人类143 b骨肉瘤(BCRC 60439)(生物资源收集和研究中心,台湾,中华民国)是生长在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)补充heat-inactivated 10%胎牛血清(生长培养基)37°C公司5%₂。的边后卫解冻在37°C,然后加热到56°C为30分钟热失活。生产和培养 ρ⁰细胞所需的生长培养基含有丙酮酸1毫米和50 μ克/毫升尿苷( ρ⁰介质)支持经济增长 29日]。的 ρ⁰细胞培养生产的143 b骨肉瘤细胞的溴化乙锭(EtBr 50 ng / mL) 8周。这些细胞被亚文化每2 - 3天,保持在50 - 70%的融合。

健康的台湾志愿者捐献外周血。他们提供书面知情同意按照协议为中心的机构审查委员会批准。研究进行了根据赫尔辛基宣言的原则和采用Chomyn[之前报道的方法 30.]。简单地说,血小板分离和融合 ρ⁰在存在聚乙二醇1500 50% (w / v)(美国新泽西州罗氏,新泽西州)。孵化24小时后,新鲜 ρ⁰中介绍了。细胞被允许恢复1周 ρ⁰介质,介质改变每2天。1星期后的复苏 ρ⁰介质,这些细胞被放置在一个96孔板1:2有限稀释DMEM-based选择介质由10%的透析的边后卫(双子)、缺乏尿苷和丙酮酸。10 - 14天之后,胞质杂种群体形成单一的殖民地筛选和转移到35毫米盘。持续增长,胞质杂种被转移到100毫米盘进一步20一代又一代的文化,以确保nuclear-encoded线粒体蛋白质被纳入新引入的线粒体。

总DNA分离外周血白细胞DNA使用PUREGENE净化设备(美国CA试剂盒,就是查)。提取的DNA样本被冻结在−20°C,直到没有反复冻融循环试验。相对mtDNA复制数字测量使用实时PCR和纠正的同时测量核DNA。核基因的正向和反向引物互补染色体1基因重叠群(加入。NT_004487.19) 5′-GGCTCTGTGAGGGATATAAAGACA-3′, 5′-CAAACCACCCGAGCAACTAATCT-3′。的正向和反向引物对mtDNA补充阐述基因的序列(加入。NC_012920.1) 5′-CACAGAAGCTGCCATCAAGTA-3′, 5′-CCGGAGAGTATATTGTTGAAGAG-3′。PCR是由LightCycler 480实时PCR系统(罗氏诊断;罗氏公司有限公司)使用SYBR绿色我PCR掌握混合(罗氏诊断;罗氏公司有限公司)。 The DNA (10 ng) was mixed with 10  μL SYBR绿色我PCR掌握混合包含400 nmol正向和反向引物在最后一卷20 μl . PCR条件10分钟在95°C,紧随其后的是40变性的周期为15秒95°C,退火60°C 20年代和引物延伸15秒的72°C。放大产品变性和再退火在不同的温度来检测他们的特定的熔点。样品显示引物调光器或非特定的片段被排除在外。

阈值周期数(Ct)的染色体1值序列和线粒体阐述基因测定在同一定量PCR为每个单独的运行。每个测量进行了至少三次和规范化在每个实验系列稀释控制DNA样本。内部和之间有良好的重现性。intraassay系数的变化阐述Ct值分别为2.2%和3.8%,染色体1,分别。Ct值被用作衡量输入拷贝数,被用来量化和Ct值差异mtDNA拷贝数相对于染色体1使用以下方程: (1) 2 × 2 Δ Ct , 在哪里 Δ Ct 是 的 Ct ( 染色体 1 ) - - - - - - Ct ( ND 2 ) , 在结果表示为mtDNA /单元的拷贝数。

培养细胞利用葡萄糖为糖酵解生成ATP基质。代替半乳糖与葡萄糖的培养基,能源生产分流的糖酵解根据线粒体氧化磷酸化( 31日, 32]。检查线粒体的有氧能力,细胞在DMEM包含10毫米半乳糖和10%的边后卫在缺乏葡萄糖。

检测啊₂消费permeabilized细胞与一些修改(如前所述 33- - - - - - 35]。O₂消费被克拉克监测电极(Mitocell售价微呼吸运动计量法系统;英国Strathkelvin仪器,就要像)。细胞(100 μ在5×10 L⁶细胞/毫升)氯化钾中(MgCl 100毫米氯化钾,3毫米₂,消息灵通的20毫米,1毫米EDTA, KH和5毫米₂阿宝₄;pH值7.4)被洋地黄皂苷permeabilized(最优浓度32.5 μg / mL由锥虫蓝染色)和加载到200 μL MT200呼吸器室,暂停定速固态电磁搅拌器内腔和维持在37°C循环水浴。谷氨酸/苹果酸琥珀酸(10毫米)和(10毫米),加上ADP(0.1毫米),被用作基板测试的功能复杂的I -和复杂II-linked呼吸。变化啊₂水平是由呼吸运动计量法计算软件。控制记录,100年 μL(缓冲室注入。

细胞(5×10⁵)被放置在six-well盘子和允许附加16 h,然后孵化100海里TMRE(σ)30分钟在37°C。他们然后用PBS洗两次,通过胰蛋白酶化收获,resuspended在500年 μ包含2%的边后卫L PBS。Cytofluorimetric进行了分析使用fluorescence-activated细胞扫描仪机(BD生物科学FACScan系统)。

细胞(8×10³)被播种到96 -孔板前24小时的治疗。细胞生存决定用细胞计数设备8和光)(kouichi WST-8 [2 - (2-methoxy-4-nitrophenyl) 3 - 5 (4-nitrophenyl) - 2 - (2, 4-disulfophenyl) H四唑、味精盐)为基质。WST-8降低了脱氢酶形成甲瓒正比于活细胞。甲瓒的数量被分光光度法在OD450化验。

细胞细胞溶解在里帕裂解缓冲(50毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值7.4;150毫米氯化钠;1毫米PMSF (phenylmethanesulfonyl氟化物);1毫米EDTA(乙二胺四乙酸);特里同x - 100 1%;1%的钠脱氧胆酸盐;0.1% SDS)外加蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏)和磷酸酶抑制剂(σ)。包括使用的抗体anti-COX第二抗体(Abcam) peroxidase-labeled anti-rabbit免疫球蛋白(H + L)二级抗体(Abcam)和反 β肌动蛋白(细胞信号,丹弗斯,MA)。信号是由ECL +(通用电气医疗集团生物科技AB,乌普萨拉,瑞典)使用x射线的电影。

选择的多态网站是基于Nishigaki的和香港的工作 36)(表 1)。静脉血(7毫升)收集从包含50更易与每个主题成管状/ L EDTA二钠盐。基因组DNA分离使用商业套装(美国CA试剂盒,就是查)。放大mtDNA片段,24双引物的线粒体DNA基因扩增的PCR引物序列使用前面描述的( 28]。扩增子的大小范围从190到300个基点。进行PCR扩增反应在最后一卷20 μL,包含10 ng人类基因组DNA, 10毫米Tris-HCl (pH值8.3),50 mM氯化钾,1.5毫米MgCl₂0.2毫米核苷酸(即。,dATP, dTTP, dCTP, and dGTP), 0.5  μM的底漆,1单位 ExTaqDNA聚合酶(豆类生物Inc .)。PCR条件如下:最初的变性步骤10分钟在94°C,紧随其后的是40周期在94°C的变性35 s,退火60°C 45 s在72°C 45 s和扩展,最终延长10分钟72°C和保持在25°C使用埃普多夫Mastercycler梯度。

PCR扩增后,60探针用于线粒体haplogroup定义。探讨了单体型如前所述[ 28]。简单,合成寡核苷酸探针被修改的5′端与终端阴离子集团和共价与羧酸盐荧光微用二氯乙烷(EDC),遵循制造商的指示。Oligonucleotide-labeled微(oligobeads)混合在一起做成一个5000/5 μL oligobead混合杂交。5′-biotin-labeled PCR扩增子杂化到oligobeads总量的50 μL在96孔板每增加5 μ40 L PCR扩增子的 μL杂交缓冲(3.75 M麦蒂,62.5毫米结核病(pH值8.0),0.5毫米EDTA,和0.125% N-lauroylsarcosine)。这个反应混合物在95°C变性了2分钟,然后55°C的杂化30分钟使用埃普多夫Mastercycler梯度。

杂交后,oligobeads洗了1×PBS (pH值7.5,包含0.01%渐变20)和离心机在2200×g 2分钟。浮在表面的丢弃(洗两次),与70年和颗粒状oligobeads反应 μL 1000×稀释溶液的整除SA-PE (Prozyme)。杂化的扩增子被贴上SA-PE 52°C 15分钟使用埃普多夫Mastercycler梯度。然后由Luminex反应测定^{One hundred.}流式细胞分析仪。

第二个PCR模板和引物被送到基因组研究中心国立阳明大学的测序中心,执行序列使用应用生物系统公司。使用的引物测序是如前所述 28]。

EtBr被绑定到双螺旋DNA和抑制复制。MtDNA比核DNA更容易EtBr表示EtBr浓度。低剂量的EtBr被用于长期接触完全耗尽mtDNA同时保持细胞的增长。mtDNA的降级 ρ⁰细胞在缺乏EtBr报道被长期培养[最小化 37]。因此,而不是短时间的EtBr接触( 29日, 38),143 b细胞生长在EtBr 8周减少mtDNA降级的可能性。为了获得稳定的克隆,克隆个体进一步孤立。降级mtDNA没有EtBr检查。

143 b细胞下降到0.93的mtDNA复制/细胞8周后(表 2)。然而,mtDNA逆转的父母143 b细胞EtBr切除后14天。mtDNA降级的可能性被孤立单一的克隆,消除和六16分离克隆mtDNA维护;每个细胞水平的不到一个副本EtBr撤军后50天。克隆没有。38被选为另一个60天的文化没有EtBr确认143年的不可逆性b-derived ρ⁰细胞(表 2)。的 ρ⁰细胞死亡在4周内没有丙酮酸和尿苷(数据没有显示)。

因为亚基2的细胞色素 c氧化酶(COX2) mtDNA编码,COX2检查 ρ⁰细胞。免疫印迹显示察觉COX2的 ρ⁰细胞(图 1)。耗氧量的能力 ρ⁰细胞,线粒体复合体I -和II-linked呼吸监测的谷氨酸/苹果酸和琥珀酸,分别是缺乏的 ρ⁰细胞(图 3)。

16个不同haplogroups选择健康志愿者的线粒体基因分型。血小板的16种已知mtDNA haplogroups融合 ρ⁰细胞,其次是选择。所有的transmitochondrial实验包含负对照组中 ρ⁰细胞经历了相同的融合过程缺乏人类血小板。所有的负控制细胞死亡后选择,而细胞融合与血小板(数据未显示),这表明融合成功,和mtDNA ρ⁰细胞无法恢复。

父母的143 b的mtDNA拷贝数, ρ⁰细胞和胞质杂种窝藏人mtDNA建议耗尽mtDNA内容 ρ⁰细胞被推翻后transmitochondrial融合(图 2)。因为大多数细胞新陈代谢依靠正常的线粒体,胞质杂种的呼吸功能检查。父母的143 b细胞, ρ⁰细胞,胞质杂种窝藏B5 haplogroup化验的耗氧率表示 ρ⁰细胞耗尽mtDNA证明呼吸功能丧失,而transmitochondrial融合成功恢复失去的呼吸(图 3)。

验证mtDNA haplogroup 16胞质杂种的多态性网站被Luminex 1000进行了复查。16个胞质杂种有类似mtDNA haplogroups原来的捐助者(数据未显示)。进一步验证mtDNA haplogroup这些构造的胞质杂种,全身mtDNA进行测序。mtDNA基因组中产生的网站导致16个氨基酸替换胞质杂种(表 3和 4),显示遗传方面的特征和相应的氨基酸的特点。

Haplogroups N9a和D4a被报道是预防糖尿病 24, 25和促进长寿 14),分别。Haplogroup B4糖尿病易感,而Haplogroup D4 diabetes-resistant [ 28]。澄清如果mtDNA基因变异在这些haplogroups影响线粒体呼吸能力,细胞耗氧率检查在从这些haplogroups创建细胞系。Cybrid-harboring mtDNA haplogroups N9a和D4a拥有较高的耗氧率相比Cybrid-harboring mtDNA haplogroups B4b, F1a, B5, D5a复杂的I -和II-linked呼吸(图 4(一))。此外,相比cybrid-harboring mtDNA haplogroup B4b, haplogroups F1a, B5, D5a也表现出更高的啊₂消费率在复杂我呼吸。

测定线粒体膜电位(ΔΨm)在这些胞质杂种,的ΔΨm cybrid-harboring mtDNA haplogroups B4b和F1a相比明显高于B5, D5a D4a, N9a(图 4 (b))。这是一致的与以前的报告,胞质杂种高耗氧率较低的线粒体膜电位( 39]。

评估OXPHOS能力的差异是否影响细胞耐氧化应激,胞质杂种细胞的生存能力受到各种剂量的过氧化氢(H₂O₂)检查。在高H₂O₂浓度,cybrids-harboring mtDNA haplogroups F1a、D4a N9a重大阻力和更高的细胞生存能力B4b相比(图 5),这表明胞质杂种B4b更敏感氧化应激引起的H₂O₂。值得注意的是,cybrid-harboring mtDNA haplogroup N9a展示优越的生存能力在氧化应激与B4b相比,F1a, B5, D5a, D4a。