文摘
据说虽然类黄酮可以防止心脏缺血再灌注损伤,不同的类黄酮的相对有效性和机制尚不清楚。我们比较由不同的类黄酮使用保护大鼠胚胎心室H9c2细胞受到模拟缺血再灌注(IR)和叔丁基氢过氧化物(t-buOOH)。IR模型的描述显示的相对贡献葡萄糖、血清和缺氧细胞死亡。与长期(2 - 3天)预处理前红外最好的保护是由儿茶素、儿茶素原花青素,抗坏血酸盐,保护剂量。槲皮素(34%)5保护μ米,但在高剂量细胞毒性。花青色素保护温和5到20 (10 - 15%)μ在5米,而花翠素没有影响μM和细胞毒性高剂量。比较长期由儿茶素和急性保护,需要更高浓度急性(1小时)预处理中获益。纯氧化应激(t-buOOH)只有槲皮素显著保护为期3天的预处理,在短期(1 h)环境保护最好的槲皮素和儿茶素。结果显示儿茶素作为红外光谱预处理剂,尤其有用,槲皮素和儿茶素可能是最保护严重氧化应激的情况下。
1。介绍
在心肌缺血和再灌注启动新陈代谢和离子干扰,主要是由于氧化应激,最终导致细胞死亡和组织坏死。尽管最近的概念提出了心肌细胞更新的一部分正常心脏内稳态(1),心肌细胞可能有增殖的能力有限。因此,减少缺血再灌注时细胞死亡是非常重要的在防止不可逆损伤。
茶多酚,尤其是黄酮类化合物也承认他们的抗氧化和氧化应激的保护作用的情况下2,3]。他们也被认为与细胞death-survival信号通路,这取决于剂量可能促进或抑制细胞凋亡,分别展示chemopreventive或cytoprotective效应(4,5]。
大量的证据表明类黄酮对心脏缺血再灌注损伤的保护作用(例如,综述Akhlaghi和传播6])。然而,在大多数研究单个类黄酮的保护作用已被调查。只有一个体外报告比较几类黄酮的影响从ischemia-reperfusion-induced两类细胞死亡(7]。
因此,当前的研究的一个目标使用培养的大鼠胚胎心室H9c2细胞,是比较更广泛的各种各样的类黄酮。在这项研究中,我们从黄酮醇类黄酮相比(儿茶素和原花青素),儿茶素没食子酸盐(儿茶素),黄酮醇(槲皮素),和花青素(花青色素,飞燕草色素类(图)1)。这种比较可以帮助区分哪些类型的类黄酮可能是最有效的防止缺血再灌注损伤。抗坏血酸盐在水果和蔬菜也比另一个因素,可以帮助保护(8]。
第二个目标是区分间接与直接影响(预处理)的影响。因为类黄酮可能产生间接的保护,例如,通过诱导阶段2和内源性抗氧化系统酶(9),我们比较短期(1小时)和长期(2 - 3天)接触氧化应激前。短期预处理是为了允许足够的时间对类黄酮直接进入细胞并提供抗氧化剂或其他影响在缺血和再灌注,但没有足够的时间预处理要求感应和合成蛋白质。长期的预处理还会允许这样的预处理。此外,评估不同的氧化刺激可能引发不同的信号级联10),我们将模拟缺血再灌注与细胞的接触叔丁基氢过氧化物(t-buOOH)。
2。材料和方法
2.1。材料
槲皮素,(+)儿茶酸,儿茶素没食子酸、咖啡酸、白藜芦醇和抗坏血酸钠是购自σ。花翠素和花青色素来自Extrasynthese SA (Genay Cedex,法国)。苯丙酸诺龙葡萄籽提取物原花青素(95%)来自加拿大营养有限公司
2.2。细胞培养
鼠胚胎心室细胞,H9c2(美国组织培养收集、马纳萨斯,弗吉尼亚州),在杜尔贝科修改鹰的培养介质包含1.5 g / L NaHCO (DMEM)3和1.0 g / L的葡萄糖,补充了10%胎牛血清的边后卫,100 U /毫升青霉素、链霉素和100 U /毫升。组织培养的玻璃瓶被保持在37°C在湿润的气氛中5%的有限公司2。媒介改变了每2 - 3天,细胞被定期亚文化。实验,细胞培养在96孔板,在DMEM 10%的边后卫直到confluency,然后转向DMEM和2%的边后卫。
2.3。类黄酮治疗
融合性的细胞治疗与不同浓度的类黄酮(二甲亚砜)不同时间课程前诱导缺血或与t-buOOH孵化。等离子体的浓度是那些能够达到急性或长期膳食补充剂(5 - 10μ米高)(11- - - - - -13)和supraphysiologic浓度,可以进行静脉注射或添加到cardioplegic解决方案的情况下,如冠状动脉搭桥手术或心脏移植。二甲亚砜浓度的DMEM保持等于或小于0.05% v / v。抗坏血酸盐的浓度通常是那些用于等离子体(~ 100μ米)和那些可以补充(250实现μ米)或静脉管理(14]。
2.4。缺血再灌注
诱导缺血,消除DMEM后,细胞被洗两次与磷酸盐(PBS)(140毫米氯化钠,氯化钾2.7毫米,8.1毫米Na2HPO4,1.5毫米KH2阿宝4100年,pH值7.3)和覆盖着μL ischemia-mimetic解决方案包含140毫米氯化钠,1.25毫米CaCl21毫米MgCl2氯化钾、8毫米,6毫米玫瑰,pH值6 (15]。缺血的解决方案都洋溢着100%氮气至少30分钟前增加了细胞。细胞被置于37°C模块化缺氧室,室是刷新与氮气的初始1.5 h的缺血和密封的其余部分缺血期。时间的冲洗(1.5小时)时选择根据初步实验室内的气氛与亚甲蓝氧指标进行了测试。建立了缺血5 h随后再灌注18 h。再灌注、缺血的解决方案是取代DMEM(2%的边后卫)含有300 mg / L NaHCO3和类黄酮(如果有的话),板被放置在同一室控制盘。在初步实验,我们认为300 mg / L NaHCO3足够让pH值在7.4 18小时再灌注期间室内空气(< 0.1%的公司2)。
细胞控制(非缺血型)组经历了同样的过程包括洗涤步骤,和DMEM换成新鲜的DMEM含有300 mg / L NaHCO3。控制盘保持在37°C调湿室包含整个实验环境空气。这些井控制面板中类黄酮治疗术治疗期间相同的实验。
2.5。治疗叔丁基氢过氧化物
在氢过氧化物的实验中,类黄酮治疗或抗坏血酸盐后,细胞与400年孵化μ米t-buOOH前24小时细胞生存能力评估。
2.6。5-Dimethyl-2-Thiazolyl MTT (3 - (4) 2, 5 -溴化Diphenyltetrazolium)试验
使用的方法是使用的方法的修改Denizot和朗16]。再灌注后,介质被和PBS的细胞被洗两次去除残留的类黄酮。然后,100年μL包含140毫米氯化钠溶液,1.25毫米CaCl21毫米MgCl2葡萄糖6毫米氯化钾10毫米,6毫米玫瑰,pH值7.4添加到每个好,和细胞孵化37°C最终浓度为0.5毫克/毫升MTT (PBS)。1 h后,解决办法是删除和紫色甲瓒晶体在100年可溶性μL二甲亚砜为15分钟,吸光度测定使用吸收分光光度计在570海里。
2.7。显微镜测定细胞的可行性
为了便于计算,这些细胞被孵化的最终浓度4μg / mL吖啶橙(PBS)添加到培养基(17]。1 h后,介质是吸气,PBS的细胞被洗了,100μL上述解决方案包含140毫米氯化钠,1.25毫米CaCl21毫米MgCl2葡萄糖6毫米氯化钾10毫米,6毫米玫瑰(pH值7.4)被添加到每个维持细胞存活,并使用荧光显微镜细胞被可视化。死亡的细胞在洗涤过程中被冲走,只活细胞在显微镜下观察到的细胞。从每个与一个特定的区域选择10倍的放大成像。
2.8。Glyceraldehyde-3-Phosphate脱氢酶(GAPDH)
的活性细胞死亡的GAPDH是作为指标。GAPDH释放到媒介的活动用aCella-TOX测量工具根据制造商的指示。
2.9。统计数据
数据代表±SEM手段。与SPSS统计分析软件使用单向方差分析(方差分析)。事后考验,双向Dunnett是用来比较治疗与非缺血型(命名为控制图)或控制ischemic-reperfused控制(命名为红外图)。在nonischemia条件,类黄酮治疗与nonischemia控制相比,在缺血再灌注条件下,flavonoid-treated组与红外控制。一个值小于0.05被认为是显著的。
3所示。结果
3.1。缺血再灌注实验
细胞死亡发生在这个模型中由于缺氧,除血清葡萄糖剥夺(图2)。所有这些因素导致细胞死亡,缺乏氧气占了34% (100(先生/−I / R) /(控制−I / R)),缺乏葡萄糖占了24% (100(高铁/−I / R) /(控制−I / R)),以及缺乏的边后卫占了42%(剩余的细胞死亡的比例)。
为期三天的预处理与不同浓度的黄酮类化合物槲皮素显示很少或根本没有保护,花青色素,或花翠素(图3儿茶素(图)和显著的保护3)。浓度的5到50μ21 M儿茶素细胞生存能力提高了58%,而花青色素给重要的温和保护5到20 (10 - 15%)μM。
因为儿茶素给了最强的保护,我们进行了更多的试验比较不同儿茶素(儿茶素和proanthocyanidin混合物)(图4)。比如儿茶素浓度的5到100μ儿茶素和原花青素也给28日至49岁和22 44%保护,分别在某些浓度显著(图4)。
预处理的长度是否有效地保护观察,儿茶素测试在短期(1 h)和长期(2 - 3天)预处理。而在长期(2 - 3天)应用程序的儿茶素浓度低至5到10μM展出近50%(数据保护4和5)、短期(1 h)预处理50μM儿茶素细胞生存能力提高了98%,而10μM儿茶素(图显示无意义的保护5)。
抗坏血酸钠也给了重要的保护(57 - 92%)浓度测试(图6)。
3.2。氢过氧化物的实验
调查任何保护缺血再灌注和纯氧化应激之间的差异,进行了实验t-buOOH。3天的细胞进行预处理的浓度为25μM类黄酮。除了槲皮素可以表现出46%防止细胞死亡所致t-buOOH,没有其他的化合物保护细胞浓度和时间的处理(图7)。相反,有些化合物,花青色素,花翠素、儿茶素和原花青素恶化细胞毒性的存在t为期3天的预处理后-buOOH。短期(1 h)预处理但是没有产生细胞毒性即使更高浓度的黄酮类化合物(图7)。短期孵化,儿茶素给cytoprotection(66%)而非细胞毒性,这与槲皮素是唯一化合物抑制t-buOOH-induced细胞死亡,细胞存活率增加(图66和95%7)。
儿茶素和槲皮素的保护作用H9c2细胞t-buOOH确认检测介质时释放glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(图8)。
随着短期暴露于儿茶素保护缺血再灌注模型中更高浓度(图5),但不保护在25岁μ米的t-buOOH实验(图7),一个实验进行了使用不同浓度的比较儿茶素和表儿茶素没食子酸盐。儿茶素确实显示显著的保护t-buOOH但只有100μM(图9)。儿茶素没食子酸盐表现出更强的保护和保护明显在50岁μ米和100μM(图9)。
4所示。讨论
缺血再灌注的研究的主要目的是比较类黄酮的保护作用与缺血再灌注引起的细胞死亡。一个体外缺血再灌注模型15)被用来模拟体内的情况。评估这个模型(图的组件2)表明,死亡的H9c2细胞发生由于血清、组织缺氧,葡萄糖剥夺。细胞死亡的过程引起的血清消除报道涉及线粒体功能障碍(18),导致增加活性氧的生产(18,19]。因此,高达76%的死亡发生后的边后卫和缺氧可能是在某些方面相关的氧化应激,剩下的24%来自葡萄糖剥夺(能量)。此外,血清去除引起Ca的释放2 +从内质网20.),导致细胞Ca2 +过载,缺血再灌注(突出的后果之一21]。因此,血清活性氧withdrawal-induced变化和细胞Ca2 +像那些发生在在活的有机体内缺血再灌注条件。有趣的是,单独缺氧复氧(无血清和葡萄糖剥夺)并没有减少细胞数量(最后一个条形图2)。然而,这并不意味着没有细胞死亡发生在这一组,作为细胞凋亡和细胞增殖受到缺氧复氧(据报道,被刺激22]。
在测试的类黄酮,那些catechin-type结构(儿茶酸,儿茶素和原花青素)抑制模拟缺血再灌注引起的细胞死亡。值得注意的是,3天的儿茶素在场缺血再灌注之前,允许感应等适应阶段2和抗氧化剂酶如前所观察到的23,24),以及缺血和再灌注期间,允许直接的抗氧化效果。这些结果支持先前发现的保护由儿茶素在体外和体内缺血再灌注模型25- - - - - -29日]。它也被报道,儿茶素可以抑制血清诱导细胞凋亡清除在培养的神经元30.),表明这类黄酮能抑制至少该组件在培养细胞缺血再灌注损伤。
有趣的是,在缺血再灌注前长期接触剂量反应测量没有显示浓度因素(至少5以上μ米)在保护展出的儿茶素(图4)。相比之下,50μ米而不是10μM儿茶素能保护细胞短期预处理(图5),这表明高水平所需的直接抗氧化效果。似乎,直接抗氧化作用是剂量依赖在这个范围内,因为抗氧化活性物种竞争与蜂窝组件。自适应保护由于长期接触反应可能通过诱导抗氧化酶被放大,从而发生水平较低的类黄酮。已经5点最大的保护μM与长期预曝光表明间接自适应主导在这种情况下的反应。
槲皮素和花青素(花青色素)的两个检查显示保护在一个相对较低的剂量(5μM)对缺血再灌注与长期暴露,但在更高浓度槲皮素(和飞燕草色素)表现出细胞毒性控制(数据未显示)和红外条件。槲皮素(31日,32和花青素33- - - - - -35)曾被报道在缺血-再灌注模型提供保护。然而在当前的研究中,他们并不是那么有效儿茶素、槲皮素和飞燕草色素特别是他们显示没有缺血再灌注细胞毒性的潜力。
抗坏血酸盐还显示强大的保护缺血再灌注与长期暴露在这个模型。这个保护的一部分可能是通过举,如抗坏血酸盐氧化在细胞培养基生产H2O2(36),从而可能在培养细胞诱导抗氧化酶。这个结果与抗坏血酸盐在当前模型与先前的研究一致的保护,抗坏血酸盐对其他类型的体外缺血再灌注(37和体内38,39]。
在缺血再灌注模型,我们测试了儿茶素显示保护在短期以及长期的预处理。低浓度(即。,10μ米)儿茶素保护如果剩下的细胞长期预培养时间(的范围),而更高浓度(即。,50μ米)是需要保护和短期(1 h)预处理。的原因在短期内保护预处理可以直接儿茶素的抗氧化作用。在长期环境激素的大部分儿茶素可能是氧化在正常细胞代谢和由于过渡金属等因素出现在介质(36),从而可以提供举。这些结果符合的Chang et al。725)保护的小鸡胚胎心肌细胞μM儿茶素或原花青素B2更有效与长期(72小时)预处理比在缺血和再灌注治疗。
如果没有多少儿茶素的抗氧化活性仍2-3-day预处理后,为什么保护观察?一种可能性是,氧化生成形式的儿茶素在长期预处理激活特定信号通路参与诱导内源性抗氧化剂(40]。符合这一假设,Du et al。23)发现,24小时孵化的H9c2与50 - 100细胞μM(但不是25μ米)儿茶素或proanthocyanidin B4增加内源性细胞抗氧化剂谷胱甘肽和抗氧化酶活动(超氧化物歧化酶、谷胱甘肽S-transferase和过氧化氢酶)和减轻细胞死亡引起的黄嘌呤氧化酶系统[23]。符合这样一个举效应,我们观察到,喂老鼠绿茶儿茶素10天前对孤立的心缺血再灌注保护了心从氧化细胞死亡以及保持相对较高水平的第二阶段酶活性(24]。
使用t-buOOH我们比较的程度不同的类黄酮对纯氧化应激的保护。在缺血再灌注模型中,与儿茶素保护长期治疗,短期治疗与儿茶素的浓度更高。然而,在t-buOOH-induced细胞死亡保护只是观察到与短期(1 h) pre-incubation儿茶素在长期(3天)预孵化与儿茶素或原花青素的细胞毒性加剧t-buOOH。这种矛盾可能与儿茶素的氧化产物,包括不稳定的二聚体醌类(41),并将积累在长期治疗。如果这样的产品成为细胞毒性反应t-buOOH可能的不利影响。槲皮素,而观察到的细胞生存能力显著改善缺血再灌注实验只在5μM,它显示最好的保护t-buOOH。这个结果表明,槲皮素可能是最有效直接的抗氧化剂,而儿茶素可能调用其他途径。
槲皮素相反,抗坏血酸盐防止缺血再灌注,但不反对t-buOOH。一个可能的解释缺乏保护的抗坏血酸盐t-buOOH是抗坏血酸盐会导致有机氢过氧化物的分解细胞毒性物种(42]。这种多样化的行为由类黄酮或抗坏血酸盐在不同条件下的氧化应激表明类黄酮和一般抗氧化剂可能目标扩大数量的细胞内的信号通路。不同的刺激可能会接触不同的信号通路。类黄酮的化学结构不同,他们可能都有不同的交互与这些信号通路。如果由于其结构一些黄酮类化合物的工作在广泛的信号通路,然后他们可能有能力显示更广泛的生物属性。在我们的研究中这样的观察能力与儿茶素显示对缺血再灌注和有效t-buOOH(尽管后者只有短期预处理)。儿茶素和原花青素也有助于减轻缺血再灌注损伤,但未能保护以及儿茶素苯邻二酚环很可能可以提供保护缺血再灌注,而没食子酸打击一部分是重要的t-buOOH。黄酮类化合物广泛存在于自然界中或可以合成可能膨胀能力。此外,它总是可以从cotreatments中获益。例如,一个可能实现更好的保护在共同服用槲皮素与儿茶素在不确定条件下的压力,特别是在体内细胞的情况下暴露在各种氧化剂和压力刺激。
总之,结果支持的可能性,儿茶素,呈现丰富的茶和种子,有能力充当举个代理来帮助保护心脏细胞免受缺血再灌注损伤。这样的举效应可以发生在相对较低的浓度,而更高的水平,这可能是难以实现通过饮食,需要直接的抗氧化效果。在严重情况下的氧化应激槲皮素和儿茶素是最强有力的抗氧化剂类黄酮中测试。对未来的研究方向包括调查机制,类黄酮代谢产物的作用和潜在合作与其他不同的类黄酮,抗氧化剂。
确认
这项工作是由药学院和营养支持,加拿大卫生研究院的研究(CIHR),以及自然科学和工程研究理事会(NSERC)。m . Akhlaghi的博士奖学金支持伊朗卫生部和医学教育。