表没食子儿茶素3-的预防作用O-Gallate对复制性衰老关联与p53乙酰化在人类皮肤成纤维细胞

抽象的

考虑到表没食子儿茶素-3-的多种药理活性O-gallate（egcg）包括抗癌和抗炎，抗糖尿病等，对egcg对原代细胞的抗衰效作用进行了相对较少的关注。在该研究中，在包括大鼠血管平滑肌细胞（RVSMC），人皮甲成纤维细胞（HDFS）和人关节软骨细胞（HACS）的原发性细胞中研究了EGCG对连续诱导的衰老的预防效应。检查SIRT1和乙酰化P53的参与作为HDFS中EGCG的衰老预防活性的潜在机制。所有细胞与3至7之间的初始通道数（PN）使用。为了诱导衰老，细胞在预定时间串联，在不存在或存在EGCG（50或100时 μ.在50岁时，RVSMCs和HACs的连续传代诱导的衰老能够得到显著预防μ.M EGCG，而在HDFs中，100 μ.M EGCG可以显着防止衰老，并恢复其靠近正常水平的细胞周期进展。此外，发现EGCG防止串行通道 - 和H.₂O₂通过抑制p53乙酰化，但苏特1活性不受影响，诱导HDF中的衰老。此外，增殖HDFS显示与衰老对应物的细胞质相似的细胞摄取与其衰老对应物，而是将其与它们不同的核转移，这将部分考虑对EGCG增殖与衰老细胞的差异反应。考虑到这些结果，建议可以利用EGCG来制定用于开发抗衰率或龄延迟剂的策略。

1.介绍

细胞衰老是指一种不可逆的生长停滞状态，正常细胞一般在细胞分裂约50次后失去分裂能力体外［1]．由于DNA双链断裂，一些细胞在复制周期减少后开始衰老。这种现象也被称为复制性衰老，是由Hayflick和Moorhead首次报道的，他们观察到正常的人类成纤维细胞在连续培养后能够进入一种不可逆的生长停滞状态体外;同时癌细胞未进入这种生长滞留状态并无限增殖[1]细胞衰老可由多种机制触发，包括端粒缩短、细胞周期素依赖性激酶（CDK）抑制剂2A位点的表观遗传抑制和DNA损伤[2]此外，这些机制限制细胞过度或异常增殖，因此衰老状态可防止癌症的发展，并与衰老有关[2]在过去的十年中，许多证据表明，白藜芦醇，一种在红酒中发现的多酚，通过激活沉默信息调节器（SIR）基因，发挥一种具有潜在抗衰老特性的热量限制模拟活性(去乙酰化酶）或抑制cAMP的降解磷酸二酯酶[3.- - - - - -6]．

从这个角度来看，我们的注意力已经支付给epigallocatechin3-O- 基金（EGCG），因为它具有与白藜芦醇的结构非常相似的结构，包括在环的两个元素中的羟基，反式用4'或3'，4'羟基图案的B环[6]．EGCG，绿茶多酚的最活跃，最重要组成部分，是众所周知的是一个主要贡献者，绿茶对人体健康的潜在益处[7- - - - - -9]．但EGCG在衰老相关的疾病，包括神经退行性病变，癌变，动脉粥样硬化和肥胖症的病因和治疗中的作用是难以确定的，有的仍然质疑其在体内的作用机制的本质[10，11].尽管某些调查人员对诉讼机制存在争议，但基于许多证据，仍有明确的认识体外，体内和流行病学研究表明EGCG具有有益的健康影响[12，13]．EGCG的主要作用机制被认为是参与其强大的抗氧化活性，从而保护神经和心脏[14，15]．其他有利的机制包括EGCG的化学预防、抗炎、抗血栓甚至细胞保护作用[16- - - - - -18]．在本研究中，我们研究了EGCG对连续传代和H的预防作用₂O₂-诱导的细胞衰老。作为EGCG预防衰老的潜在机制，我们确定了Sirt1和乙酰化p53表达的参与。此外，我们通过比较EGCG与荧光素-4-异硫氰酸酯(FITC)结合的EGCG在增殖成纤维细胞和衰老成纤维细胞中的结合模式，检测了增殖和衰老原代细胞对EGCG的不同反应。

2。材料和方法

2.1。细胞培养和条件

大鼠血管平滑肌细胞（RVSMCs) were isolated by limited enzymatic digestion from the tunica media of thoracic aorta of male young adult (10 wk old) Wistar rats (g重量，清水实验室用品，京都，日本)，如先前报道[19].原代培养的RVSMC保存在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM，Sigma-Aldrich Co.，St.Louis，MO，USA）中，补充有10%胎牛血清（FBS，Sigma-Aldrich Co.）和1%抗生素抗真菌溶液（包括10000单位青霉素，10 链霉素mg和25 μ.g两性霉素B per mL, Sigma-Aldrich Co.)，在95%湿度和5% Co的37°C₂．用细胞第三到第五段进行研究。人体关节软骨细胞（HACs) were kindly supported from Dr. J. Y. Bae (Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University, Japan) and subcultured in DMEM/HAM’s F-12 (Sigma-Aldrich Co.) supplemented with 10% FBS (Sigma-Aldrich Co.) and 1% antibiotic-antimycotic solution under the same conditions as reported elsewhere [20.]．第五通道以下的HACs在使用前被电镀。人真皮成纤维细胞(HDFs)得到了D. K. Rah教授(延世大学医学院整形和重建外科，首尔，韩国)的友好支持，并在与之前报道相同的条件下常规维持在完整的DMEM中[21]．研究在初始传代数(PN)内进行．

２.２.细胞毒性试验

EGCG（MW 458.4）是好心从BMG公司（日本东京）的支持。活细胞的数量使用高水溶性四唑盐[间接地定量WST-8 2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺苯基） --2H-四唑鎓一钠盐（株式会社同仁化学实验室，熊本，日本）通过线粒体脱氢酶还原成水溶性甲染料。细胞活力是公知的是正比于在WST-8中得到的代谢反应产物。生长至80％汇合后，将所有的原代细胞（RVSMCs，将HDF和HACS）用递增浓度（处理过μ.M）EGCG，然后用WST-8温育，在培养时期（24小时）在黑暗中在37℃下孵育。为了避免抗氧化剂，EGCG和WST-8之间的直接反应，完全除去过量的EGCG，在添加WST-8之前交换培养基。含有新鲜培养的非生成细胞的平行孔被认为是阴性（ - ）对照。使用ELISA读取器（SpectraMax 340，分子装置Co.，Sunnyvale，CA，USA），在450nm处测定吸光度。在新鲜对照培养基中确定相对细胞活力被确定为培养基中的光密度（含有EGCG）的百分比比。IC._50.值，抑制50％细胞生长的浓度（％），从相对细胞活力曲线估计。

2.3。衰老诱导连续传代和EGCG处理

用于诱导衰老，原代细胞进行系列在EGCG [的存在或不存在的预定的次数和时间间隔传代22]．将所有细胞覆盖为48孔板，初始播种数为2×10⁴通过孵育48小时，细胞/ ml并生长至80％汇合。每次通过在一家合作中培养24小时₂带有媒体刷新的孵化器。从第3代到第20代，每次50分，EGCG加入到RVSMCs和HACs培养基中μ.连续培养过程中米，媒体茶点。将HDF在EGCG（50和100的存在，从通路7串联培至≥40 μ.EGCG的浓度，对每个原代细胞的活力没有不良影响，从每个细胞毒性谱测定。经EGCG处理或不经EGCG处理连续传代后，进行细胞衰老试验、形态学观察、细胞周期分析和western blot分析，具体如下所述。

2.4.细胞衰老试验

比较用或没有EGCG处理的连续传代的原代细胞的衰老水平，衰老相关的活性β- 根据制造商的说明，通过使用细胞衰老测定套件（Chemicon International Inc.，Ca，Ca，USA）测定细胞衰老的标记物。在吸入生长培养基后，用2mL磷酸盐缓冲的盐水（PBS，pH 7.0）洗涤细胞一次，每孔加入1ml 1×固定溶液，并在室温下温育分钟。去除固定液后，用2ml PBS再次冲洗细胞。然后加入新配制的1X SABG检测液2ml，在37℃无CO孵育₂和protected from the light for at least 4 h. The blue stained cells were counted under an Olympus IX70 inverted microscope (Olympus Optical Co., Osaka, Japan), and the number of senescent cells per mm²作图。

2.5。细胞周期分析

对于细胞周期分析，每个小区，以下在没有或EGCG的存在连续传代，被通过胰蛋白酶消化收集，并用冷的PBS（pH7.2）中洗涤。这cells were resuspended in 95% cold methanol for 1 h at 4°C and then centrifuged at 120 ×g for 5 min. The resultant pellet was washed twice with cold PBS and incubated with RNase A (at 20 units/mL final concentration, Sigma-Aldrich Co.) at 37°C for 30 min. Intracellular DNA was labeled with 100 μ.g/mL propidium iodide (PI, Sigma-Aldrich Co.) for 1 h. At least 20,000 cells were counted by a flow cytometer (FACSCalibur, BD Biosciences, San Jose, CA, USA), and the data obtained were with the ModFit LT program for Mac version 3.0 software (Verity Software House, Topsham, ME, USA).

2.6。Western印迹分析

串行通道和H后₂O₂加入150 μ.在EGCG存在或不存在的情况下，用冷PBS (10 mM, pH 7.4)冲洗HDFs 2次。将冰冷的RIPA裂解缓冲液(Santa Cruz Biotechnology Inc.， Santa Cruz, CA, USA)添加到细胞中5分钟。刮取细胞，4℃，14000×g离心20 min，清除裂解液。从总裂解液中提取蛋白质，并根据制造商的方案(Pierce, Rockford, IL, USA)用BCATM蛋白测定法测定蛋白质浓度。免疫印迹分析，35-40μ.g蛋白在4/20聚丙烯酰胺- sds凝胶上(Daiichi Pure Chemicals Co.， Ltd, Tokyo, Japan)在30 mA下运行1小时，并在35 mA下印迹PVDF膜50分钟。在室温下用阻断缓冲液(Nacalai Tesque Inc.， Kyoto, Japan)阻断膜1小时，然后用一抗(Ab)孵育。用辣根过氧化物酶偶联的抗鼠IgG (1:20 00, Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK)或抗兔IgG二级抗体(1:50 000,Santa Cruz Biotechnology Inc.)处理膜。采用Chemilumi-one化学发光试剂盒(Nacalai Tesque Inc.)和x射线胶片(Fujifilm, Tokyo, Japan)检测蛋白表达。采用Scion图像进行密度分析(Scion Corporation, Frederick, MD, USA)。使用针对以下抗原的抗体进行免疫印迹:Sirt1(小鼠单克隆IgG1)和acetyl-p53(兔多克隆Ab)用于Upstate Biotechnology Inc. (Lake Placid, NY, USA) 1:50 00 - 1,000稀释，Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA) p53(兔多克隆Ab)和p21(兔单克隆Ab) 1:50 00稀释，并作为参考。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH，小鼠单克隆抗体)1:5 000稀释从Chemicon国际公司。

2.7。HDFS中FITC-EGCG的蜂窝摄取

In order to examine the differential incorporation patterns of EGCG into the proliferating HDFs (with 5 PN) and their senescent counterparts (with 30 PN), EGCG was conjugated with FITC (Dojindo Lab., Kumamoto, Japan) by using the same procedures as reported elsewhere [23]．当细胞达到80%汇合时，用100μ.用3.5%多聚甲醛在0.1 M磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中室温固定5分钟。随后，用荧光显微镜(Biozero-8000, Keyence，大阪，日本)和共聚焦激光扫描显微镜(LSM 510，卡尔蔡司先进成像显微镜，耶拿，德国)检测FITC-EGCG的细胞摄取。

2.8。统计分析

所有变量在每个实验中，将其重复两次三个独立培养物进行了测试（）.这results are reported as a mean ± standard deviation (SD) compared with the nontreated controls. A one-way analysis of variance (ANOVA, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA), which was followed by a Tukey honestly significant difference (HSD) test for the multiple comparisons, was used to detect the senescence level and cell cycle progression of serially passaged primary cells before and after EGCG treatment and effects of EGCG on Sirt1, acetyl-p53, p53, and/or p21 expression in serially passaged and H₂O₂对待HDFs。这价值被认为是统计显著。

3.结果和讨论

３．１．EGCG对增殖和衰老细胞的细胞毒性

EGCG的细胞毒性，以增殖和衰老的原代细胞用WST-8测定法测定，如表1．EGCG处理24小时后，增殖(pn3) RVSMCs和衰老(pn20) RVSMCs的相对细胞活力(数据未显示)呈剂量依赖性下降_50.约1100和1155的值 μ.m分别。在增殖与EGCG高达2000浓度处理衰老HACS μ.男，在IC_50.数值约为320和327μ.m分别。IC._50.EGCG值分别为620和631μ.M代表分别增殖和衰老的HDF，。其他研究显示，IC_50.EGCG的值分别为78.0和84.4 μ.M代表年轻和老的人二倍体成纤维细胞，分别为[24]这些值比我们的结果低四倍。对这种不一致性有多种解释，包括细胞来源的差异（来自人肺的IMR-90）、测定细胞活力的方法（阿拉玛蓝染色法）、EGCG治疗期（7 d） ，以及年轻人的衰老水平（人口翻一番））和旧（人口倍增水平> 45）细胞。从这些结果中，发现RVSMC对本研究中使用的原代细胞中的EGCG最敏感。该结果意味着根据细胞物种和组织来源的细胞响应和对EGCG的敏感性不同，导致IC的变化_50.EGCG对原代细胞的价值，即EGCG产生的不同细胞毒性。

3.2。连续传代初级的衰老程度细胞前和治疗EGCG后

细胞衰老是一种现象，细胞分裂速度减慢或停止，细胞对有丝分裂刺激失去反应，但仍能存活很长一段时间[25]．进入衰老状态后，细胞经历了形态的显着变化 - 它们的体积增加，它们失去原始形状，获得扁平的细胞质[25]．为了诱导衰老，我们将初始PN小于5的RVSMCs和HACs在没有或存在50的情况下，按预定的时间和间隔连续传代μ.M EGCG。连续传代后，分别进行SABG试验和光学显微镜检查，以比较EGCG处理和未处理细胞的衰老水平和形态(图)1）.以SABG染色的RVSMCs和HACs在传代早期不易被发现，其大小和形态变化较小(图)1(一)和1 (b)）.然而，在连续传代(20代)后，大多数未处理的细胞呈蓝色。另一方面，当细胞被50μ.M EGCG, SABG染色的细胞很少或未检出。定量结果显示，RVSMCs和HACs的连续传代诱导衰老显著(）由50防止 μ.中号EGCG处理（图1 (c)和1 (d)）.

在具有5和7之间的初始PN，前衰老表现出纺锤形的形态，而连续传代后它们逐渐变大的，扁平的形状并表示蓝色斑点表示的脂褐质积聚细胞（图的HDF的情况下2(一个)）.在50岁时，HDFs中一系列通道诱导的衰老部分得到了阻止μ.中号EGCG，而100 μ.中号EGCG显著（)防止细胞衰老(图2 (b)）.一项开创性的研究报告表明，激动素、EGCG、全反式维甲酸和硒等抗衰老剂显著降低了含20pn的人真皮微血管内皮细胞的衰老水平;同时增殖和代谢活性显著增加[26]．

3.3。之前和EGCG处理后，细胞周期进程中连续传代原代细胞

为了定量细胞周期进展，DNA含量用FACS分析用PI染色（表2）.在没有EGCG处理的晚期传代(20 PN) RVSMCs中，82.1%的细胞在G₀/ G₁相伴随S相的减少(表2(a))。而RVSMCs的治疗剂量为50μ.M EGCG显示细胞群在G₀/ G₁，s和g₂/ m分别在串行通道后恢复到61.0,24.4和14.6％，尽管它们不是正常水平。在晚期通道（30 pn），没有或50 μ.M EGCG, G处HDFs的数量₀/ G₁显著阶段（）增加，而在S期显著细胞群（）下降（表2（B））。细胞达到复制衰老在它们经历细胞分裂的能力被削弱，并且无法通过ģ₁/ S限制点[27]因此，血清刺激后的衰老细胞可表达早期和中期G₁基因，但不晚g ^₁或S期的基因[22]．这种无法遍历g₁从不能衰老细胞/ S屏障结果CDK 2的激活复合物与细胞周期蛋白E和细胞周期蛋白d [28]．

在另一方面，与100处理 μ.M EGCG诱导细胞周期进程恢复接近正常水平。特别值得一提的是，G₀/ G₁阶段显著(）在100时用EGCG处理的细胞低 μ.M. Cyclin D是一种有助于早期G₁相位和G₁/通过与CDK4和CDK6结合实现S转变[19]与未经处理的细胞相比，经激动素或硒处理的细胞在传代后期的表达增加[26]CDK4和CDK6活性的缺陷，由CDK4蛋白水平的降低和CDK抑制剂p21和p16表达的增加引起，是细胞衰老的原因[29]．因此，具有敲除的P21旁路复制衰老的人成纤维细胞并变成了[30.]．在之前和EGCG处理后HACS细胞周期的进展显示在HDFS中的类似的模式到（表2(c))。然而，EGCG的这种作用的确切机制尚不清楚。

3.4.EGCG对连续传代和H₂O₂对待HDFs

p53是一种肿瘤抑制蛋白，它可以对DNA损伤和活性氧(ROS)等应激信号作出反应，从而诱导细胞周期阻滞或凋亡[31]．据报道，促进细胞衰老的p53乙酰化可以由Sirt1调控，Sirt1是酵母SIR2的人类同源物，是一种调节寿命的蛋白质[32]．据公认，减少食物摄取（热量限制）在一个宽范围的物种[延伸寿命33- - - - - -35]．参与这一寿命延长的蛋白质是Sirt1的，属于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的酶（NAD）⁺依赖的蛋白去乙酰化酶。的SIR调节基因沉默，DNA修复，重组的rDNA，并从调节程序性细胞死亡老化，除了[35]．此外，已有研究证明，在神经退行性疾病中，Sirt1的过表达可以拯救神经元，这是由热量限制或白藜芦醇诱导的[36，37]．为了研究EGCG预防衰老的潜在机制，我们通过western blot检测了连续传代后，在EGCG不存在或存在的情况下，Sirt1、乙酰化p53和HDFs中的p53等蛋白的表达水平(图)3.）.的SIRT1的表达略有降低作为PN增加至30，而EGCG即使经过30代保持其表达水平在一定程度上。相反，乙酰化的p53和p53的表达水平连续传代后显着地提高到30，而它们显着地减少了EGCG处理。我们可以得到EGCG对连续传代RVSMCs像HDF内的乙酰化p53表达的抑制作用一些有意义的结果，但不是在HACS（数据未显示）。这些发现可能的事实，HACS是最敏感的EGCG在这项研究中所使用的原代细胞中（表中可以部分解释1）.通常，关节软骨细胞表现出增殖和合成容量的年龄相关的下降，同时保持以产生促炎介质和基质降解酶的能力[38.]．虽然在HACs中伴随连续传代的复制性衰老有助于倾向于失去分裂能力，但它们的功能可能在达到细胞周期停滞之前就开始恶化，包括异常的蛋白质合成、改变的生长因子反应和更长的种群倍增时间[39.]．

这些结果与EGCG对150组HDFs中Sirt1、乙酰化p53和p21表达变化的影响进行了比较μ.M.₂O₂(图4）.一些报道已经揭示使得h₂O₂治疗通过改变细胞内ROS [诱导细胞衰老40，41.]．虽然h，Sirt1的表达几乎没有变化₂O₂治疗。然而，乙酰化P53和P21的表达是p53的转录靶标，显着（）增加了h₂O₂治疗。H₂O₂通过NAD通过SIRT1的功能的降低，通过乙酰化P53积聚来加速细胞衰老⁺损耗(35]．另一方面，H₂O₂-诱导的p53乙酰化和p21表达降低。有报道称，在激动素和硒等抗老化剂处理的原代细胞中，p16、p21、p27和p53的表达显著降低[25]．据认为，Sirt1的可能允许的氧化应激损伤修复的细胞内蛋白质[42.]．这种可能性部分是由于EGCG可以部分维持Sirt1的活性并同时刺激p53的乙酰化。

3.5。FITC-EGCG的差动模式掺入到增殖与衰老的HDF

到EGCG的内在化比较进入细胞质和增殖（PN 5）与他们的衰老的将HDF（PN 30）的对应的进一步的核易位，在用100处理的两种细胞进行荧光显微镜 μ.M FITC-EGCG。虽然细胞对FITC-EGCG的反应及其与膜受体的结合模式与EGCG不同，但在处理8小时后，FITC-EGCG主要出现在增殖细胞的细胞质上，而不在细胞核上(图)5（a））.相反，FITC-EGCG完全分布在包括细胞质和细胞核的衰老细胞内（图5（b））.FITC-EGCG进入衰老细胞的这种掺入模式几乎类似于L-929纤维细胞系[23]．

这些结果更由相同的条件荧光显微镜下进行共焦显微镜证实。观察到FITC-EGCG被吸附在膜上，并在增殖的HDF，特别是剧烈的明亮的绿色荧光的细胞质中掺入（图6(一)）.在高倍镜下，可以清楚地发现FITC-EGCG部分移位到细胞核中，结合到核内体样结构。FITC-EGCG在增殖细胞中的核转位模式与在衰老细胞中的核转位模式完全不同，这被认为是增殖细胞与衰老细胞对EGCG反应差异的重要因素。衰老细胞共聚焦显微镜显示FITC-EGCG广泛分布于细胞质和细胞核(图)6 (b)）.此外，衰老细胞进行FITC-EGCG的可比对正常细胞的核易位经历凋亡[21]人类纤维糖（HT-1080）细胞（作为HDFS的癌症同行）[31]．虽然EGCG进入细胞的确切机制尚未完全阐明，但已有证据表明，EGCG可以结合细胞膜内化到癌细胞的细胞质和细胞核中，如经[^3.H] EGCG [43.，44.].这些定量结果使用[^3.H]EGCG与我们的定性结果一致，即FITC-EGCG被整合到增殖细胞及其衰老对应物的细胞质中。然而，FITC-EGCG在增殖细胞中的核易位模式与衰老细胞中的核易位模式完全不同。另一项研究表明，FITC-EGCG在增殖细胞中的核易位模式与衰老细胞中的核易位模式完全不同转移相关肿瘤的复发67例 kDa层粘连蛋白受体可能赋予EGCG对癌细胞的反应性，表明EGCG的没食子酸部分可能对受体结合和随后的活性至关重要[45.]．这些结果表明，FITC-EGCG可以结合到细胞的细胞质中，而不管增殖和衰老，通过结合特定的受体并与它们形成复合物，而在增殖和衰老细胞中，FITC-EGCG可能会不同程度地转移到细胞核中。

总之，我们发现，EGCG在100 μ.男，这可能是很难通过节食来达到，可以防止串行passage-和H₂O₂-通过显著抑制p53乙酰化而不影响Sirt1活性，并显示出对EGCG的不同细胞反应，以及EGCG在增殖与衰老HDFs中的摄取模式。从这些结果，提示EGCG可能被开发成一种抗衰老或延缓衰老的药物。尽管口服和腹腔治疗后，EGCG在血浆中的浓度可能比这里使用的低得多[46.]，可在相对较高水平的发生的EGCG对细胞衰老，例如预防效果。因此，对于未来的研究方向包括绿茶的正常消费的调查结果中关系的生理相关的研究，药代动力学和EGCG代谢产物的作用，EGCG与其他抗氧化剂或药物的潜在的协同作用。

缩写

阿瑟:	抗体
CDK:	细胞周期蛋白依赖性激酶
DMEM:	杜尔贝科改良的鹰牌中型飞机
EGCG：	Epigallocatechin3-O没食子酸盐
的边后卫:	胎牛血清
FITC：	Fluorescein-4-isothiocyanate
工厂:	人体关节软骨细胞
HDFS：	人真皮成纤维细胞
HSD：	老实说显著差异
NAD:	烟酰胺腺嘌呤二核苷酸
PBS：	磷酸盐缓冲溶液
PI:	碘化丙烯酸铅
PN:	段落号码
ROS:	活性氧
RVSMCs:	大鼠血管平滑肌细胞
SD:	标准偏差
SABG：	衰老相关β半乳糖苷酶
先生：	静音信息调节器
WST-8：	水溶性四唑盐。

利益冲突

提交人声明没有利益冲突。

致谢

这部分工作是由格兰特由知识经济部，韩国（K0006028）和基础科学研究计划通过资助的韩国国家研究基金会（NRF）的资助材料的核心技术基本R＆d项目支持教育部，科学，科技（2012-0003645）。

补充材料

参考

1. L.海弗利克和P. S.莫尔里德，“人二倍体细胞菌株的连续培养，”实验细胞研究，第25卷，第2期3，第585-621，1961。视图:谷歌学术
2. M. Collado, M. A. Blasco，和M. Serrano，《癌症和衰老中的细胞衰老》，细胞，卷。130，否。2，第223-233，2007。视图:出版商网站|谷歌学术
3. S.-J。Park, F. Ahmad, A. Philp等人，“白藜芦醇通过抑制cAMP磷酸二酯酶改善衰老相关的代谢表型，”细胞第一四八卷第一百四十八期3，页421-433,2012。视图:出版商网站|谷歌学术
4. J.S.Allard、E.Perez、S.Zou和R.de Cabo，“Sirt1的饮食激活剂，”分子和细胞内分泌学，卷。299，没有。1，第58-63，2009年。视图:出版商网站|谷歌学术
5. M.V.Blagosklonny，“今天的抗衰老药物：从促进衰老的基因到抗衰老药丸，”药物发现今天，第12卷，第2期5-6，页218-224,2007。视图:出版商网站|谷歌学术
6. K. T. Howitz，K. J. Bitterman，H. Y. Cohen等人，“沉默调节蛋白的小分子活化剂延伸酿酒酵母寿命。”自然，卷。425，没有。6954，PP。191-196,2003。视图:出版商网站|谷歌学术
7. J. C. Mak，“绿茶儿茶素在各种疾病治疗中的潜在作用:进展和希望”，临床和实验药理学和生理学第39卷第3期3，页265-273,2012。视图:出版商网站|谷歌学术
8. S.艾哈迈德，“绿茶多酚没食子儿茶素关节炎3没食子酸酯：进展与前景，”关节炎研究和治疗，第12卷，第2期2，第208条，2010。视图:出版商网站|谷歌学术
9. K.B.Pandey和S.I.Rizvi，“植物多酚作为饮食抗氧化剂在人类健康和疾病中的作用，”氧化医学和细胞寿命，第2卷，第2期5, pp. 270-278, 2009。视图:出版商网站|谷歌学术
10. M. E. Obrenovich, N. G. Nair, A. Beyaz, G. Aliev, V. P. Reddy，《多酚抗氧化剂在健康、疾病和衰老中的作用》，复兴研究，第13卷，第2期6，页631-643,2010。视图:出版商网站|谷歌学术
11. B. L. Queen和T. O. Tollefsbol，《多酚与衰老》，目前衰老科学，第3卷，第2期。1，页34-42,2010。视图:出版商网站|谷歌学术
12. J. A.金“机制分析茶叶中的儿茶素的保健功效，改善胰岛素抵抗和内皮功能障碍，”内分泌，代谢及免疫疾病，卷。8，不。2，第82-88，2008年。视图:出版商网站|谷歌学术
13. E. Bulku, D. Zinkovsky, P. Patel等人，“一种包含多种植物化学物质和维生素的新型膳食补充剂在没有显著血清化学和基因组变化的情况下提高肝肾和心脏抗氧化酶，”氧化医学和细胞寿命，第3卷，第2期。2，页129-144,2010。视图:出版商网站|谷歌学术
14. S. A. Mandel, T. Amit, O. Weinreb, M. B. H. Youdim，“了解绿茶多酚在衰老和神经退行性疾病中的广谱神经保护作用谱”，阿尔茨海默病杂志，第25卷，第2期2，页187-208,2011。视图:出版商网站|谷歌学术
15. V. Stangl, M. Lorenz，和K. Stangl，《茶和茶类黄酮在心血管健康中的作用》，分子营养和食品研究，卷。50，不。2，pp。218-228,2006。视图:出版商网站|谷歌学术
16. M.尚穆根，R. Kannaiyan，和G.塞提，“定位细胞信号传导和细胞凋亡途径通过膳食剂：在癌症的预防和治疗作用，”营养和癌症，卷。63，没有。2，第161-173，2011。视图:出版商网站|谷歌学术
17. M. H. Pan, C. S. Lai, S. Dushenkov，和C. T. Ho，“天然饮食生物活性化合物对炎症基因的调节”，农业和食品化学杂志，第57卷，第11期，第4467-4477页，2009年。视图:出版商网站|谷歌学术
18. J. Y. Bae, J. Kanamune, D. W. Han, K. Matsumura, S. H. Hyon，“表没食子儿茶素没食子酸酯对新生儿tarsal成纤维细胞冬眠的可逆性调控细胞周期相关基因”，细胞移植，卷。18，不。4，第459-469，2009。视图:出版商网站|谷歌学术
19. Cho，D.W.Han，K.Matsumura，S.Tsusumi和S.H.Hyon，“血管平滑肌细胞和血小板在表没食子儿茶素没食子酸酯释放聚（l-丙交酯）上的行为-有限公司-ε.-己内酯)作为支架涂层材料，”生物材料，卷。29，不。7，第884-893，2008。视图:出版商网站|谷歌学术
20. J.Y.Bae，D.W.Han，K.Matsumura，S.Wakitani，M.Nawata和S.H.Hyon，“表没食子儿茶素-3-没食子酸盐可逆调节细胞周期和nf的非冷冻保存关节软骨-κ..乙表达式中，”组织工程，卷。16，不。2，第595-603，2010。视图:出版商网站|谷歌学术
21. D.W.Han、M.H.Lee、H.H.Kim、S.H.Hyon和J.C.Park，“表没食子儿茶素没食子酸酯调节细胞生长、细胞周期和磷酸化核因子-κ..的B人体皮肤成纤维细胞”Pharmacologica学报，第32卷，第2期5, pp. 637-646, 2011。视图:出版商网站|谷歌学术
22. R. Marcotte, C. Lacelle，和E. Wang，“衰老成纤维细胞通过下调caspase-3来抵抗凋亡”老化和发展机制，卷。125，没有。10-11，第777-783，2004。视图:出版商网站|谷歌学术
23. D.W.Han、K.Matsumura、B.Kim和S.H.Hyon，“FITC结合表没食子儿茶素-3的时间依赖性细胞内转运-O-没食子酸酯"生物有机和药用化学，卷。16，不。22，第9652-9659，2008。视图:出版商网站|谷歌学术
24. Q.孟，C.N。Velalar和R.阮，“线粒体完整性和在人成纤维细胞的老化过程抗氧化酶活性没食子儿茶素-3-没食子酸酯的影响，”自由基生物学与医学，第44卷，第5期。6，第1032至41年，2008年。视图:出版商网站|谷歌学术
25. 一，本·波拉斯和R. A.温伯格，“当细胞得到强调：细胞衰老的综合视图，”临床调查杂志，第113卷，第113期。1，页8-13,2004。视图:出版商网站|谷歌学术
26. J. H. Lee，K. Y.Chung，D. Bang，以及K. H. Lee，“李·李，”李·李“在用抗衰老剂处理的人类皮肤微血管内皮细胞中寻找衰老相关蛋白质，”蛋白质组学，第6卷，第2期4, pp. 1351-1361, 2006。视图:出版商网站|谷歌学术
27. V. J. Cristofalo，P. D.菲利普斯，T. Sorger和G.格哈德，“改建在衰老细胞对生长因子的响应性，”Gerontology期刊，第44卷，第5期。6，页55-62,1989。视图:谷歌学术
28. V.Dulic，L.F.Frullinger，E. Lees，S. I. Reed和G. H. Stein，在衰老人类二倍体成纤维细胞中改变了G1微调的调节：无活性细胞周期蛋白E-CDK2和细胞周期蛋白D1-CDK2复合物的累积，“美国国家科学院学报，第90卷，第5期。23，第11034-11038页，1993。视图:出版商网站|谷歌学术
29. J. P.布朗，W.卫，和J. M.谢迪维，“（CIP1）在正常的二倍体人成纤维细胞/（WAF1）基因的p21的破碎后senescenoe的旁路，”科学，卷。277，没有。5327，第831-834，1997。视图:出版商网站|谷歌学术
30. G. H.斯坦，L. F. Drullinger，R. S. Robetorye，O. M. Pereira的史密斯，和J·R·史密斯，“衰老细胞未能表达CDC2，CYCA和cycB响应于有丝分裂原刺激，”美国国家科学院学报第88期第24页，第11012-11016页，1991。视图:谷歌学术
31. M. H. Lee, D. W. Han, S. H. Hyon, and J. C. Park， "表没食子儿茶素-3-对人纤维肉瘤HT-1080细胞凋亡的影响O- 通过诱导P53和半酶以及抑制Bcl-2和磷酸化核因子的抑制 -κ..B，“细胞凋亡，卷。16，不。1，第75-85，2011。视图:出版商网站|谷歌学术
32. S.久米，M.羽田，K。Kanasaki等人，“沉默信息调节2（SIRT1）衰减氧化应激诱导肾小球系膜细胞的p53通过脱乙酰化的细胞凋亡，”自由基生物学与医学，卷。40，不。12，页。2175年至2182年，2006年。视图:出版商网站|谷歌学术
33. H.Y.Cohen，C.Miller，K.J.Biterman等人，“热量限制通过诱导SIRT1脱乙酰酶促进哺乳动物细胞存活，”科学号，第305卷。第2页，第2 - 3页，2004。视图:出版商网站|谷歌学术
34. B. K. Kennedy, K. K. Steffen和M. Kaeberlein，《饮食限制和衰老的反刍》，细胞和分子生命科学，第64卷，第11期，第1323-1328页，2007年。视图:出版商网站|谷歌学术
35. M.Pallàs，E.Verdaguer，M. Tajes，J.Gutierrez-Cuesta和A. Camins，“Sirtuins的调制：抗锯齿的新目标”关于CNS药物发现最近的专利，第3卷，第2期。1，pp。61-69,2008。视图:出版商网站|谷歌学术
36. S.Srivastava和M.C.Haigis，“sirtuins和热量限制在神经保护中的作用：在阿尔茨海默病和帕金森病中的意义，”当前的药物设计，第十七卷，第二期31, pp. 3418-3433, 2011。视图:出版商网站|谷歌学术
37. G. S. Kelly，“对Sirtuin系统的审查，其临床意义，以及膳食活化剂如白藜芦醇：第2部分，”替代医学评论，第15卷，第5期。4，页313 - 328,2010。视图:谷歌学术
38. R. F. Loeser，《衰老与骨关节炎:软骨细胞衰老和软骨基质老化变化的作用》，骨关节炎和软骨，第十七卷，第二期8, pp. 971-979, 2009。视图:出版商网站|谷歌学术
39. J. A. Martin和J. A. Buckwalter，“老龄化，关节软骨的软骨细胞衰老和骨关节炎，”Biogerontology，第3卷，第2期。5，第257-264，2002。视图:出版商网站|谷歌学术
40. Wang y, A.孟，and D. Zhou， " inhibitory磷脂酰乙醇3-kinase un偶联H .₂O₂诱导的衰老表型和细胞周期阻滞在正常的人二倍体成纤维细胞，”实验细胞研究第298卷1，页188-196,2004。视图:出版商网站|谷歌学术
41. A.古河，S.多田-及川，S.川西和S.及川，“H₂O₂通过NAD降低SIRT1的功能，使乙酰化p53的积累加速细胞衰老⁺消耗。”细胞生理学与生物化学，第20卷，第2期。1-4，页45-54,2007。视图:出版商网站|谷歌学术
42. I. Afanas'ev，“活性氧气和年龄相关的基因p66shc，Sirtuin.，FOX03和凯洛在衰老。，“氧化医学和细胞寿命，第3卷，第2期。2，pp。77-85，2010。视图:谷歌学术
43. S. Okabe, M. Suganuma, M. Hayashi, E. Sueoka, A. Komori，和H. Fujiki，“茶多酚抑制人肺癌细胞系PC-9生长的机制”，日本癌症研究杂志第88期7，第639-643页，1997。视图:谷歌学术
44. J. Hong, H. Lu, X. Meng, J. H. Ryu, Y. Hara, and C. S. Yang, “Stability, cellular uptake, biotransformation, and efflux of tea polyphenol (-)-epigallocatechin-3-gallate in HT-29 human colon adenocarcinoma cells,”癌症研究，卷。62，没有。24，第7241-7246，2002年。视图:谷歌学术
45. H.橘，K.古河，藤村Y.和K山田，“一个绿茶多酚EGCG受体”自然结构和分子生物学，卷。11，不。4，第380-381，2004。视图:出版商网站|谷歌学术
46. J. D.兰伯特，M. J.李，H. Lu等人，“表儿茶素-3-没食子酸酯被吸收但广泛葡萄糖醛酸化的口服给药后对小鼠，”营养杂志，第133卷，第12期，第4172-4177页，2003年。视图:谷歌学术

版权

版权所有©2012李东旭汉等人。这是分布下的开放式访问文章知识共享署名许可协议，允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，但必须正确引用原作。