1。介绍
细胞衰老意味着不可逆状态增长逮捕的正常细胞失去分裂的能力通常大约50个细胞分裂
在体外(
1]。一些细胞衰老后更少的复制周期后由于DNA双链断裂。这种现象也被称为复制衰老,被海弗利克首次报道,学习观察正常人成纤维细胞能够进入不可逆状态增长连续种植后被捕
在体外;同时癌细胞没有进入这种增长逮捕无限期状态和数量(
1]。细胞衰老可以由多个触发机制包括端粒缩短的表观遗传脱抑制细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂2轨迹,和DNA损伤(
2]。此外,这些机制限制或异常细胞过度增殖,所以衰老的预防癌症的发展和参与老化(
2]。在过去的十年里,许多证据表明,白藜芦醇,红酒中的一种多酚,施加一个卡路里限制模仿活动与一个潜在的抗衰老的属性通过激活沉默信息监管机构(先生)基因(
sirtuins蛋白)或抑制cAMP-degrading磷酸二酯酶(
3- - - - - -
6]。
从这个角度来看,我们已经注意epigallocatechin3 -
O没食子酸盐(EGCG),因为它有一个非常相似的白藜芦醇的结构包括两个氢氧根metapositions一枚戒指,
反式B环4′,3′,4′羟基模式(
6]。EGCG、最活跃和绿茶多酚类的主要成分,是众所周知的是一个主要贡献者绿茶对人体健康的潜在好处(
7- - - - - -
9]。但EGCG的作用在体内疾病的病因和治疗,包括神经退化、致癌作用,动脉粥样硬化和肥胖并不是确定的,有些仍质疑其体内作用机理的本质(
10,
11]。虽然行动的机制是由某些有争议的调查人员,还有一个清晰的识别基于许多
在体外,
在活的有机体内,流行病学研究表明,EGCG具有有益健康的影响(
12,
13]。EGCG的主要作用机制已经被认为是参与其强大的抗氧化活性,使神经保护和心脏保护
14,
15]。其他支持机制需要chemopreventive,抗炎,抗血栓,甚至cytoprotective EGCG的影响(
16- - - - - -
18]。在目前的研究中,我们调查的预防作用EGCG对串行通道——H2O2全身衰老的主要细胞。作为一个潜在的机制EGCG衰老预防活动,我们决定Sirt1的参与和乙酰化p53表达。此外,我们研究了微分反应EGCG在增殖与细胞衰老主要通过比较EGCG共轭的整合模式与fluorescein-4-isothiocyanate (FITC)增生的成纤维细胞的衰老同行。
2。材料和方法
2.1。细胞培养和条件
大鼠血管平滑肌细胞(RVSMCs)被限制酶消化分离中模的胸主动脉的男性青少年(10周)Wistar鼠(
280年
~
300年
克重、清水实验室用品、日本京都)如前所报道[
19]。主要培养RVSMCs保持在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM Sigma-Aldrich有限公司,圣路易斯,密苏里州,美国)补充10%胎牛血清(的边后卫,Sigma-Aldrich Co。)和1%抗生素抗真菌的解决方案(包括青霉素10000单位,10毫克链霉素,25岁
μ克每毫升两性霉素B, Sigma-Aldrich有限公司)在37°C公司湿度在95%和5%2。研究进行的细胞第三至第五段。人关节软骨细胞(hac)请支持j.y. Bae博士(前沿医学科学研究所、京都大学、日本)和亚文化DMEM /火腿F-12 (Sigma-Aldrich有限公司)补充10%的边后卫(Sigma-Aldrich有限公司)和1% antibiotic-antimycotic解决方案在同等条件下其他地方报道(
20.]。hac在第五段是镀前使用。人类皮肤成纤维细胞(HDFs)请支持教授d . k .万岁(整形外科、延世大学医学院,首尔,韩国)和例行维护在一个完整的DMEM先前报道得在相同条件下(
21]。研究内执行最初的通道(PN)的数量
5
~
7
。
2.2。细胞毒性试验
EGCG (458.4 MW)请支持从BMG公司(日本京都)。可行的细胞的数量是间接量化使用高水溶性四唑盐(WST-8 2 - (2-methoxy-4-nitrophenyl) 3 (4-nitrophenyl) 5 - (2, 4-disulfophenyl) 2 h-tetrazolium,味精盐)(Dojindo实验室熊本、日本)的水溶性染料甲瓒减少线粒体脱氢酶。细胞的生存能力是众所周知的直接成正比WST-8代谢反应获得的产品。增长到80%后融合,所有主要的细胞(RVSMCs, HDFs, hac)处理增加浓度(
0
~
2000年
μEGCG的M),然后孵化与WST-8文化时期的最后4小时(24小时)37°C在黑暗中。为了避免抗氧化剂之间的直接反应,EGCG和WST-8减少,多余的EGCG,完全移除,媒介是添加WST-8之前交换了。平行组井含有新鲜培养参与细胞被认为是消极的(−)控制。吸光度是确定在450 nm使用ELISA读者(SpectraMax 340分子设备有限公司,桑尼维尔,美国)。相对细胞生存能力确定的百分比比光密度在中(包含在每个浓度EGCG),在新的控制媒体。的集成电路50价值,浓度(%)抑制细胞的增长50%,据估计从相对细胞生存能力概要文件。
2.3。衰老感应串行通道和EGCG治疗
诱导衰老的主要细胞连续通过在预定的次数和间隔没有或EGCG的存在(
22]。所有的细胞都被镀成48-well板块数量最初播种的2×104细胞/毫升,增长到80%融合培养48 h。每个通道之后,为24小时种植有限公司2与媒体点心孵化器。从通道3 - 20,EGCG是添加到培养基RVSMCs和hac每次50
μ米在串行文化与媒体的茶点。HDFs是亚文化的连续通道7≥40 EGCG的存在(50和100
μ米)。EGCG的浓度,这对没有副作用每个主细胞的可行性,确定了从每个细胞毒性概要文件。系列有或没有EGCG通过治疗后,细胞衰老化验,形态学观察,细胞周期分析和免疫印迹分析进行细节如下所述。
2.4。细胞衰老检测
比较衰老程度的连续通道主要细胞治疗或没有EGCG, senescence-associated的活动
β牛乳糖(SABG),细胞衰老的标志,确定了通过使用一个细胞衰老分析工具包(Chemicon International Inc .,泰梅库拉、钙、美国)根据制造商的指示。吸气增长媒体后,细胞被洗一次2毫升磷酸盐(PBS, pH值7.0),加入1毫升1 x每口井的修复解决方案,在室温下孵化
10
~
15
分钟。切除修复解决方案后,细胞被洗2毫升PBS。然后2毫升刚做好1 x SABG检测解决方案是补充道,和混合是在37°C的环境没有有限公司2和保护光的至少4 h。蓝染色细胞数在奥林巴斯IX70倒置显微镜(日本大阪奥林巴斯光学有限公司),每毫米和衰老细胞的数量2是画的。
2.5。细胞周期分析
细胞周期分析,每一个细胞,串行通道没有或EGCG的存在,收集了胰蛋白酶化和洗冷PBS (pH值7.2)。95%的细胞被resuspended冷甲醇1 h在4°C,然后在120×g离心5分钟。合成颗粒洗两次冷PBS和孵化与核糖核酸酶(在最后20单位/毫升浓度,Sigma-Aldrich有限公司)在37°C为30分钟。与100年细胞内DNA标记
μg / mL propidium碘(π,Sigma-Aldrich有限公司)为1 h。至少20000细胞数的流式细胞分析仪(FACSCalibur, BD生物科学,圣何塞、钙、美国),和获得的数据与ModFit LT程序3.0 Mac版软件(真实软件的房子,Topsham,我,美国)。
2.6。免疫印迹分析
在串行通道和H2O2除了在150
μM 1 h,在没有或EGCG, HDFs被洗两次冷PBS(10毫米,pH值7.4)。冰冷的里帕裂解缓冲(圣克鲁斯生物技术公司,圣克鲁斯,CA,美国)被添加到细胞5分钟。细胞刮,溶解产物是通过在14000×g离心20分钟在4°C。从总溶解产物提取蛋白质,蛋白质浓度是由BCATM蛋白质测定根据制造商的协议(美国皮尔斯,罗克福德,IL)。免疫印迹分析,35 - 40
μg蛋白质是运行在一个4/20 polyacrylamide-SDS凝胶(Daiichi纯化学品有限公司,东京,日本)1 h 30 mA和涂抹PVDF膜马50分钟35岁。膜被阻断缓冲区(Nacalai Tesque Inc .,京都,日本)在室温下1 h,然后孵化主要抗体(Ab)。细胞膜是一个对待antimouse免疫球蛋白(下,Amersham生物科学,白金汉郡,英国)或一个antirabbit免疫球蛋白二级Ab(1:5,000,圣克鲁斯生物技术有限公司),辣根peroxidase-conjugated。蛋白表达是由Chemilumi-one化学发光检测设备(Nacalai Tesque Inc .)和x射线胶片(富士胶片、东京、日本)。与接穗图像光密度分析(Scion公司,弗雷德里克,医学博士,美国)。针对以下抗原的免疫印迹进行使用Abs: Sirt1(鼠单克隆IgG1)和acetyl-p53(兔多克隆Ab)用于1:50 0 - 1000稀释北部生物技术有限公司(美国纽约普莱西德湖),p53 p21(兔多克隆Ab)和(兔单克隆Ab) 1: 500稀释从细胞信号技术有限公司(丹弗斯、马、美国),作为参考,glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH、鼠标单克隆Ab) 1: 5000稀释Chemicon国际公司。
2.7。细胞吸收FITC-EGCG HDFs
为了检查EGCG的微分整合模式进入增殖HDFs (5 PN)和衰老同行(30 PN), EGCG和FITC共轭(Dojindo实验室熊本、日本)通过使用相同的程序其他地方报道(
23]。当细胞达到80%汇合,他们对待100
μM FITC-EGCG 8 h然后用3.5%多聚甲醛固定在0.1 M磷酸盐缓冲剂(pH值7.0)在室温下为5分钟。后来,FITC-EGCG的细胞吸收与荧光显微镜检查(biozero - 8000,日本基恩士、大阪、日本)和共焦激光扫描显微镜(LSM 510年,卡尔蔡司先进成像显微镜,耶拿,德国)。
2.8。统计分析
所有变量在三个独立的文化对于每个测试实验中,出现2次(
n
=
6
)。结果报告为一个平均值±标准偏差(SD)与参与。单向方差分析(ANOVA、SAS研究所Inc .卡里,数控,美国),紧随其后的是一个图基诚实的显著差异(HSD)测试多个比较,是用来检测衰老和细胞周期进程的连续通道EGCG前后主要细胞治疗和EGCG对Sirt1的影响,acetyl-p53, p53、p21和/或表达连续通道和H2O2对待HDFs。的
P
价值
<
0.05
被认为是具有统计学意义。
3所示。结果与讨论
3.1。细胞毒性的EGCG增殖和衰老细胞
细胞毒性EGCG增殖和衰老细胞主要是由WST-8分析如表所示
1。增殖(PN 3) RVSMCs和衰老(PN 20)同行接触到EGCG对24小时显示剂量依赖性降低相对细胞生存能力与IC(数据未显示)50值约1100年和1155年
μM,分别。在增殖和衰老hac对待EGCG的浓度高达2000
μ米,集成电路50值被证明是大约320年和327年
μM,分别。的集成电路50EGCG的值被确定为620年和631年
μ分别M增殖和衰老HDFs。其他研究显示,集成电路50EGCG的值分别为78.0和84.4
μ分别M老少人类二倍体成纤维细胞(
24]。这些值是4倍低于我们的结果。有很多原因可以解释这种不一致,包括不同的细胞源(imr - 90从人类肺)、方法(Alamar蓝色染色)决定细胞生存能力,EGCG治疗期间(7 d)和衰老程度的年轻(人口翻倍的水平
2
5
~
30.
)老(> 45岁的人口翻番水平)细胞。从这些结果,发现RVSMCs是最不敏感的EGCG在这项研究中使用的主要细胞之一。这个结果意味着细胞反应和敏感EGCG是不同的根据细胞种类和组织起源,导致集成电路的变化50EGCG的价值的主要细胞,即微分EGCG的细胞毒性。
集成电路50EGCG的价值增殖和衰老的主要细胞。
| 主细胞 |
集成电路50EGCG,
μ米(
μg / mL) |
| 增殖RVSMCs |
1100 (
≈500) |
| 衰老RVSMCs |
1155 (
≈529) |
| 增生的肝 |
320 (
≈147) |
| 衰老肝 |
327 (
≈150) |
| 增殖HDFs |
620 (
≈284) |
| 衰老HDFs |
631 (
≈289) |
3.2。细胞衰老程度的连续通道主要EGCG之前和之后的治疗
细胞衰老的现象,细胞分裂速度减慢或停止细胞成为对促有丝分裂的刺激但长时间存活
25]。进入衰老,细胞经历戏剧性的变化在morphology-their体积增加,他们失去了原来的形状,获得一个扁平的细胞质(
25]。为诱导衰老,RVSMCs和hac最初PN低于5连续通道没有在预定的时间和间隔或50的存在
μM EGCG。串行通道后,SABG分析和光学显微镜进行为了比较衰老水平和细胞的形态,分别对待,没有EGCG(图
1)。RVSMCs hac沾染着SABG不太容易发现在早期通过小程度的大小和形态的变化(数据
1(一)和
1 (b))。然而,大多数参与细胞被染色后蓝色系列亚文化(20通道)。另一方面,当细胞接受50
μM EGCG,细胞的数量沾SABG很小或未被发现。定量结果显示串行passage-induced衰老RVSMCs和hac明显(
P
<
0.05
)防止50
μM EGCG治疗(数字
1 (c)和
1 (d))。
SABG表达连续通过RVSMCs (a)和肝(b)没有或50的存在
μM EGCG。定量结果表明RVSMCs (c)和肝(d)在早期通过(PN 3或5)没有接受EGCG蓝色或只有几个染色没有污点,但后期细胞通道(PN 20)显示蓝色染色的衰老细胞。此外,细胞治疗EGCG显示衰老细胞的数量与那些5 PN。所有变量在三个独立的文化对于每一个实验,测试是重复两次独立(
n
=
6
)。结果报告为均值±SD和分析由图基HSD测试。
P
*
<
0
。
05年
和参与细胞3 PN;
P
#
<
0
。
05年
20 PN和参与细胞。
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在HDFs中5和7之间的初始PN,细胞在衰老之前表现出纺锤状形态,而串行通道后,他们变得更大,扁平的形状和表示蓝色斑点显示脂褐质积累(图
2(一个))。串行passage-induced 50在HDFs部分是预防衰老
μM EGCG, 100
μM EGCG显著(
P
<
0.05
细胞衰老(图)预防
2 (b))。开创性的一份报告表明,人类皮肤微血管内皮细胞的老化程度与20 PN明显减少了治疗与抗衰老的药物如呋喃甲基腺嘌呤,EGCG, all-trans视黄酸,和硒;与此同时,增殖和代谢活动显著增加
26]。
SABG表达式(a)的连续通道HDFs没有或50和100
μM EGCG。定量的结果(b)表明,HDFs在早期通过(PN 5)没有接受EGCG蓝色没有污点,但在后期的细胞通道(PN 30或≥40)显示蓝色染色的衰老细胞。串行passage-induced 50在HDFs部分是预防衰老
μM EGCG, 100
μM EGCG治疗显著降低衰老细胞的数量。所有变量在三个独立的文化对于每一个实验,测试是重复两次独立(
n
=
6
)。结果报告为均值±SD和分析由图基HSD测试。
P
*
<
0
。
05年
和参与细胞5 PN;
P
#
<
0
。
05年
和参与细胞的30或≥40 PN。
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3.3。细胞周期进程的连续通道主要细胞EGCG之前和之后的治疗
量化细胞周期进展,分析了DNA含量与PI染色流式细胞仪(表
2)。在RVSMCs通道(20 PN)没有EGCG后期治疗,82.1%的细胞在G逮捕了0/ G1阶段与S期(表伴随减少
2(a))。然而,RVSMCs处理50
μM EGCG表明,G细胞群0/ G1,S, G2/ M阶段回到61.0、24.4和14.6%,分别串行通道后,尽管他们不是正常水平。在通道(PN) 30日晚些时候,或者50
μ在G M EGCG, HDFs的数量0/ G1阶段显著(
P
<
0.05
)增加,而S期的细胞群显著(
P
<
0.05
)降低(表
2(b))。细胞达到复制衰老进行细胞分裂的能力受损,无法通过G1点[/ S限制
27]。因此,血清刺激后衰老细胞可以表达早期和中期G1G基因,但是不迟1或S期基因(
22]。这无法遍历G1/ S屏障衰老细胞无法激活的结果与细胞周期素E和细胞周期蛋白复合物CDK 2 D (
28]。
细胞周期进程的连续通道RVSMCs (a), HDFs (b), hac EGCG之前和之后(c)治疗。
| RVSMCs |
%的细胞群 |
| G0/ G1 |
年代 |
G2米 |
|
| 控制一个 |
52.5±4.3 |
35.7±5.1 |
11.8±3.3 |
| 摘要 |
82.1±8.2 * |
8.4±2.8 * |
9.5±5.2 |
| EGCG-treated |
61.0±4.0*,# |
24.4±4.7*,# |
14.6±4.6 |
| HDFs |
%的细胞群 |
| G0/ G1 |
年代 |
G2米 |
|
| 控制一个 |
52.2±5.2 |
31.3±4.2 |
16.5±3.8 |
| 摘要 |
78.3±7.1 * |
8.4±3.1 * |
13.3±4.6 |
| 50
μM EGCG-treated |
69.4±6.0*,# |
15.4±3.6*,# |
15.2±4.9 |
| 100年
μM EGCG-treated |
58.1±5.2# |
27.2±6.3# |
14.7±5.5 |
| hac |
%的细胞群 |
| G0/ G1 |
年代 |
G2米 |
|
| 控制一个 |
71.4±7.1 |
14.9±5.8 |
13.7±4.0 |
| 摘要 |
90.5±8.8 * |
5.1±2.0 * |
4.4±1.5 * |
| EGCG-treated |
75.6±6.5# |
11.7±3.5# |
12.7±3.4# |
(一个增殖细胞在早期通过(PN 3或5))。所有变量在三个独立的文化对于每一个实验,测试是重复两次独立(
n
=
6
)。结果报告为均值±SD和分析由图基HSD测试。*
P< 0.05和控制;#
P< 0.05和摘要细胞。
另一方面,100年治疗
μM EGCG诱导细胞周期进程的恢复接近正常水平。特别是,在G细胞的数量被逮捕0/ G1阶段显著(
P
<
0.05
)低的细胞治疗与EGCG在100年
μD m细胞周期蛋白是一种蛋白质,有助于早期的G1阶段和G1由绑定到和CDK6 [/ S过渡
19],其表达在细胞激动素处理通过年末或硒增加比未经处理的细胞中表达(
26]。到缺陷和CDK6活动,造成下降到蛋白质水平和CDK抑制剂p21和p16的表达增加,负责细胞衰老(
29日]。因此,人类成纤维细胞与报废p21绕过复制衰老和成为不灭的
30.]。前后细胞周期的进展hac EGCG治疗显示了类似的模式,在HDFs(表
2(c))。然而,精确的EGCG这种影响机制仍未被阐明。
3.4。EGCG对Sirt1的影响和乙酰化p53表达的连续通道和H <子> < /订阅> O <子> 2 < /订阅>治疗HDFs
p53、肿瘤抑制蛋白可以诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡等对压力的反应信号的DNA损伤和活性氧(ROS) (
31日]。据报道,p53乙酰化作用,促进细胞衰老,可以由Sirt1,人类的酵母SIR2,同族体寿命调节蛋白(
32]。完善,减少食物摄入量(卡路里限制)扩展了范围广泛的物种的寿命(
33- - - - - -
35]。蛋白质参与这个寿命扩展Sirt1,一种属于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的酶(NAD)+端依赖蛋白去乙酰酶抑制剂。众位调节基因沉默、DNA修复rDNA重组,和老龄化,除了调节细胞程序性死亡(
35]。此外,它已经表明,神经元在神经退行性疾病救了Sirt1的过度表达,诱导通过热量限制或政府的白藜芦醇(
36,
37]。描述潜在机制参与EGCG的衰老预防活动,Sirt1等蛋白质的表达水平,乙酰化p53和p53在HDFs串行通道没有或EGCG的存在被免疫印迹分析(图检查
3)。Sirt1表达式PN增加30略有下降,而EGCG保持其表达水平在某种程度上甚至在30个段落。相反,乙酰化p53和p53的表达水平显著提高串行通道30后,当他们大大减少了EGCG治疗。我们可以得到一些有意义的结果的抑制作用EGCG的乙酰化p53表达连续通过RVSMCs HDFs一样,但不是在工厂(数据没有显示)。这些发现可能部分解释的事实,hac最敏感的EGCG在这项研究中使用的主要细胞(表
1)。一般来说,关节软骨细胞表现出一种与年龄相关的增殖和合成能力下降,同时保持的能力产生促炎介质和基质降解酶(
38]。虽然复制衰老与串行通道hac有助于倾向失去分裂能力,其功能可能会恶化之前达到细胞周期阻滞,包括异常蛋白质合成、改变生长因子响应,和更长的人口翻倍(
39]。
EGCG对Sirt1的影响、乙酰化p53和p53表达连续通过HDFs。治疗后与100年
μM EGCG, Sirt1的表达水平,乙酰化p53, p53 (a)节中描述西方墨点法测定
2。从代表实验结果被微规范化GAPDH表达式。定量的结果(b)如下所示。所有变量在三个独立的文化对于每一个实验,测试是重复两次独立(
n
=
6
)。结果报告为均值±SD和分析由图基HSD测试。
P
*
<
0
。
05年
和参与细胞5 PN;
P
#
<
0
。
05年
30 PN和参与细胞。
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这些结果与EGCG对Sirt1的表达变化的影响,乙酰化p53、p21 HDFs处理150
μM H2O2(图
4)。一些报告已经表明,H2O2治疗诱发细胞衰老通过改变细胞内ROS (
40,
41]。Sirt1的表达几乎没有改变,尽管H2O2治疗。然而,乙酰化p53、p21的表达,这是一个转录p53的目标,明显(
P
<
0.05
)增加了H2O2治疗。H2O2积累了加速细胞衰老的乙酰化p53通过减少由NAD sirt1的功能+损耗(
35]。另一方面,H2O2全身的p53乙酰化和p21表达下降了EGCG治疗。据报道,p16的表达,p21, p27和p53在初级细胞激动素和硒等抗衰老的药物是治疗显著降低(
25]。认为Sirt1可能允许胞内蛋白的氧化应激损伤的修复(
42]。这种可能性是由EGCG可以部分解释部分保持Sirt1的活动,与此同时刺激p53乙酰化作用。
EGCG对Sirt1的影响、乙酰化p53、p21表达H2O2对待HDFs。治疗后与100年
μM EGCG, Sirt1的表达水平,乙酰化p53、p21 (a)节中描述西方墨点法测定
2。从代表实验结果被微规范化GAPDH表达式。定量的结果(b)如下所示。所有变量在三个独立的文化对于每一个实验,测试是重复两次独立(
n
=
6
)。结果报告为均值±SD和分析由图基HSD测试。
P
*
<
0
。
05年
和参与细胞5 PN;
P
#
<
0
。
05年
30 PN和参与细胞。
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3.5。微分的整合模式FITC-EGCG增殖与衰老HDFs
比较EGCG的内化到细胞质和它的进一步增殖核易位(PN 5) HDFs与衰老30 (PN)同行,荧光显微镜进行细胞治疗的100年
μM FITC-EGCG。虽然细胞反应FITC-EGCG及其模式绑定到膜受体将不同于EGCG, FITC-EGCG被认为主要是在增殖细胞的细胞质中,但不是在细胞核(图8 h后治疗
5(一个))。相比之下,FITC-EGCG是完全分布式的衰老细胞内包括细胞质和细胞核(图
5 (b))。这种整合模式的FITC-EGCG衰老细胞几乎是类似于l - 929成纤维细胞的细胞系(
23]。
增殖的荧光显微照片(PN 5) (a)和衰老(PN 30) (b) HDFs处理100
μM FITC-EGCG 8 h。显微图(放大、×250)在这个图得到荧光显微镜和代表六个独立的实验也得到了类似的结果。的星号(a)和(b)的专家表明细胞核。所有照片所示(原始放大,×250)这个数字代表六个独立实验相似的结果。
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这些结果更加证实了共焦显微镜下进行相同的条件下荧光显微镜。FITC-EGCG观察吸附到膜增殖HDFs的合并在细胞质中,尤其是强烈的亮绿色荧光(图
6(一))。高倍镜下,FITC-EGCG显然是发现部分易位到细胞核,绑定到endosome-like结构。这种核转位模式的FITC-EGCG增殖细胞在衰老细胞完全不同,这被认为是一个重要的贡献者EGCG的微分反应扩散和衰老细胞。衰老细胞的共焦显微图显示,FITC-EGCG广泛分布在细胞质和细胞核(图
6 (b))。此外,衰老细胞受到的核易位FITC-EGCG与正常细胞经历细胞凋亡(
21)和人类纤维肉瘤(ht - 1080)细胞(HDFs的癌症同行)
31日]。虽然EGCG整合到细胞的确切机制尚未完全阐明,一些证据表明,EGCG可以绑定到膜和内化到癌症细胞的细胞质和细胞核中冲和HT-29等细胞治疗(3H] EGCG [
43,
44]。这些定量结果使用[3H] EGCG同意与我们的定性结果表明FITC-EGCG被纳入增殖细胞的细胞质和衰老同行。然而,增殖细胞的核易位FITC-EGCG模式完全不同于衰老细胞。转移相关的另一项研究显示,表达67 kDa层粘连蛋白受体可能赋予EGCG响应性癌细胞,这表明酸酯EGCG的一部分可能是受体结合和后续活动的关键(
45]。这些结果暗示FITC-EGCG可以整合到细胞的细胞质,无论增殖和衰老,通过绑定到特定的受体,形成复合物,而它可能是不同易位到细胞核增殖与衰老细胞。
微分的细胞吸收FITC-EGCG增殖(PN 5) (a)与衰老(PN 30) (b) HDFs。细胞与100年孵化
μM FITC-EGCG 8 h,然后共焦激光扫描显微镜下观察。此图所示的显微图代表六个独立的实验中,显示出类似的结果(原始放大:500年和2000××((a)和(b),职责,))。箭头在图表明endosome-like结构,FITC-EGCG开往易位到细胞核。
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总之,我们发现EGCG在100
μ米,这可能难以实现通过饮食,可以防止串行通道——H2O2通过显著抑制全身衰老在HDFs p53乙酰化作用而不影响Sirt1活动以及显示EGCG的微分细胞反应和吸收的EGCG在HDFs增殖与衰老模式。从这些结果,建议EGCG可能利用工艺发展的策略一个抗衰老的或age-delaying代理。虽然EGCG的浓度保持在等离子体后口服和腹腔内治疗可能远低于这里使用(
46),这样的预防EGCG对细胞衰老的影响可以发生在相对较高的水平。因此,对未来的研究方向包括生理相关性的调查研究结果关系的正常消费绿茶,EGCG代谢物的药代动力学和角色,EGCG的潜在合作与其他抗氧化剂或药物。