细胞衰老，老化和年龄相关疾病的十字路口蛋白氧化损伤

摘要

氧化介导的蛋白质损伤，与晚期糖基化终产物和脂质过氧化产物形成的蛋白质加合物，在衰老和与年龄相关的疾病（如神经退行性疾病）中已被证实。在人类成纤维细胞的复制性衰老中，蛋白质修饰增加，这是一种有效的治疗方法衰老研究模型在体外然而，这些修饰蛋白影响衰老表型发展和年龄相关疾病发病机制的机制仍不清楚生物信息学证据分子行动者和受这些受损蛋白影响的细胞途径的方法。建立了老化和衰老相关疾病过程中由羰基化、糖基化和脂质过氧化产物修饰的蛋白质数据库，并与细胞复制性衰老过程中鉴定的蛋白质进行了比较在体外．虽然已经对不同的组织进行了研究，但在中间代谢过程中所涉及的酶所证明的共同细胞通路被发现是这些修饰的目标。这些结果强调了蛋白质修饰在衰老和年龄相关疾病期间的细胞代谢损伤中的潜在作用。

1.介绍

Hayflick和Moorhead建立了一个概念，即从哺乳动物组织中分离出来的原代细胞在培养中只进行有限数量的分裂，没有自发的转化[1.,2.］．一旦达到复制极限，这些细胞就被称为“衰老细胞”，并被视为衰老细胞。从那时起，复制性衰老被认为是衰老的细胞模型，可能为生物衰老提供见解[3.–5.］．最近，不同的研究表明了细胞衰老的发生在活的有机体内［6.,7.］．这些衰老细胞因产生年龄相关的表型而导致致随因果关系，并且它们的去除可以预防或延迟组织功能障碍并延伸卫生泵[8.]事实上，细胞衰老是否以及如何与机体衰老、与年龄相关的疾病、虚弱和功能障碍相关，是衰老生物学领域的主要开放性问题之一。

在细胞和机体水平上老化的一个标志是由于氧化应激增加和蛋白质修复和维护系统的失败而造成的受损大分子的积累[9,10］．活性氧(ROS)通常是有氧代谢和氧化磷酸化的副产物。此外，ROS的产生和积累通常在疾病发病过程中增加(特别是年龄相关疾病)[11].低浓度或短暂暴露于ROS可诱导细胞增殖并调节多种信号通路的激活[12］．然而，未中和的ROS会导致脂质、蛋白质和核酸的氧化损伤，从而导致异常的分子活动[13,14]蛋白质氧化尤其有害，因为由此产生的损伤和/或诱导的蛋白质结构构象变化可使氧化蛋白质失去活性并导致细胞功能异常[15,16］．

各种类型的蛋白质氧化修饰直接由活性氧诱导，或间接由与氧化应激次级产物的反应诱导[17］．半胱氨酸和甲硫氨酸残基特别容易发生氧化修饰，但它们可能不会与蛋白质损伤直接相关，因为它们也参与了蜂窝信号传导事件[18］．另一方面，其他残基的不可逆氧化产物是最常见的羟基化和羰基化氨基酸侧链衍生物。在生命周期中，在细胞和机体水平上羰基化蛋白的指数级积累，以及它们在受年龄相关疾病影响的器官中的特别增加，意味着这种“氧化-蛋白质组”(即，受氧化作用的限制性蛋白质)可能是许多所描述的细胞功能障碍的潜在分子基质。蛋白质羰基化包括通过不同机制形成的醛和酮:(i)多肽主干直接氧化，导致截短的多肽;(ii)赖氨酸、精氨酸、脯氨酸和苏氨酸的侧链氧化;(iii)组氨酸、半胱氨酸和赖氨酸氨基酸残基与醛的反应，例如脂质过氧化产生的反应;(iv)形成Amadori和Heyns重排产物(晚期糖基化终产物:AGE)的赖氨酸残基糖基化(非酶糖基化)[19–21］．羰基化的蛋白质通常较低，较少的热稳定性，并且在其表面暴露疏水氨基酸。由于产生羰基的氧化修饰通常导致受影响的蛋白质中的催化或结构功能的损失，因此已经提出了在老化和年龄相关疾病中观察到的氧化改性蛋白质的增加可能对细胞和器官产生有害影响功能。

在与年龄相关的疾病中，如神经退行性疾病（肌萎缩侧索硬化症、阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病）、白内障、系统性淀粉样变、肌营养不良、早衰、沃纳综合征、类风湿性关节炎、，呼吸窘迫综合征[22–24].脂质氧化产物（4-羟基-2-壬醛：HNE、丙二醛）修饰的蛋白质水平升高与神经退行性疾病、铁诱导的肾癌、心血管疾病以及蛋白质糖基化/糖氧化终产物水平升高（AGE）有关与糖尿病、神经退行性疾病、动脉粥样硬化和唐氏综合征相关。在过去几年中，在识别这些修饰的靶蛋白方面取得了重大进展，尽管它们在这些疾病的发病机制中可能的致病作用尚未确定。

先前的研究已涉及在衰老的人类WI-38胚胎成纤维细胞中鉴定累积的羰基化蛋白质，以及通过糖基化和与脂质过氧化产物HNE结合修饰的蛋白质[25,26］．在此,通过使用生物信息学方法，我们已将对改性蛋白质的分析扩展到报告期间的改性蛋白质在活的有机体内衰老和与年龄有关的疾病。文献中已有超过180种蛋白质被报道为越来越多的修饰，它们参与关键的细胞途径，如炎症反应、能量代谢、蛋白质折叠和自由基清除。我们发现，在器官老化和年龄相关疾病期间，衰老成纤维细胞中也发现了几种蛋白质（35%），当将它们分为细胞功能和典型途径时，它们显示出密切的关系。综上所述，这些结果表明某些蛋白质对有害的翻译后修饰特别敏感，表明蛋白质修饰不是一个随机过程，可能与衰老和年龄相关疾病的分子基础有关。

2.材料和方法

使用ingenious途径分析(IPA)软件(2.0版，ingenious Systems, Mountain view, CA, USA)生成了已鉴定的修饰蛋白的功能和规范途径分组以及网络分析。

2.1.整个数据集的功能分析

功能分析确定了对数据集最重要的生物功能和/或疾病。在独创性知识库中，与生物功能相关的数据集中的分子被考虑用于分析。用右尾Fisher精确检验计算a-确定分配给该数据集的每种生物功能和/或疾病仅是由于偶然原因的概率的值。

2．2.典型路径分析

典型路径分析确定了IPA标准路径库中对数据集最重要的路径。分析中考虑了数据集中与Ingenuity知识库中的规范路径相关的分子。通过两种方式测量数据集与标准路径之间的关联的显著性。（1） 显示数据集中映射到路径的分子数除以映射到规范路径的分子总数的比率。（2） Fisher精确检验用于计算aP值决定了数据集中的基因与规范路径之间的关联仅凭偶然解释的概率。

2.3.网络生成

将包含基因(或化学)标识符和相应表达值的数据集上传到应用程序中。每个标识符都被映射到ingenious知识库中相应的对象。这些分子被称为“网络合格分子”(Network Eligible molecules)，它们被叠加到一个由智谋知识库(ingenious Knowledge Base)中包含的信息发展而来的全球分子网络上。网络合格分子的网络然后根据它们的连通性算法生成。分子被表示为节点，两个节点之间的生物关系被表示为一条边(线)。所有边都由至少一个参考文献、教科书或存储在独创性知识库中的规范信息支持。在智谋知识库中，人类、小鼠和大鼠的基因同源性是作为单独的对象存储的，但表示为网络中的单个节点。

3.结果与讨论

3．1.复制衰老过程中WI-38成纤维细胞中羰基化蛋白的特性研究

先前报道的衰老成纤维细胞中鉴定的修饰蛋白[26]根据细胞定位进行分类，并根据功能相关性、典型通路和潜在相互作用进行分组(图)1.)修饰蛋白的亚细胞定位表明，修饰蛋白存在于两个主要部分：线粒体（44%）和包括细胞骨架蛋白在内的细胞质（28%）是衰老成纤维细胞线粒体内高水平蛋白质损伤的基础，特别是考虑到来自该细胞器的蛋白质仅占总细胞蛋白质裂解物的5–10%（图1（a））.

对分子关系进行数据挖掘，旨在检测复制性衰老时可能受到干扰的细胞途径。主要类别包括关键细胞过程，如线粒体功能障碍；柠檬酸循环；丁酸；碳水化合物；脂质和丙酮酸代谢；氧化磷酸化；精氨酸和丙酮酸奥林代谢（图1 (b)）.在功能水平上，已描述衰老过程中线粒体ATP再生能力的下降[27］．值得注意的是，在WI-38成纤维细胞的复制衰老过程中，线粒体蛋白特别容易被氧化，如复合物I的铁-硫亚基和ATP合酶的亚基。此外，此前已发现HNE能抑制许多呼吸链复合体的活性在体外［28]线粒体呼吸也受线粒体与AGE诱导剂甲基乙二醛孵育的影响[29]发现苹果酸脱氢酶、2-酮戊二酸脱氢酶E1组分、甘油-3-磷酸脱氢酶、甘油激酶和谷氨酰胺酶等酶在复制性衰老过程中不断发生修饰。这些发现表明，负责能量代谢的蛋白质的修饰可能参与衰老细胞中观察到的线粒体功能损害。

为了进一步了解衰老表型发育过程中可能受到影响的细胞通路，我们进行了蛋白质相互作用分析(图)1 (c))使用Ingenuity Pathways分析软件。该分析显示了涉及定义网络内修饰蛋白质的相互关系。获得的网络显示过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR)、肿瘤坏死因子(TNF)和胰岛素生长因子(IGF1)是该网络的中心节点。有趣的是，这三种蛋白质之前都与细胞衰老有关。例如,PPAR是配体激活转录因子的核受体超家族成员，调控糖/脂代谢、血管炎症和增殖相关关键蛋白的基因表达。以往的研究表明，PPAR激活通过诱导p16表达促进WI-38成纤维细胞衰老[30.］．此外，蛋白质修饰还可能导致靶向蛋白质的互联物改变，因此影响其他非型蛋白的正常功能。例如，在复制衰老期间越来越改性的四种蛋白质与甾醇调节元素结合转录因子1（SrebF1）相互作用，也参与细胞衰老[31]，使其成为与这些蛋白质连接受损的可能目标。

３.２.在Silico.检测过程中确定的羰基化蛋白质的分析在活的有机体内衰老和与年龄有关的疾病

我们接下来解决蛋白质是否越来越越来越修改在体外在衰老和年龄相关疾病(神经退行性疾病、癌症和糖尿病)期间，也在人类或哺乳动物模型中发现了WI-38成纤维细胞的衰老，这些疾病中蛋白羰基化的增加一直被证实。为此，在同行评议的期刊上发表的文章中，研究人员对经AGE或HNE修饰或羰基化程度越来越高的蛋白质进行了特定的搜索。我们选择了在人类和哺乳动物疾病模型(啮齿动物)中发现的修饰蛋白。共列出183个蛋白质(补充表1，见补充材料在线http://dx.doi.org/10.1155/2012/919832）.在脑、小脑、脊髓、骨骼肌、肝脏、眼睛、脑脊液和支气管肺泡液中鉴定了修饰蛋白。值得注意的是，由于大量研究表明蛋白质羰基化在肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病等神经退行性疾病发病机制中的重要性，大多数被鉴定为修饰越来越多的蛋白质属于大脑。然而，一些蛋白质已经在不同的器官系统如中枢神经系统、肝脏和眼睛中被一致地修饰，这表明这些修饰靶向的蛋白质光谱是保守的。急性氧化应激条件没有被包括在这项研究中，但我们最近在人类成肌细胞中显示，即使在高浓度的过氧化氢下，只有一组有限的蛋白质被氧化[32］．有趣的是，这些羰基化蛋白并不一定是最丰富的，而且与那些在总细胞蛋白质组的表达水平上表现出变化的蛋白有很大的不同[32］．

参考蛋白的亚细胞定位是基于人类蛋白参考数据库(HPRD)的信息进行标注的。以细胞质蛋白为主，其次是线粒体蛋白、细胞核蛋白、内质网蛋白和质膜蛋白(图)2（a）)然而，值得注意的是，大多数研究是在总的组织可溶性提取物中进行的，与总的细胞蛋白相比，线粒体和膜蛋白的表达明显不足。

使用聪明才智知识库还执行功能注释。蛋白质主要是通过生物过程分布，例如炎症反应，细胞代谢，自由基清除和蛋白质合成和折叠（表1.）.此外，一些蛋白质属于不同的功能家族，因此它们参与其他重要的细胞过程也不容忽视。

关于参与炎症反应的蛋白，需要注意的是，生理衰老与慢性亚临床全身炎症反应有关，也称为“炎症衰老”，其特征是血清促炎细胞因子如白介素6 (IL-6)、TNF水平升高α和急性期蛋白质，如c反应蛋白(CRP) [33]炎症现在被认为是几种与年龄相关的疾病发展的关键致病因素，包括心血管疾病、2型糖尿病和神经退行性疾病[33］．重要的是，炎症环境是高度氧化的，已经描述了增加的蛋白质氧化，产生一个正反馈过程。参与能量代谢的蛋白质也在参考的修饰蛋白中得到证实。整个数据集中最重要的规范路径包括:糖酵解/糖异生,柠檬酸循环,丙酮酸代谢，氨基酸降解，线粒体功能障碍，细胞死亡，丁酸代谢，NRF-2氧化应激反应，以及细胞功能和维护(图2（b））.

3．3.衰老成纤维细胞中羰基化蛋白的比较在活的有机体内衰老和与年龄有关的疾病

12个蛋白质（热休克同源71 kda蛋白，Vimentin，actin，管蛋白，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，ATP合酶，蛋白酶体亚基11，伸长因子Tu，细胞色素B-C1复合物，annexin A5，蛋白酶体亚基α型-2，苹果酸脱氢酶），其对应于在Wi38成纤维细胞的复制衰老期间鉴定的约三分之一的蛋白质体外，在其他衰老模型和与年龄有关的疾病中也被发现有越来越多的改进。

这两个数据集的比较表明，这些修饰所针对的蛋白质在某种程度上具有相似性。值得注意的是，大多数研究都是在大脑中进行的，在大脑中，蛋白质表达谱可能与培养的成纤维细胞有显著差异在体外。进一步的研究应该通过使用不同组织的衰老细胞来解决这个问题。特别令人感兴趣的是人类衰老干细胞，因为它们同时发育成时间性衰老和复制性衰老。

对衰老的成纤维细胞和文献中报道的成纤维细胞进行IPA比较分析和蛋白质功能分组。分析表明两个数据集中涉及几种常见的分子和细胞功能（图1）3.)。重要的细胞功能，如能量生产、碳水化合物代谢、蛋白质合成、折叠和降解，可能与之有关，因为它们直接以这些细胞途径中涉及的蛋白质修饰为目标。在这两种情况下，都涉及潜在的共同机制，尽管生物信息学分析是相当预测的，应该通过实验数据确认。

常见的过程被认为与衰老和与年龄相关的疾病有关，包括氧化应激增加、蛋白质损伤累积和一般代谢功能障碍。然而，这些过程大多被视为独立事件。本研究的一个重要结果是：催化中间代谢（如糖酵解、糖异生、柠檬酸循环和脂肪酸代谢）的酶被发现被修饰。这些结果表明蛋白质修饰对细胞能量代谢损伤的潜在影响。未来的研究应通过结合代谢组学来解决这一重要问题在细胞和机体老化过程中进行有针对性的蛋白质组学分析。

致谢

作者非常感谢欧盟资助的FP7和FP6下的MYOAGE（编号223576）和PROTEOMAGE（编号518230）项目，以及成本行动CM1001。此外，他们非常感谢Adelina Rogowska Wrzesinska博士对细胞途径分析的建议。

补充材料

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