸缓冲盐(PBS)更易/ L: 137氯化钠,氯化钾的2.7,8.1 Na₂HPO₄1.5 KH₂阿宝₄1.8 CaCl₂0.5 MgCl₂h·6₂啊,和pH值7.4。

2.2。化学发光分析的孤立的中性粒细胞

希尔顿酒店的影响或HHDC(0.01, 0.1, 1、10和100μmol / L)额外的-和细胞内ROS生产测量如果和PMA (0.05μmol / L)刺激中性粒细胞(5×10⁵/样本)isoluminol - / luminol-enhanced化学发光(CL)。细胞外CL确定系统中包含isoluminol (5μmol / L),合(8 U /毫升)。胞内氯测定与鲁米诺(5μmol / L)在细胞外食腐动物的存在超氧化物歧化酶(100 U /毫升)和过氧化氢酶(2 000 U /毫升)。CL评价在微型板块光度计Immunotech LM-01T(捷克共和国)37°C。数据是基于积分值的CL 1800年代(RLU×s;RLU:相对光单位)(26,27]。

2.3。化学发光分析在无细胞系统

鲁米诺在无细胞体系,辣根过氧化物酶和过氧化氢被用于化学发光的一代(28]。200年μ由50 L样本μL整除:合(2 U /毫升),鲁米诺(10μmol / L),希尔顿酒店,或HHDC解决方案1的浓度,10或100μmnol / L。添加过氧化氢的反应是由100年的最终浓度μmol / L。化学发光反应测定10分钟37°C微型板块光度计Immunotech LM-01T(捷克共和国)。

2.4。PKC活性测定

PKC活性胞液中检测到巴尔加等的修改方法。29日]。孤立的人类中性粒细胞(与希尔顿酒店/毫升)孵化30分钟(1、10和100μmol / L)或HHDC(1、10和100μmol / L) 37°C。中性粒细胞和PMA(0.15那么刺激μmol / L,最终浓度为3分钟)在37°C。的反应是停止添加10卷的冰冷的PBS。离心后(500×g 4°C, 10分钟)的细胞被resuspended样品缓冲(20更易与L TRIS-HCl 5更易与L EDTA,特里同1%,10%的甘油,和蛋白酶抑制剂的鸡尾酒),用冰,离心机(14 000×g, 5分钟,4°C)。胞质分数被转移到一个prechilled 1.5毫升微型离心机管和储存在-70°C。胞质分数中的蛋白质含量测定用布拉德福德染色试剂检测设备(美国Bio-Rad)。PKC活性测定与非放射性蛋白激酶试验装备(美国试验设计,安阿伯市MI),这是基于固相酶联immunoabsorbent试验(ELISA),利用特定的合成肽作为衬底PKC和多克隆抗体识别磷酸化的底物。试验开发tetramethylbenzidine衬底和颜色比例PKC磷酸转移酶活动的发展。颜色开发与酸停止停止解决方案和颜色测量的强度标在450海里。数据被表示为相对每1毫克的蛋白质激酶活性。

2.5。免疫印迹分析

PKC同功酶的磷酸化α,β二世,δ,以及NADPH氧化酶亚基p40^phox被Jančinova用描述的方法检测et al。24,27]。

暂停孤立的中性粒细胞(100μL)包含在37°C细胞preincubated 60秒与不同浓度的HHC或HHDC (100μmol / L)之前PMA (0.15μmol / L)。孵化和PMA(5分钟)停止使用溶液化的缓冲(20更易与L Tris-HCl 5更易与L EDTA,特里同1%,10%的甘油,10 L更易与氟化钠,1更易与L钠原钒酸盐,208μ0.17 mol / L AEBF,μmol / L抑肽酶,8μ2.8 mol / L bestatin,μmol / L e - 64 4μ7.4 mol / L亮抑酶肽,pH值)。暂停在4°C用20分钟和000×离心机在14 g在4°C 5分钟删除完整的细胞。测量血清总蛋白的上层清液被使用从Bio-Rad布拉德福德染色试剂检测工具和印迹分析。印迹测定的上层清液与样品缓冲煮5分钟(50更易与L Tris-HCl, 2% SDS、7.5%甘油、2.5%巯基乙醇,0.01%溴酚蓝,和pH值6.8)和样本加载9.8% SDS聚丙烯酰胺凝胶。蛋白质(20μ每车道g)是由电泳分离和转移到Immobilon-P转移膜(美国微孔Corp .)。两条,一是发现PKCα,β二世(面积60至100 kD)和第二检测β肌动蛋白(30 - 60 kD),它代表了内部控制。膜条被封锁了60分钟1%牛血清白蛋白在三羟甲基氨基甲烷缓冲液盐(TBS: 154年20更易/ L Tris-HCl,更易与L氯化钠,Tween-20 0.05%,和pH值7.5)。这是紧随其后的是60分钟孵化的存在主要抗体:anti-phospho-PKC -α,β二世(Thr638/641)(1: 5 000)或β肌动蛋白(兔子反,1:4 000)(细胞信号技术,丹弗斯,妈,美国)。细胞膜随后被洗6次TBS孵化60分钟和二级抗体结合辣根过氧化物酶(anti-rabbit从驴,1:5 000年,通用电气医疗集团生命科学、小都,英国),和辣根过氧化物酶的活性带对应于个人PKC想起使用增强化学发光免疫印迹检测试剂(通用电气医疗集团生命科学,小都,英国)。

NADPH氧化酶亚基p40^phox和PKC同工酶δ发现在相同的墨迹洗和孵化10倍稀释后剥离缓冲区(Reblot加上温和的解决方案,微孔,泰梅库拉,CA,美国)15分钟,洗在稀释缓冲(三羟甲基氨基甲烷缓冲液盐1%牛血清白蛋白)。其次是60分钟孵化的主要抗体:anti-phospho-p40^phox(T154)(1: 5 000)或PKCδ(Thr505)(000: 1)(细胞信号技术,丹弗斯,妈,美国)。细胞膜随后被洗6次TBS孵化60分钟和二级抗体结合辣根过氧化物酶(anti-rabbit从驴,1:5 000年,通用电气医疗集团生命科学、小都,英国),和辣根过氧化物酶的活性带对应于个人NADPH氧化酶亚基或PKC同种型视觉使用增强化学发光免疫印迹检测试剂(通用电气医疗集团生命科学,小都,英国)。放射自显影图乐队使用图像量化J计划。每个PKC的光密度或NADPH氧化酶乐队被相应的光学密度修正β肌动蛋白带(24,27]。

2.6。测量细胞毒性

希尔顿酒店的细胞毒性效应和HHDC评估通过ATP luciferin-luciferase化学发光的解放。中性粒细胞悬挂(30μL;30 000细胞/样本)和20μ潜伏在50 L Tyrode的解决方案μL (HHC或HHDC (1 - 100μmol / L) 15分钟在37°C。10毫升水中荧光素(1.6的混合物μg /样本)和荧光素酶(45 000 U /样本)补充道,和化学发光是60年代记录。在每个实验中,ATP标准的化学发光(1 - 500 nmol / L)测量和ATP浓度的样品从校准曲线进行了计算。总ATP含量是评估后立即声波降解法十年代的中性粒细胞(24,27]。

2.7。统计分析

所有值都给4 - 8±SEM实验的手段。统计学意义的差异意味着建立了学生的以及和值低于0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。希尔顿酒店和HHDC ATP解放的影响

确定细胞毒性的HHC HHDC,我们测试了影响ATP解放(表1)。在1的浓度,10,100μmol / L,这些化合物并没有增加自发ATP解放(ATP nmol / L),占总ATP含量的7.6% (ATP nmol / L),确定后立即完成中性白细胞的破坏。结果表明,浓度增加治疗该病,HHDC没有引起中性粒细胞的伤害。

3.2。希尔顿酒店和HHDC对额外的影响,中性粒细胞的胞内化学发光

在人类中性粒细胞激活孤立,可溶性刺激PMA,绕过受体和PKC激活NADPH氧化酶通过再分配和几个蛋白质的磷酸化。如前所述,PMA是有用的在调查NADPH-oxidase激活信号转导途径在等离子体(细胞外)和颗粒膜(细胞内)10,11]。图2演示了额外的动力学,细胞内ROS生成PMA刺激后在人类中性粒细胞分离。细胞外ROS生成更加密集,达成最大早比细胞内ROS生成。额外的-和细胞内ROS生成之间的比例大约是10:1 (12 696 RLU: 1 295 RLU)。

图3表明,这两种化合物,希尔顿酒店和HHDC浓度0.01 - -100的规模μmol / L,显著降低细胞外ROS生产,以化学发光。希尔顿酒店和HHDC生产50%抑制浓度(IC₅₀)控制细胞外化学发光分别为1.04±0.20μmol / L和1.01±0.13μ分别为mol / L(表2)。

希尔顿酒店在浓度0.01 - -100的规模μmol / L显著降低细胞内ROS生产(IC₅₀:5.24±0.57μmol / L), HHDC略有效只有在最高浓度测试(图4和表2)。

3.3。希尔顿酒店和HHDC化学发光体系游离的影响

进一步我们测试的参与该病的直接抗氧化活性和HHDC CL游离系统组成的鲁米诺,辣根过氧化物酶和过氧化氢。我们的结果显示一个有效抑制产生的化学发光体系游离与希尔顿酒店(IC₅₀:0.59±0.01)和HHDC (IC₅₀:2.47±0.04)(表2)。

3.4。希尔顿酒店和HHDC PKC活性和PKC的磷酸化(PKCα,β二世,δ)

与佛波醇酯刺激中性粒细胞激活PKCα,β二世,δ,参与氧化破裂NADPH氧化酶的关键催化剂。首先我们分析了调制PKC活性的HHC或HHDC是否调解他们对PMA刺激ROS产生抑制作用。希尔顿酒店的浓度1、10和100μmol / L显著降低PKC活动87.7±4.2%,74.8±6.3%,分别和46.3±1.8%。另一方面,HHDC PKC活性(图没有明显影响5)。自从PKC活性试验确定所有PKC (α,β,γ,δ,ε,μ,ζ,θ),我们进一步指定希尔顿酒店的影响和HHDC PKC的磷酸化α,β二世,δ。

PMA刺激后,我们观察到增加PKC的磷酸化α,β二世,δ相比,如果人类中性粒细胞。治疗该病或HHDC 10 - 100的浓度μmol / L导致减少PKC的水平α,βII相比控制但并不影响PKC的磷酸化δ(数据6和7)。

3.5。希尔顿酒店和HHDC p40磷酸化的NADPH氧化酶组件^phox

最近,p40的选择性作用^phox在细胞内ROS生产报告(10,13]。我们研究是否观察到抑制细胞内ROS生产,特别是由希尔顿酒店,可能与它对p40的磷酸化的影响^phox亚基在PMA刺激人类中性粒细胞。如图8PMA p40磷酸化的增加^phox亚基,然而HHC HHDC失败的影响。

4所示。讨论

嗜中性粒细胞的监管活动的重要因素之一在实现宿主防御和避免tissue-damaging炎症。最近,高度重视一直致力于自然起源以及多酚合成衍生品。他们中的许多人被发现具有影响,可用于预防和治疗慢性炎症性疾病(支持30.- - - - - -35]。以前,我们已经表明,不同phenylcoumarin衍生品HHC和HHDC对吞噬细胞功能的影响可能是由于各自不同的自由基清除属性和亲油性的特性。进一步,我们表明,该病的能力和HHDC中性粒细胞减少氧化剂生产可能与抑制NADPH氧化酶的活动,通过减少PKC激活的23]。在目前的研究中我们指定的希尔顿酒店的网站和HHDC行动ROS生成和考虑一些可能的分子机制将氧化剂生产的监管。

我们的研究结果表明,中性粒细胞激活PMA回应氧化剂生产额外的化学发光和胞内成分组成的。我们发现细胞外ROS主要生产,也证明了Bjornsdottir et al。13]和达利Karlsson [36];然而,与他们的结果相比我们观察到一个更高的比率氧化剂产生额外的细胞,支持前者。希尔顿酒店和HHDC强有力的抑制剂细胞外ROS生产在人类中性粒细胞和PMA刺激。虽然HHDC减少细胞内ROS生成仅在最高浓度测试,HHC浓度的方式具有显著的抑制作用。两个额外的抑制,细胞内氧化剂生产表明该病可能的干扰和HHDC ROS(清除活动)以及信号事件导致活性氧的生产。

有效抑制颗粒体系化学发光的化合物(表进行测试2)表明,自由基清除该病的性质和HHDC发挥重要作用在两个额外的减少和细胞内氧化剂生产。获得的结果在无细胞系统还建议他们干扰过氧化物酶,因为鲁米诺反应是高度依赖于髓过氧物酶的参与。支持这种交互的可能性与过氧化物酶的发现Kabeya et al。37)和安德拉德et al。38)的抑制作用证明谁3-phenylcoumarin羟化衍生品对辣根过氧化物酶催化活性。对称二苯代乙烯衍生品髓过氧物酶释放的抑制作用也描述了Pečivova et al。39]。

抗氧化活动之间的关系和香豆素衍生物的化学结构是重要的因素,可能影响氧化剂生产在体外和在活的有机体内(1,23,38,40- - - - - -42]。香豆素测试,希尔顿酒店和HHDC,有类似的结构:在C7羟基位置环,C4′羟基位置在环b HHC C3和C4之间具有不饱和键环C, HHDC未能拥有它(图1)。我们的研究结果表明,该病的抑制效果和HHDC PMA刺激中性粒细胞的胞外ROS生成可能不依赖于一个双键的存在之间的C3和C4环C。另一方面,明显抑制细胞内ROS生产的HHC表明一个不饱和的要求3 -,4绑定网站在C环抑制作用。

多酚类物质被报道影响细胞功能通过修改质膜结构和物理特性,如流动性和电气性能。这些影响都可以观察到当茶多酚吸附膜,当他们被插入到双分子层(43]。低HHDC对细胞内活性氧产生的影响可能是由于较低的值的分配系数HHDC比希尔顿酒店,从而更高效的HHC渗透到膜比少亲脂性的HHDC,正如我们早些时候发表研究结果所示(23]。

在生物系统中,活性氧产生的酶系统,质膜结构和修改会导致机能的改变,包括膜相关酶的活性和调制的信号转导7,43]。

抑制PKC的差别或对这些细胞内的表达和活性已被建议作为一个重要的多酚的抗氧化作用机制(7,27,35,44,45]。我们发现HHC HHDC不同,有效地降低了细胞内的氧化剂生产参与中性粒细胞功能的规定,因此我们应该相互作用发生在PKC的水平。因为我们观察到显著减少PKC活性的希尔顿酒店,我们对PKC进一步指定其影响α,β二世磷酸化。抑制PKC活性和PKCα,β二世磷酸化的希尔顿酒店,表明之间的双键的存在C3和C4在C环对于这种效应是必要的。结构依赖信号转导抑制作用的多酚抗氧化剂的酶,如PKC,也发现了巴尔加et al。40]。尽管PKC的特定角色δ据报道[PMA-dependent细胞内激活过程中22),我们没有观察到任何PKC的香豆素测试对磷酸化的影响δ。

NADPH氧化酶的胞质成分之一,p40^phox,特别是转移到细胞内phagosomal和颗粒膜,也表明作为细胞内ROS生产(进一步的决定因素10,12]。此外,减少p40^phox磷酸化的PKC抑制剂发现Bouin et al。46和et al染谷伸一说。47]。然而,我们的研究结果表明,在PMA刺激中性粒细胞减少细胞内ROS生成和PKC活性的希尔顿酒店与磷酸化的抑制无关NADPH氧化酶亚基p40^phox。

5。结论

我们扩展我们之前发现的行动coumarine衍生品HHC和HHDC在人类中性粒细胞通过调查活动的额外的影响,细胞内活性氧的形成和一些可能的分子机制影响氧化剂的规定生产。的结果表明,中性粒细胞参与的病理过程,HHDC可能主要是作为一个强有力的抑制剂/巨噬细胞产生活性氧。该病可能额外的细胞,和,除了与ROS的直接干预,它也可能影响与PKC信号通路。这些发现证实了我们之前的假设的不同影响coumarine衍生品测试可能是由于不同的分子结构,这为他们提供了不同的物理化学和自由基清除的特点。

利益冲突

作者没有利益冲突。

确认

这项研究是织女星2/0010/13赠款支持,apvv - 0052 - 10, apvv - 0315 - 07。作者感谢教授玛格达Kouřilova-Urbanczik英语论文的校正。