过度的脂肪酸-氧化相关基因延长寿命黑腹果蝇

摘要

更好地了解老龄化过程是必要的，以确保老年人口的医疗需求得到满足。随着人类预期寿命增加的趋势，识别影响寿命调节的候选基因及其与环境因素的关系是至关重要的。通过对EP突变株的误表达筛选，我们之前分离出了几个普遍过表达延长寿命的基因，包括脂肪酸结合蛋白和脂肪酸相关的十二烯酰辅酶a delta-异构酶的两个基因β-氧化，这是真核细胞的主要能量来源途径。在本研究中，我们分析了过度表达脂肪酸两种主要成分的果蝇β-氧化，发现过度表达脂肪酸-β-氧化相关基因扩展了果蝇寿命。此外，我们发现饮食限制延长寿命的能力被脂肪酸-的过度表达所降低β-oxidation-related基因。此外，脂肪酸-的过度表达β-氧化相关基因增强了对氧化和饥饿胁迫的耐受性，并激活了dFOXO信号，表明dFOXO靶基因发生了核易位和转录激活。总之，本研究结果提示脂肪酸-过表达β-氧化相关基因以与饮食限制相关的方式延长寿命，这一过程的机制可能与FOXO激活有关。

1.介绍

预期寿命增加的趋势要求对老龄化过程有更深入的了解，以确保老龄化人口的保健需求得到满足。这一目标需要识别所谓的“长寿候选基因”，这是对寿命调节很重要的潜在基因，以及适当理解这些基因的影响是如何被环境因素如饮食调节的。许多长寿候选基因已经在使用延长寿命突变表型的模型系统中被识别出来，这为衰老和寿命决定机制提供了重要的见解[1- - - - - -5]．胰岛素/胰岛素样生长因子(IGF)信号(IIS)是一种主要的营养感知途径，也是一种特征明确的衰老相关途径。通过影响胰岛素/IGF受体、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、Akt和叉头盒(FOXO)的突变，IIS功能的丧失已经被发现可以延长寿命秀丽隐杆线虫，果蝇,和哺乳动物(3.，6- - - - - -11]．此外，感测能量途径，如与沉默调节蛋白的相关联的那些，雷帕霉素（TOR）和AMP活化蛋白激酶（AMPK）信令的目标是公知的被链接到老化过程[3.- - - - - -5，12]．由于营养感知途径与衰老有关，减少饮食摄入，即饮食限制，也延长了各种模型系统的寿命[13- - - - - -16]．此外，蜕皮类固醇激素途径已知可调节生物体寿命[17，18]．

当调查长寿的候选基因，我们先前进行的错误表达的含有上游激活序列（UAS）的14份EP线筛选到的Gal4结合，允许有条件的过表达或敲低侧翼位于基本启动子的下游依赖于它的插入基因组DNA的基因的方向 [19]．在该研究中，我们初步选择了40个EP品系来证明其寿命的延长，包括两个EP品系(，)针对脂肪酸-β-oxidation-related基因(CG6783，CG13890)，但由于它们是在没有Gal4驱动器的情况下诱导的，因此被排除在进一步调查之外[19]．长期以来，脂质代谢在后生动物寿命的调节中起着核心作用。据报道，众所周知的长寿候选基因之一AMPK通过乙酰辅酶a -羧化酶磷酸化调节脂肪酸合成和氧化[20.]．此外，据报道，热量限制和IIS突变会促进脂肪酸氧化(21，22]．然而，一直存在的寿命延长的直接证据通过的脂肪酸的调制-氧化迄今为止，除了我们之前的研究[19，但我们并没有研究这与饮食限制的关系及其潜在机制。

在目前的研究中，我们分析了过表达的脂肪酸两个主要部件EP线β-氧化，发现脂肪酸的过表达氧化作用相关基因延长其寿命以膳食-限制相关的方式，增加了它们的耐应力性，并激活FOXO转录因子。

2.材料和方法

2．1.苍蝇储备和食物准备

黑腹果蝇25°C培养饲养。Cantonized白色的（CS10［23)作为野生型对照。的(GX62810)和(GX4385)的上游激活子序列(UAS)携带p元素介导的上游激活子序列(UAS)CG6783或CG13890分别从韩国科学技术院(KAIST)生物医学研究中心GenExel公司获得。生成UAS-CG6783苍蝇的全开放阅读框fabp从RH46282 (Drosophila Genomics Resource Center, Bloomington, USA)中克隆到pUAST使用生态RI /Bgl二世的网站。标准种系转化为w¹¹¹⁸然后对转基因品系进行背景。玉米粉糖酵母（CSY）培养基（5.2％玉米面，11％蔗糖，2.4％酵母，0.8％琼脂，和0.2％甲基-4-羟基苯甲酸酯（Sigma-Aldrich公司，圣路易斯，MO，USA））是用于幼体发育和日常文化。在饮食限制（DR）的实验中，酵母在进料至苍蝇单独的组培养基中的浓度为2，4，8，12，和16％。

２.２.寿命分析

在48小时以上采集新封闭F1代果蝇，将雄蝇随机分配到500 mL的种群笼中，最终达到100只雄蝇/笼。将盛有SY饲料(10%蔗糖、指示浓度的酵母、0.2%甲基-4-羟基苯甲酸酯和0.8%琼脂)的食品瓶贴在单独的笼子上，每两天更换一次，并在此期间取出死蝇并记录。本实验设3个重复笼。

２.３.抗性测定

氧化应激
Ten-day-old flies (20 males per vial) were fed SY medium supplemented with 18 mM paraquat (methyl viologen dichloride hydrate, Sigma-Aldrich). The flies were transferred into fresh vials containing paraquat solution every six hours, and the dead flies were scored after each transfer. Fifteen replicates were established.

饥饿的压力
新封闭的苍蝇被保存在装有1%琼脂的小瓶中(每小瓶20只雄蝇)，每6小时转移到含有琼脂的新鲜小瓶中。每次转学后，死苍蝇都会被评分。建立了15个重复。

２.４.幼虫脂肪体免疫染色

解剖的三龄幼虫用4%多聚甲醛(USB Corp, Cleveland, OH, USA)固定30分钟，用磷酸盐缓冲盐水/0.1% Triton X-100/2%牛血清白蛋白(PBST-BSA)洗涤，然后用一抗在PBST-BSA中4°C孵育过夜。然后样品在PBST-BSA中洗涤，在25℃下用Alexa488 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA)孵育1小时，然后用vectasshield (Vector Labs, CA, USA)洗涤和安装。使用共聚焦激光扫描显微镜(LSM510 META, Carl Zeiss Inc.， Germany)对生成的图像进行分析。抗dfoxo抗体(来自O. Puig)在2% BSA溶液中稀释至1:30 0。用DAPI对细胞核进行反染。

2．5．实时qPCR

5天大的成虫被冷冻在液氮中，并在−80°C下保存直到分析。用RNAiso试剂(TAKARA，日本)从全体裂解液中制备总RNA。其次，总RNA (5μ克）使用PrimeScript RT试剂盒（TAKARA）和qPCR使用SYBR预混防爆的Taq II（TAKARA）在ABI PRISM 7000序列检测系统（Applied Biosystems，USA）进行的实时逆转录。平均数感应褶皱从3-6个独立实验的值计算和统计由​​学生评价t-测试。

2.6。统计分析

数据以平均值±SEM表示。使用JMP统计包(SAS, Cary, NC, USA)中的标准生存模型对人口统计学数据进行统计分析。

3.结果

３．１．过度的脂肪酸β-氧化成分以限制饮食的方式延长寿命

在之前的研究中，我们选择了长寿的EP系，当杂交到da-Gal4司机(19]．其中，以脂肪酸-为靶点的2个EP系(GX62810、GX4385)-oxidation-related基因(CG6783，CG13890)，然而，在之前的研究中，它们被排除在进一步的研究之外，因为它们是在缺乏Gal4驱动的情况下诱导的[19]．CG6783编码脂肪酸结合蛋白(FABP)，该蛋白促进脂肪酸在细胞内的运动，从而允许脂肪酸氧化[24]， 尽管CG13890编码在所述内线粒体本地化dodecenoyl辅酶AΔ-异构酶（DCI），其中它在脂肪酸催化的长链脂肪酸的降解氧化(25，26)(图1(一)）.我们确认EP线过表达CG6783或CG13890当与da-Gal4司机相比,da / +通过实时定量pcr检测果蝇(图1 (b)）.

(一)

(b)

(一)
(b)

图1

独联体 反式 CG6783 CG13890 da-Gal4 CG6783 CG13890 da / + t P P 过度的脂肪酸-氧化相关基因。(a)脂肪酸示意图氧化。CG6783编码脂肪酸结合蛋白，介导酰基辅酶a到细胞器的运输。CG13890编码十二烯基辅酶a- delta-异构酶，其修饰-enoyl-CoA来-enoyl辅酶A，对于在烯酰-CoA水合酶的共用基板饱和脂肪酸辅酶a酯的-氧化循环。(b)的过度或使用EP线(GX62610, GX4385)和．的mRNA或在全身RNA提取液中进行了分析（黑条)（灰条)苍蝇。显著性是通过a以及(* *< 0.001, * * *< 0.0001)。

为了进一步评估EP谱线，对它们进行了杂交da-Gal4驱动型或野生型控制库存生产DA / EP及两组对照(EP / +和da / +)，回交8次以排除杂种优势。与以往的报告一致[19，这两种脂肪酸的过度表达-氧化相关基因da-Gal4司机增加寿命。在含有16％的酵母，中值寿命媒体CG6783- 或者CG13980-过表达的果蝇分别从观察的32天延长到近58天和42天da / +控制蝇（图2（一种））。此外，EP线过表达CG6783也显示了延长的最大寿命(图中的闭合方形线2(a))，两条EP线持续降低了各个成人年龄的死亡率(图)2(b))。然而，应该注意的是EP / +没有Gal4驱动的控制组显示出比父母组更长的寿命(开正方形线和开三角形线，图2(a))，这可能是插入EP以表达目的基因的副作用，目的基因是在EP中所具有的基础启动子的控制下表达的。

图2

CG6783 CG13890 EP ^CG6783 EP ^CG13890 da-Gal4 P da / + P EP ^CG6783 P da / + P EP ^CG13890 CG6783 UAS-CG6783 Act-GS-Gal4 P CG6783 CG13890 CG6783 CG13890 CG6783 CG13890 果蝇 CG6783 CG13890 过度的或整个身体都能延长寿命，这与饮食限制有关。(a)表现出过度表情的苍蝇（closed-square线)（闭合三角形线)饲喂16% SY介质显示增加中位和/或最大寿命相比单独驾驶(开环线路)。显著性通过log-rank检验(CG6783，< 0.001，= 0.6〜/+;CG13890,< 0.1，< 0.05/+）。（b）中过量表达蝇使用和与非诱导对照组(RU -，开放符号线)相比，从成年期第3天开始喂食含ru486的食物(RU+，闭合符号线)的中位寿命增加。显著性通过log-rank检验(< 0.0001)。(c)过表达果蝇的死亡率曲线或．使用Gompertz死亡率模型绘制了死亡率的自然对数。红线表示每个类别的线性回归。(d)超表达的或整个身体都减少了饮食限制对寿命的延长过表达果蝇的生存曲线（平方线)（三角线)喂入2%或16% SY培养基。(e)成人饮食限制什么时候或在全身过度表达。中位寿命是由饲喂一系列酵母浓度的EP细胞系的Kaplan-Meier生存分析计算出来的。红色虚线表示每条线的线性回归。

以进一步确认延长寿命的方法-氧化相关基因，我们使用UAS-CG6783通过标准种系转化获得的转基因株系UAST-CG6783利用条件基因开关(conditional Gene Switch, GS)驱动系统，构建并分析了转基因在成人中驱动时的寿命[27以产生具有相同遗传背景的群体。雌性后代Act-GS-Gal4 > UAS-CG6783基因型显示中位寿命比非诱导对照组增加(图2（C）），指示由该寿命延长-氧化相关基因独立于插入位点和遗传背景发生。

目的:探讨限制饮食的机制基础是否对脂肪酸有影响研究结果表明，过表达脂肪酸氧化成分的果蝇在延长寿命的过程中，被喂食2 ~ 16%酵母的SY饲粮。对照组的中位寿命随着酵母浓度的降低而增加[13，28]．对照果蝇在2% SY条件下的寿命增加了31.4%，而在16% SY条件下则增加了31.4%(圆形线，图)2(d)和2（E）），苍蝇表达CG6783或CG13890显示了饮食限制延长寿命的减少(分别为12%或15%，图2(d)和2(e))。这些结果表明脂肪酸的促进作用氧化通过一种类似于饮食限制的机制延长寿命。

３．２．过度的脂肪酸ββ-氧化组件提高了耐氧化性和/或饥饿应激

耐受力和寿命之间的正相关关系已经被很好地定义[29，30.，而长寿的生物往往能抵抗各种形式的环境压力[31]．因此，我们研究了过表达的脂肪酸的影响抗氧化相关基因。为了诱导氧化应激，果蝇过度表达脂肪酸--氧化组分饲喂18 mM百草枯。我们发现两种果蝇都过度表达每种脂肪酸-氧化组分表现出对氧化应激的显著抗性(图)3(一个)和3 (b)）.此外，当经受营养缺乏，蝇过表达CG13890表现出比对照组更强的抗饥饿能力(图3 (d))，而过表达果蝇的存活率CG6783不是由饥饿显著改变（图3 (c)）.这些结果表明脂肪酸的过度表达-氧化相关基因增加寿命和抗压力能力。

(一)

(b)

(c)

(d)

(一)
(b)
(c)
(d)

图3

CG6783 CG13890 CG6783 CG13890 da / + P P 过度的或增加对压力的抵抗力。果蝇表达或与对照组相比，表现出更高的抗氧化应激(a, b)和饥饿(c, d)的能力(open-circule行)。显著性通过log-rank检验(*< 0.01,* * *< 0.0001)。

3.3。过度的脂肪酸-氧化成分激活dFOXO信号

叉头盒(Forkhead box, FOXO)是衰老相关通路的关键中介，受IIS/PI3K/Akt、JNK、AMPK、MST1、CBP和Sirt1等信号通路调控[12，32- - - - - -36]．此外，dFOXO在果蝇据报道，肥胖与衰老、抗压力和脂质代谢等生理特征有关[15，37，38]．以确定是否延长寿命和抗压力产生的脂肪酸过表达-β-氧化组分与dFOXO激活有关，我们用抗dFOXO抗体对幼虫脂肪体进行免疫染色。在对照脂肪体中，在所有细胞的细胞质和部分细胞的细胞核中检测到内源性dFOXO信号(图)4(一)）.然而，由于脂肪酸-的过表达，脂肪体细胞核内的dFOXO信号增加β氧化组件(图4(一)）.

(一)

(b)

(一)
(b)

图4

CG6783 CG13890 CG6783 CG13890 CG6783 CG13890 da-Gal4 CG6783 CG13890 升（2）EFL 4 e-bp da / + t P P 过度的或激活dFOXO。(一)过度或诱导dFOXO转位到细胞核。三龄幼虫的脂肪体表达或下用anti-dFOXO(绿色)和DAPI(蓝色)染色。白色箭头表示dfoxo阴性细胞，红色箭头表示dfoxo阳性细胞。原放大倍数为200倍。(b)的过度或增加dFOXO靶基因的表达。的mRNA和在全身RNA提取液中进行了分析（黑色或深灰色条)和（灰条)苍蝇。显著性是通过a以及(*< 0.01, * *< 0.001)。

为了进一步评估是否所述脂肪酸-氧化相关基因在成人中激活dFOXO，我们分析了dFOXO转录靶基因的表达水平升（2）EFL和4 e-bp成人整个身体。的mRNA水平升（2）EFL和4 e-bp在成年人中，由于脂肪酸的过度表达，整个身体都增加了氧化组件(图4 (b)）.这些结果表明脂肪酸增加-氧化导致FOXO信号的激活，提示脂肪酸--氧化诱导的寿命延长与FOXO激活有关。

4.讨论

在本研究中，我们证实了脂肪酸-的过表达-氧化相关基因延长了中位寿命和最大寿命，增加了抗压力能力，表明脂肪酸水平氧化调节寿命。与我们的结果一致的是，许多研究都认为是脂肪酸-氧化作为寿命决定因素。众所周知的长寿候选基因之一，AMPK据报道可调节脂肪酸合成和氧化[20.]．此外，热量限制和IIS已被报道会促进脂肪酸氧化(21，22]．此外,谜该突变体具有抗氧化应激和长寿表型，被发现编码一种脂肪酸--氧化相关酶[39]．突变体的枯萎的，它含有肉碱棕榈酰转移酶活性，用于将长链脂肪酸导入线粒体，被发现对氧化和饥饿应激异常敏感[40]．此外，突变体飞向线粒体三功能性的蛋白质含有三种与脂肪酸有关的酶活性β-氧化，最近报道有缩短寿命和减少运动和繁殖力[41]．然而，本研究首次提供了脂肪酸-调控的直接证据-氧化元件延长使用寿命。

我们的数据显示，通过饮食限制延长的寿命随着脂肪酸的过度表达而减少-氧化相关基因，表明脂肪酸可延长寿命-氧化成分与饮食限制有关。此前有报道称，卡路里限制会增加全身脂肪的氧化[21]．热量限制后的能量剥夺会激活AMPK，进而增加利用能量资源所必需的脂肪酸氧化。这些发现表明脂肪酸氧化和饮食限制有相同的潜在机制。然而，值得注意的是，果蝇表达脂肪酸--氧化相关基因仍然对饮食限制有反应，特别是在酵母摄取量最低的那组。这一结果表明，果蝇通过改变脂肪酸而延长了寿命-氧化相关基因和其他与脂肪酸无关的机制氧化作用的饮食限制条件。

两种脂肪酸的过度表达-氧化组分在延长寿命、提高死亡率、抗应激和激活dFOXO等方面表现出相似的作用。然而，果蝇过表达FABP (CG6783)更能抵抗氧化应激，而DCI (CG13890表达果蝇比其他果蝇更能抵抗饥饿。FABP促进脂肪酸的细胞内运动，从而允许脂肪酸转移到线粒体进行脂肪酸氧化，并通过脂肪酸核受体转移到细胞核激活FABP靶基因的转录[42]．因此，这两种组分的对胁迫抗性的不同的效果可通过FABP和DCI的不同的功能而引起的。

在本研究中，我们发现脂肪酸氧化组分的增强激活了FOXO转录因子，提示脂肪酸--氧化诱导的寿命延长与FOXO激活有关。已发现空腹DCI纯合突变体在其肝细胞中沉积大量甘油三酯，并在其酯脂中积累不饱和脂肪酰基[25]．令人惊讶的是，我们的数据显示，FABP和DCI基因的过表达导致甘油三酯水平轻微升高(数据未显示)。这一发现可能是通过FABP或DCI过表达激活FOXO的结果，因为最近有报道称，小鼠肝脏中组成型核FOXO1产生了增加的甘油三酯积累[43]．作为衰老相关信号通路的中介，dFOXO被认为受多种因素调控，包括AMPK、JNK、MST1、Sir2和IIS [12，32- - - - - -36]．因此，在脂肪酸氧化相关基因过表达的果蝇中，FOXO激活是否与长寿和抗应激有关，以及哪些信号通路与脂肪酸-相关，还需要进一步的研究β-氧化相关FOXO激活。

作者的贡献

工程学系。李和研究。李对这篇论文的贡献是均等的。

致谢

作者感谢为果蝇提供抗体的普伊格博士和韩国科学技术院(KAIST)生物医学研究中心和布鲁明顿股票中心。这项研究得到了仁荷大学的资助。

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