在华裔背景的台湾人群中产生含有线粒体单倍型群的Cybrids：一项广泛的研究体外线粒体基因组变异研究工具

摘要

线粒体DNA（MTDNA）Haplogroups可能有助于衰老相关疾病的发展。一个可靠的体外研究线粒体DNA单倍体群生理意义的细胞系统是必不可少的。本研究旨在构建并鉴定一系列含有来自健康台湾志愿者的变异mtDNA单倍体的cybrid细胞系。制备了含有不同线粒体DNA单倍型群的Cybrid细胞，如B4a、B4b、B4c、B4d、B5、R、F1a、F2、D4e、D4a、D5b、D5a、E、M8、C和N9a。Luminex 1000和全长mtDNA测序用于确认传代软骨细胞杂种的mtDNA单倍型组与其原始供体相同。与F1a、B5、D5a、D4a和N9a相比，Cybrid B4b的耗氧率显著降低，线粒体膜电位较高，但对H₂O₂诱导氧化应激而不是胞胎F1a，d4a和n9a。樱桃糖N9A具有更好的氧气消耗和H.₂O₂- 与B4B，F1A，B5，D5A和D4A相比的呼吸活力。已经开发出一系列糖细胞，涉及台湾人口主要的Haplogroups与族裔中国背景的群体体外.有了这个线粒体DNA单倍体群体，可以更好地理解与衰老相关疾病的潜在机制，并加速治疗干预。

1.介绍

双膜结构和具有自身转录、翻译和蛋白质组装系统的圆形线粒体基因组支持线粒体的内共生起源[1]．大多数线粒体蛋白质是由核DNA编码并导入细胞器的，而13种蛋白质是由线粒体DNA编码的。人类线粒体DNA (mtDNA)是一个16568 bp的环状双链DNA分子，编码线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)机制的13个多肽成分，2个核糖体RNA分子和一组22个转移RNA分子[1- - - - - -4]．超过99％的线粒体蛋白由核基因组编码，在细胞质核糖体上翻译，并选择性地进口到适当的线粒体室中[5]．

线粒体DNA由母系遗传，每个线粒体包含2-10个线粒体分子[6]．线粒体DNA具有非常高的突变率，并且当发生突变时，正常和突变线粒体DNA可以在同一细胞内共存，称为异质粒子[5，7]．线粒体DNA缺陷与一系列被称为线粒体脑肌病的疾病有关。在过去的二十年中，已有超过100种mtDNA病理缺陷的特征，其中许多是由于总体结构重排(例如，单个或多个缺失或重复)或来自mtDNA的点突变[7- - - - - -9]．癌细胞中mtDNA的大规模缺失表明，线粒体基因组的缺失可以改变细胞行为，类似于与核基因组的交叉对话[10.]．

对人类mtDNA的系统地理学研究表明，mtDNA谱系与土著群体的地理起源之间存在显著的相关性。区域mtDNA谱系是一组相关的个体mtDNA序列(单倍型)，称为单倍群[11.]．独特的共同单核苷酸多态性定义了从相同祖先进化而来的mtDNA群(mtDNA单倍群)[12.]．Cann等人。发现MTDNA演变起源于一个常见的非洲祖先，名为“线粒体前夕”[11.]．单倍群L1, L2和L3是非洲种群的特异性，而所有非非洲mtDNA单倍群都是从L3进化而来，属于M或N超进化支。欧洲居群属于九个单倍群(即H, I, J, K, T, U, V, W，和X)，来自N个超枝[13.]，而A、B、C、D和E单倍群只针对亚洲群体。

近年来mtDNA流行病学研究表明，mtDNA单倍群与多种表型有关。在日本和中国mtDNA单倍群与寿命之间存在显著的流行病学联系[14.- - - - - -16.]，神经变性[17.- - - - - -19.]精神科[20.，21.]，心血管[22.，23.和代谢疾病[24.，25.]．人类mtDNA变异与疾病之间的关联也有报道[26.- - - - - -28.]．

为了进一步证实线粒体DNA相关疾病的分子发病机制和筛选有效的治疗方法，复制疾病进展的最佳细胞模型是有价值的。携带相同核背景并携带变异mtDNA的cybrid模型可以排除核基因组的变异。在类似的核背景下，线粒体基因组的生理功能可以被复制体外，使流行病学观察得以验证。因此，需要一套完整的携带不同mtDNA单倍群的杂交细胞来专门研究mtDNA共同变异对线粒体功能的影响。本研究成功地从具有华人背景的台湾人群中培育出最常见的线粒体dna单倍群杂合体。

2.材料和方法

2．1.细胞培养和生成细胞

人143B骨肉瘤(BCRC 60439)(台湾生物资源收集和研究中心，中华民国)在添加了10%热灭活胎牛血清(生长培养基)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中，在37°C和5% CO中生长₂．将FBS在37°C解冻，然后加热到56°C 30分钟进行热灭活。生产和培养ρ⁰细胞所需的生长培养基中含有1 mM丙酮酸和50μg / ml尿苷（ρ⁰中等）支持增长[29.]．的ρ⁰通过在溴化乙锭（EtBr，50）存在下培养143B骨肉瘤细胞产生细胞 细胞每2-3天传代一次，并保持在50-70%的汇合处。

2.2。血小板的分离和输血ρ⁰细胞

健康的台湾志愿者捐赠了他们的外周血。所有这些都提供了根据“缴纳中心的机构审查委员会批准的议定书”的书面知情同意书。这些研究是根据赫尔辛基宣言的准则进行的，并通过了先前由Chomyn报告的方法[30.].简而言之，血小板被分离并与细胞融合ρ⁰聚乙二醇1500 (50% w/v) (Roche, Nutley, NJ, USA)。孵育24小时后，鲜ρ⁰介绍了媒介。使细胞恢复1周ρ⁰媒介，中等发生每2天。在恢复1周后ρ⁰培养基，将细胞置于1：2的基于DMEM的选择培养基中的96孔板上，由10％透析的FBS（Gemini）组成，其缺乏尿苷和丙酮酸。在10-14天后，筛选形成单一菌落的胞生群体并转移至35毫米的培养皿。随着持续的增长，将糖线糖转移至100mm培养物，以确保将核编码的线粒体蛋白掺入新引入的线粒体中。

2.3。MTDNA拷贝数分析ρ⁰和胞质杂种细胞

使用PUREGENE DNA纯化试剂盒(Qiagen, Chatsworth, CA, USA)从外周血白细胞中分离总DNA。将提取的DNA样品在−20°C下冷冻至检测，无需重复冻融循环。用实时荧光定量PCR法测定mtDNA的相对拷贝数，同时测定细胞核DNA进行校正。对与1号染色体基因组序列互补的核基因的正、反向引物。NT_004487.19)分别为5 ' -GGCTCTGTGAGGGATATAAAGACA-3 '和5 ' -CAAACCACCCGAGCAACTAATCT-3 '。与ND2基因序列互补的mtDNA正、反向引物。NC_012920.1)分别为5 ' -CACAGAAGCTGCCATCAAGTA-3 '和5 ' -CCGGAGAGTATATTGTTGAAGAG-3 '。采用LightCycler 480 Real-Time PCR系统(Roche Diagnostics;罗氏公司(F. Hoffmann-La Roche Ltd.)使用SYBR GREEN I PCR MASTER MIX(罗氏诊断;F. Hoffmann-La Roche Ltd.)。 The DNA (10 ng) was mixed with 10 μl Sybr Green I PCR主混合物含有400米酚的前向和反向引物的最终体积为20 μL. PCR条件为95℃10 min, 95℃变性15 s, 60℃退火20 s, 72℃引物延伸15 s，共40个循环。扩增产物在不同温度下变性和再退火，以检测其特定熔点。样本显示引物二聚体或非特异性片段被排除。

在相同的定量PCR运行中，测定染色体1序列和线粒体ND2基因的阈值循环次数（CT）值。每次测量至少进行三次，并在每个实验中归一化，用于对照DNA样品的连续稀释。在跑步之间和之间存在良好的再现性。对于ND2和染色体1，CT值变化的鼻内数分别为2.2％和3.8％。CT值用作输入拷贝数的量度，使用以下等式使用CT值差异来定量相对于染色体1的MTDNA拷贝数： 结果以mtDNA拷贝数/细胞表示。

２.４.有氧代谢

培养的细胞使用葡萄糖作为底物用于糖分分解以产生ATP。通过用培养基中的葡萄糖替换半乳糖，能量产生根据线粒体溶解糖溶解，取决于线粒体[31.，32.]．为了检查线粒体的有氧能力，在没有葡萄糖的情况下在含有10mM半乳糖和10％FBS的DMEM中生长细胞。

2.5.车辆的耗氧量分析和胞质杂种细胞

O的检测₂透过性细胞的消耗如前所述，经过一些修改[33.- - - - - -35.]．O₂通过克拉克电极（Mitocell S200微呼吸测定系统; Strathkelvin仪器，Motherwell，英国）监测消费。细胞（100. μl为5×10⁶ cells/mL) in KCl medium (100 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 20 mM HEPES，1 mM EDTA和5 mM KH₂宝₄;pH7.4）通过Digitonin透透透析（最佳浓度32.5 μ通过台盼蓝染色而确定的g / ml）并装入200 μL MT200呼吸计室，由室内的定速固态磁力搅拌器悬浮，并通过循环水浴保持在37°C。谷氨酸/苹果酸（10 mM）和琥珀酸盐（10 毫米），结合ADP（0.1 mM）作为底物，测试复合物I-和复合物II连接呼吸的功能。O的变化₂呼吸测定软件计算水平。用于控制录制，100 μL的缓冲液被注入腔内。

2.6。测量线粒体膜电位

细胞（5×10⁵)放置在6孔板上，并允许连接16-18小时，然后在100 nM TMRE (Sigma)中37°C孵育30分钟。然后用PBS洗涤两次，通过胰蛋白酶收获，并在500中重悬μl含有2％FBS的PBS。使用荧光激活的细胞扫描机（BD Biosciences Facscan系统）进行细胞流荧光分析。

2.7。细胞活力测定

细胞(8 × 10^3.在治疗之前，将在96孔板中接种到96孔板中。使用具有WST-8 [2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二硫苯基）-2-的细胞计数试剂盒8（WAKO）测定细胞存活。H- 辛唑鎓，单钠盐]作为底物。WST-8通过脱氢酶减少以形成与活细胞成比例的甲烷氮。在OD450的分光光度法测定甲藻量。

2.8。Western Blot.

细胞在RIPA裂解缓冲液（50%）中裂解 mM-Tris，pH值7.4；150 mM NaCl；1 mM PMSF（苯甲磺酰氟）；1 mM EDTA（乙二胺四乙酸）；1%Triton X-100；1%脱氧胆酸钠；0.1%十二烷基硫酸钠），添加蛋白酶抑制剂混合物（罗氏）和磷酸酶抑制剂混合物I（西格玛）。使用的抗体包括抗COX II抗体（Abcam）、过氧化物酶标记的抗兔IgG（H+L）二级抗体（Abcam）和抗-β-actin (Cell Signaling, Danvers, MA)。这些信号是由ECL plus (GE Healthcare Bio-Sciences AB，乌普萨拉，瑞典)使用x射线胶片开发的。

2.9。线粒体单倍群的基因分型

所选择的多晶型位点基于Nishigaki和Kong的作品[36.] （桌子1).静脉血（7 从每个受试者身上收集到含有50毫升的试管中 mmol/L EDTA（二钠盐）。使用商用试剂盒（美国加利福尼亚州查茨沃思市恰根）分离基因组DNA。为了扩增线粒体DNA片段，使用24对线粒体DNA引物，通过PCR使用前面描述的引物序列进行基因扩增[28.]．扩增子尺寸范围为190至300 bp。PCR扩增在最终反应体积为20 μ五十、 包含10个 ng人类基因组DNA，10 mM三氯化氢（pH值8.3），50 毫米KCl，1.5 mMgCl₂， 0.2 mM dNTP(即dATP、dTTP、dCTP和dGTP)， 0.5μ每个引物的m，和1个单位extaq.DNA聚合酶(Takara Bio Inc.)PCR条件如下:最初的变性步骤10分钟在94°C,紧随其后的是40周期在94°C的变性35 s,退火60°C 45 s在72°C 45 s和扩展,最终延长10分钟72°C和保持在25°C使用埃普多夫Mastercycler梯度。

PCR扩增后，用60个探针进行线粒体单倍群定义。用于单倍型的探针如前所述[28.]．简而言之，用乙二醇（EDC）在制造商的说明之后，在5'-末端修饰合成的寡核苷酸探针，并使用乙二氯（EDC）与羧化荧光微珠共价结合。将寡核苷酸标记的微珠（Oligobeads）混合在一起，使5000/5 μ用于杂交的低聚糖混合物。将5 ' -生物素标记的PCR扩增子与50个寡粒杂交μ96孔板中每孔加5μL的PCR扩增到40μL杂交缓冲液（3.75M TMAC，62.5mm TB [pH 8.0]，0.5mM EDTA和0.125％N-月桂酰肌氨酸）。该反应混合物在95℃下变性2小时 然后在55℃下杂交30分钟 使用Eppendorf Mastercycler渐变的最小值。

杂交后，用1×PBS（pH 7.5，含0.01%吐温20）洗涤寡聚珠，并在2200×g下离心2小时 将上清液丢弃（洗涤两次），并将造粒的寡聚物珠与70 μL等分试样的SA-PE（prozyme）的1000×稀释溶液。使用EPPendorf MasterCycler梯度，在52℃下用SA-PE标记杂交的扩增子15分钟。然后通过Luminex测量反应^100.流式细胞仪。

2.10。mtDNA全长序列测定

2.10.1。第一个PCR.

通过如前所述的引物对的对称PCR方法，将整个线粒体基因组扩增为六个片段，每长度约为3.0kb。28.].在最终反应体积为20的条件下进行PCR扩增 μL，含50 ng人类基因组DNA, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3)， 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂每个DNTP的0.2毫米浓度，1.0 μm浓度的每个底漆，1单位空斑形成单位DNA聚合酶（Takara Bio Inc.）。使用的PCR条件如下：初始变性步骤在94°C下进行5分钟 min，然后在94°C下进行40次变性循环15次 s、 在58℃下退火35分钟 s、 并在72°C下延长3小时 最小值，最后一次扩展为10 在72°C条件下，用1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增片段，并用溴化乙锭染色观察。

2.10.2。第二PCR

用于整个线粒体基因组的序列分析的第一PCR DNA模板被扩增为32个重叠段，每个段约为500-1100bp，如前所述[28.].在最终反应体积为20%的条件下进行PCR扩增 μL，含有200ng的第一PCR产物，10mM Tris-HCl（pH8.3），50mM KCl，1.5mM MgCl₂每个DNTP的0.2毫米浓度，1.0 μM每种底漆的浓度，以及0.5单位的空斑形成单位DNA聚合酶（Takara生物公司）。所使用的PCR条件与第一次PCR相同，只是所使用的退火温度为60°C。第二次PCR片段在1.5%琼脂糖凝胶上通过电泳进行分析，并通过溴化乙锭染色进行可视化。

2.11。序列分析和MTSNP识别

将第二份PCR模板和引物送到国立阳明大学测序中心基因组研究中心，利用Applied Biosystems进行测序。用于测序的引物如前所述[28.]．

3.结果

3.1。的产品ρ⁰143B骨肉瘤细胞

EtBr与双螺旋DNA结合，抑制复制。在一定浓度的EtBr浓度下，MtDNA比核DNA对EtBr更敏感。低剂量的EtBr用于长期暴露于完全耗尽的mtDNA，同时维持细胞生长。mtDNA的逆转ρ⁰在没有EtBr的情况下，细胞被报道通过延长培养时间最小化[37.]因此，EtBr暴露的持续时间不是更短[29.，38.]，143b细胞在EtBR中生长8周，以降低MTDNA逆转的可能性。为了获得稳定的克隆，进一步分离单个克隆。在没有ETBR的情况下检查MTDNA的逆转。

143b细胞的MTDNA在8周后降至0.93份复制/细胞（表2）.然而，在ETBR去除14天后，MTDNA逆转到亲本143b细胞的水平。通过分离单克隆消除了MTDNA逆转的可能性，并且16种孤立的克隆中的六种保持MTDNA;在ETBR提取50天后，每种细胞少于一个拷贝的水平。克隆没有。38在没有ETBR的情况下选择60天的培养物，以确认143B衍生的不可逆性ρ⁰细胞(表2）.的ρ⁰细胞在没有丙酮酸和尿苷的情况下在4周内死亡（数据未显示）。

3.2。呼吸酶复合物中线粒体氧消耗和缺陷的丧失

因为细胞色素的亚基2c氧化酶(COX2)为mtDNA编码，检测COX2ρ⁰细胞。免疫印迹显示出未检测到的COX2ρ⁰单元格（图1）.就氧气消费能力而言ρ⁰在谷氨酸/苹果酸盐和琥珀酸存在下监测的细胞，线粒体复合物I-和II连接的呼吸缺乏ρ⁰单元格（图3.）.

3.3。生产不同Haplogroups的糖线的生产来自人血小板线粒体

从健康志愿者中选择16个不同的单倍型组进行线粒体基因分型。来自16个已知线粒体DNA单倍型组的血小板与DNA融合ρ⁰单元格，然后是选择。所有的跨线粒体实验都有阴性对照组ρ⁰在没有人血小板的情况下，细胞经历了相同的融合过程。所有阴性对照细胞在选择后死亡，而与血小板融合的细胞存活（数据未显示），这表明融合成功，并且ρ⁰细胞无法恢复。

3.4。微粒呼吸功能和线粒体DNA含量逆转透射影融合后逆转

亲本143B、ρ⁰患人MTDNA的细胞和糖线糖表明耗尽的MTDNA含量ρ⁰细胞在线粒体间融合后发生逆转(图)2）.由于大多数细胞代谢依赖于正常线粒体，因此检查了糖的呼吸功能。父母143b细胞，ρ⁰细胞和含有B5单倍群的杂交种的耗氧量测定表明ρ⁰具有耗尽的MTDNA的细胞显示出呼吸功能的损失，而传输型融合成功恢复失去的呼吸（图3.）.

3.5.线粒体多态性产生的Cybrid与原始血小板供体具有相同的线粒体基因标记

为了验证16个Cybrid的线粒体DNA单倍型群，使用Luminex 1000重新检查多态性位点。所有16个Cybrid的线粒体DNA单倍型群与其原始供体相似（数据未显示）。为了进一步验证这些构建的Cybrid的线粒体DNA单倍体，对线粒体DNA进行了全长测序。线粒体DNA基因组中的非同义位点导致16个Cybrid中的氨基酸替换（表3.和4)，表现出遗传方面的特征和氨基酸的相应特征。

3.6。不同mtDNA单倍群的杂交种在耗氧能力和线粒体膜电位上存在差异

据报道，Haplogroups N9a和D4a对糖尿病进行保护性[24.，25.]促进长寿[14.]， 分别。Haplogroup B4是糖尿病易感，而HAPLOG组D4是糖尿病抗性[28.]．为了澄清这些单倍群之间的mtDNA遗传变异是否影响线粒体呼吸能力，我们检测了由这些单倍群组成的细胞系的细胞耗氧量。在复杂的I-和ii连接呼吸作用中，与混杂的单倍群B4b、F1a、B5和D5a相比，混杂的单倍群N9a和D4a的耗氧率显著更高(图)4(一)）.单倍群F1a、B5和D5a也表现出较高的O₂复杂i -链接呼吸的消耗率。

通过对这些杂交种线粒体膜电位的测定(ΔΨm)，与B5、D5a、D4a、N9a相比，B4b、F1a杂交种mtDNA单倍群的ΔΨm显著升高(图5)4 (b)）.这与前一份报告一致，即含氧耗材较高的糖线具有较低的线粒体膜电位[39.]．

3.7。含有不同的MTDNA HAPLOGroups的糖线表现出对氧化应激的鉴别耐受性

为了评估OXPHOS能力的差异是否影响细胞对氧化应激的耐受性，杂交细胞暴露于不同剂量的过氧化氢(H₂O₂)检查。在高H₂O₂与B4b相比，含有杂合体的mtDNA单倍群F1a、D4a和N9a具有显著的抗性和更高的细胞活力(图)5)，表明杂交种B4b对H₂O₂．值得注意的是，与B4b、F1a、B5、D5a和D4a相比，含有杂交种的mtDNA单倍群N9a在氧化应激下表现出更好的活力。

4.讨论

本研究利用具有代表性的具有不同mtDNA单倍群的台湾人群样本，阐明了构建杂交系的过程。研究进一步证明重组细胞的线粒体功能完整。的ρ⁰线粒体dna缺陷和O₂消费能力已从143B骨肉瘤细胞中成功构建。在从不同MTDNA Haplogroups的志书血小板供体捐赠的线粒体融合后，它们的缺陷线粒体功能恢复。生成和测试的重新编译的糖线系统地含有在台湾人群中确定的16个最常见的MTDNA Haplogroups。

先前已经记录了退行性疾病和MTDNA Haplogroups之间的关联。流行病学研究表明，某些MTDNA HaploGroups易于疾病产生，而其他HAPLOGOUPS是抗性的。虽然普遍接受MTDNA变体和疾病生成的关系，但一些研究临床疾病和HAPLOGROUP变异的研究仍存在争议。就MTDNA的16189 T转化变体及其与II型糖尿病的关联而言，已发表阳性和负面报告[27.]．因此，可靠和可重复的材料对于关于MTDNA Haplogroms对这些疾病发展的影响的研究至关重要。

大约二十年前，Attardi的集团展示了传输型糖线的构建，并为在同一核背景中携带MTDNA变化的细胞中研究线粒体功能的平台[29.]．从那时起，使用胞胎的研究表明了线粒体功能和遗传学对正常生理学的重要性。未发表的发现，此前提出，台湾窝藏出Haplogroup B4的糖尿病患病率较高，而那些覆盆子的人对帕金森病有抵抗力。涉及东亚受试者的其他研究还表明，某些Haplogroups表现出显性的生理性能，包括抗帕金森病的疾病[18.]．然而，到目前为止，还没有一套完整的混合细胞携带不同的mtDNA单倍群从一般台湾人口。因此，本研究创造了具有华人群体中最常见单倍型的杂交系，为未来的功能和力学研究提供了依据。

构建杂交细胞系的问题之一是逆转录ρ⁰细胞'mtDNA，导致父母mTDNA的污染。ETBR螯合可能扭曲双链DNA结构，并且广泛用于生产MTDNA或MTDNA贫化的细胞。适当的ETBR剂量螯合MTDNA对细胞核损伤的最小损伤是理想的，用于干扰MTDNA的复制过程而不影响细胞存活。很长期地接触Etbr可以产生稳定ρ⁰永久丧失mtDNA的细胞。这样，才能收获稳定ρ⁰细胞，一个适度的暴露期，然后分离单细胞克隆已被用于本研究。数据表明ρ⁰细胞必须是稳定的，以防止MTDNA逆转，因此确保后续糖的MTDNA一致性。通过遗传检测，翻译蛋白质评估和功能呼吸试验检查特征，以验证传导型融合的有效性。此外，已经通过多种探针重新确认了原始供体和糖的MTDNA Haplogroups的同一性，而全长测序进一步证明了糖的固化性。

Pello等人的研究报告了使用杂交模型的欧洲mtDNA单倍群的生理差异[40]以及Gómez Durán等人[39.]．因此，检测本研究产生的杂交体的线粒体呼吸功能是可行的。之前的一项工作已经确定了糖尿病易感组(单倍组B4)由10398A组成，糖尿病抵抗组(单倍组D4)由C5178A、A10398G和T152C组成[28.]．如预期的那样，患有携带10398A变体的MTDNA HAPLOGroup B4B的胞胎糖类更易于开发糖尿病，与其他常见的众多裔中国背景中的亚洲群体中的其他常见的Haplogroups相比具有显着较低的氧气消费能力（图4(一)）.与之前的临床遗传学研究一致，携带A10398G (B5)或与C5178A和A10398G (D4a和D5a)结合的特定mtDNA单倍群的杂交种比B4b的杂交种具有更好的耗氧能力(图)4(一))此外，具有N9a和D4a的cybrids的卓越耗氧能力也与Tanaka及其同事的研究结果一致，他们报告说D4a与更长的寿命有关，单倍体N9a和D5对代谢综合征具有抵抗力[14.，25.]．

ΔΨm值与氧消耗和细胞能量需求密切相关，是细胞代谢活动的关键指标。与以前的报告兼容[39.]，Δψm与与疾病条件（B4b）相关的糖线中的氧气消耗率的降低相反（图4 (b)）.这表明通过汤膦机械的有效能量产生与较少的Δψm相关，与对压力环境的细胞抗性相关。测试胞胎细胞系对H的细胞响应₂O₂诱导氧化应激，携带各种线粒体基因组背景的糖细胞具有响应ROS暴露而存在的存活率差异（图5）.与耗氧数据一致，含有Haplogroup N9A的缩大胞胎是最抵抗的H₂O₂引起的伤害。

总之，本研究产生了撒布式线，植物在台湾族背景中含有最常见的HAPLOG组。在这些常见的胞胎中，线粒体呼吸功能，膜电位和细胞生存率在这些常见的胞胎中也不同。这组胞胎细胞系可能对未来的研究有关常见人体MTDNA差异对疾病生成和进展的影响。

作者的贡献

博士。T.-K.林和H.-Y.林源于这项工作。

致谢

昌涌纪念医院的补助金（CMRPG87081-2; CMRPG891101-2）和国家科学委员会，台湾（NMRPG896131-2）的支持得到了支持的支持。作者感谢张涌医疗基金会高雄昌仁纪念医院组织银行（CLRPG8B0031）为技术支持，汉美·瓦德德尔·汉美研究所和审查和审查解决方案的英语编辑和校对服务。

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