活性氧形成和细胞凋亡在人类外周血单核细胞诱导900 MHz手机辐射

文摘

我们表明,活性氧(ROS)在细胞凋亡过程中起着重要的作用在人类外周血单核细胞(PBMC)诱导的900 MHz射频电磁场的辐射(RFEMF)在一个特定吸收率(SAR)~0.4 W / kg时暴露持续时间超过两个小时。通过线粒体途径诱导细胞凋亡和由激活ROS和caspase-3和降低线粒体的潜力。ROS的激活是构造扰动引发的脂质、蛋白质和DNA诱导GSM RFEMF暴露的。尽管人类PBMC发现释放类胡萝卜素的一种自我保护机制,以应对氧化应激减少ROS的进一步增加,抗氧化防御系统之间的不平衡和活性氧的形成仍然导致细胞死亡的增加曝光时间和可能导致约37%的人PBMC死亡八小时。

1。介绍

手机被广泛应用于电信和医学遥测系统。巨大的移动电话的使用大大增加了大量的射频电磁场(GSM RFEMF)暴露在我们的日常生活中。确保通信在任何地方,各种各样的手机中继站或设备需要放置在或接近生活/工作和居民区。它使人们有可能暴露在RFEMF辐射几乎每一刻。因此有一个主要担忧RFEMF辐射对人体健康的影响。尽管之前的研究,我们的知识在这些影响仍不足和强有力的辩论继续1- - - - - -5]。

GSM RFEMF暴露在各种健康的影响,形成的活性氧(ROS)和氧化应激增加这些拟议的机制可以解释RFEMF辐射之间的关系和可能对人体健康有害的影响。发现RFEMF可以诱导活性氧的形成在动物的大脑,大脑皮层神经元,脾脏,血清,和人类的精液6- - - - - -10]。本研究的目的是调查的程度ROS形成和氧化引起的DNA损伤以及细胞凋亡RFEMF人类外周血单核细胞(PBMC)。PBMC细胞是免疫系统中的一个关键组件抗感染和适应入侵者。他们也扮演重要的角色在神经退行性疾病和衰老11- - - - - -14]。因此,调查是否和如何氧化应激激活在PBMC RFEMF辐射的暴露可以帮助进一步澄清其对人类健康的影响。

在这项研究中,孤立的新鲜人外周血单核细胞暴露于辐射的900 MHz GSM RFEMF在特定吸收率(SAR) 0.4 W / kg 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h。选择特定的吸收速率模拟情况,人们通常在一个环境可能吸收20米的距离内手机中继站,职场或是在微波通信的设备间,或围绕一个监视雷达(15- - - - - -17]。它也提出的职业暴露限制国际非电离辐射防护委员会和一些国家辐射防护委员会18,19]。

检测细胞内ROS在暴露的细胞,激活荧光染料DCFH用作探针在流式细胞术。caspase-3活动的细胞进行比色测定,而细胞凋亡进行了分析通过流式细胞术FITC-Annexin V / Propidium碘(PI)双重染色。评估人类PBMC的DNA损伤和揭示的机制RFEMF辐射的影响,共焦拉曼显微镜也使用。

2。材料和方法

2.1。样品和试剂

研究血液的志愿者(提供通知书面同意)证明了暨南大学动物保健和使用委员会符合中国警方对人体保健和公共卫生服务使用实验动物。

正常外周血获得健康不吸烟的成年志愿者老化静脉穿刺和涌入肝素化管。血液样本实际上与肝素锂。离心后,外周血单核细胞在云层,反复洗两次,然后re-suspended。细胞存活率> 98%台盼蓝染色法估计。

膜联蛋白V /πdouble-staining本德公司的设备购买,美国。荧光染料DAPI来自罗氏,美国。线粒体膜电位检测设备(JC-1)、活性氧检测装备,布拉德福德蛋白质浓度测定装备,和caspase-3比色测定装备都购自Beyotime生物技术研究所、中国。

2.2。接触人类的PBMC RFEMF样本

PBMC样本细胞密度为1.5×10⁶/ L是放置在每个文化板块。然后他们被暴露在辐射VS401A射频RFEMF发射器(深圳Weikete科技公司、有限公司、中国)在一个特定的吸收速率的0.43 W / kg 37°C 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h。辐射分布在样品均匀和SAR决心使用PBMC样品的导电率RFEMF电场强度在确定点,样品的质量密度在以下形式:。在这个实验中,被发现(S / m),43.42 (V / m),是(g / mL)。因此,特区是估计为0.43 W / kg。

2.3。细胞凋亡检测

FITC-Annexin V和被添加到细胞悬液与细胞的浓度/毫升。孕育了混合物在室温下15分钟在黑暗。然后用绑定缓冲他们洗两次,再次调整细胞浓度/毫升。使用流式细胞仪分析了细胞凋亡咏叹调流式细胞仪(美国BD公司)在1小时内。

2.4。活性氧的检测

接触细胞收集和上层清液被离心分离去除。此后,resuspended和细胞细胞被收集。他们再次离心去除上层清液,然后添加到稀释DCFH-DA。混合物是孵化20分钟37°C,然后洗两次。样本后1小时内与流式细胞分析仪分析。一个基于“增大化现实”技术⁺与488 nm波长激光作为激发光波长525纳米是接收获得荧光细胞的比例。

2.5。Caspace-3活动检测

caspace-3活动暴露的细胞是评估使用caspase-3比色测定装备和评估执行根据制造商的建议。样品的OD值的比值与对照组被送往评估caspase-3活动。

2.6。线粒体膜电位测定

接触细胞resuspended和混合JC-1染色工作的解决方案。混合物在37°C孵化20分钟,然后离心3 - 4分钟,除去浮层。缓冲溶液的混合物被洗了两次,然后细胞resuspended缓冲溶液。细胞的荧光成像使用尼康TE300倒置荧光显微镜。

2.7。通过拉曼光谱DNA损伤检测

PBMC的拉曼光谱是由司法院RAM发票记录系统使用514.2 nm励磁线从一个基于“增大化现实”技术⁺离子激光器通过反向奥林巴斯光学显微镜与×60目的。收购乐队600 ~ 1800厘米⁻¹光谱分辨率为1厘米⁻¹。至少35细胞测定每组暴露PBMC的样本。

2.8。数据处理

PBMC细胞从血液样本6志愿者(3男性和女性)。每个样本包含10000个细胞。所有数据均来自五个平行样品的结果;每个样本检测三次。最终结果是用。使用SPSS 13.0统计分析的数据,在这被认为是明显不同的。

3所示。结果

3.1。活性氧激活

人类的流仪结果PBMCs活性氧激活如图1。图1(一)表明ROS-positive细胞的直方图,图1 (b)显示了直方图均值的DCF荧光强度(ROS水平的指示)。图2显示了ROS-positive细胞ROS水平随辐射时间。我们可以看到,只有1 h PBMC的辐射可以激活ROS (,而控制)。ROS水平不断上升的时期从h 2 6 h。6 h后曝光,ROS-positive细胞的数量和ROS水平达到了最大值,然后下降。

3.2。Caspace-3活动

人类PBMCs caspacse-3活动的变化与辐射时间如图3。在头2 h辐射,caspase-3含量的变化不明显(与控制)。然而,当这些细胞被辐射超过2 h, caspase-3活动成为显著增加(与控制)。活动的caspase-3 6 h是对照组的6倍。但是在8 h, caspase-3活动6 h(价格相比显著下降)。

3.3。线粒体的潜力

图4说明了人类PBMCs的线粒体染色。的PBMCs对照组(非接触电磁辐射)发出鲜艳的橙红色荧光,很少发出绿色荧光。细胞的红色荧光强度减弱而绿色荧光细胞的比例增加拍摄的图像从6 h 2 h,表明细胞线粒体的潜力下降期间。然而,在8 h略有上升。

3.4。人类PBMC细胞凋亡

图5显示了人类PBMC细胞凋亡的流仪分析使用FITC-annexin V和π双重染色,和图6说明了暴露的细胞的凋亡率。可以看出,无论是早期细胞凋亡(膜联蛋白V + /π−)和晚期凋亡(PI膜联蛋白V + / +)是明显的(1 h和控制)。当暴露持续时间比2 h,凋亡率明显增加。早期的凋亡率增加和(分别与控制),在第二h和4 h。同时,晚期凋亡率增加和(与控制)。相比早期凋亡率4 h,没有明显增加(兑4 h) 6 h,而晚期凋亡率开始降低。8 h,早期凋亡率下降(6小时)(和6 h)。数据6(一)和6 (b)分别显示细节信息变化的早期和晚期凋亡率人PBMC辐射时间。

3.5。拉曼光谱

两种拉曼光谱得到的暴露的细胞。一个包含微弱信号的类胡萝卜素,但另一个包含类胡萝卜素的强烈信号。他们两人在图所示7,在1157年达到顶峰,1525厘米⁻¹类胡萝卜素的乐队。类胡萝卜素的光谱与强烈的信号只观察到样品接触超过一个小时,但没有找到在对照组。类胡萝卜素的光谱与强烈的信号的比例之后随着辐射时间的增长,成为60%的所有观察到的4 h。这表明暴露的类胡萝卜素释放细胞反应曝光。

除了分配给类胡萝卜素的乐队,乐队分配给DNA(787、1258和1579厘米⁻¹在图7(一);787、952、1491、1581厘米⁻¹在图7 (b))和分配给蛋白质的乐队(1004、1450、1616、1661和1678厘米⁻¹)也显然与辐射时间的变化。

3.6。细胞计数

图8说明细胞计数的结果在人类PBMC作为时间函数的辐射暴露。我们可以看到细胞的数量不断减少在六个小时,然后从6 h显著减少到8 h。8 h,大约37%的暴露的细胞已经死亡。

4所示。讨论

从结果我们可以看到显然可以诱导细胞凋亡在人类外周血单核细胞(PBMC)的辐射900 MHz GSM RFEMF在特定吸收率~ 0.4 W / kg时暴露持续时间超过两个小时。使用数据对活性氧激活,caspacse-3活动,线粒体DNA和蛋白质的潜在和拉曼光谱,我们可以算出细胞凋亡的机制如下。暴露于辐射的900 MHz GSM RFEMF可以诱发一系列蛋白质的变化,脂质,和DNA结构。这些变化包括(1)破碎的碳氢键的脂质和蛋白质(强度降低为1130厘米⁻¹在拉曼光谱),(2)破坏蛋白质的侧链(板式换热器,酪氨酸,表示强度降低为1616厘米⁻¹在拉曼光谱),(3)减少等破坏蛋白质的二级结构螺旋和表和增加随机线圈(强度降低为1264厘米⁻¹和1678/1680厘米⁻¹在拉曼光谱),和(4)DNA损伤(强度降低为952厘米⁻¹和1491厘米⁻¹在1579厘米和强度增加⁻¹在拉曼光谱)。所有这些变化影响蛋白质构象的稳定性,因此,蛋白质不能执行正常的功能去掉多余的活性氧。ROS形成和抗氧化防御系统之间的不平衡导致氧化应激在人类PBMC,从而诱导线粒体渗透性转换孔开放注射(mPTP药物)(20.,21]。注射的mPTP药物减少线粒体的潜力,从而引发caspacse-3活动最后诱导细胞凋亡(22- - - - - -26]。细胞凋亡主要是早期细胞凋亡,迟到不到6%的细胞凋亡。

这就是所谓的线粒体凋亡通路和一步一步证明了我们的实验结果。如前所述,活性氧激活诱导的DNA损伤和干扰蛋白质和脂质构象,表明DNA、蛋白质和脂类的目标可能是GSM RFEMF辐射对人类PBMC。另一方面,人类PBMC似乎释放类胡萝卜素的一种自我保护机制,以应对氧化应激抑制ROS的进一步增加。然而,它不能阻止细胞死亡的过程如果继续接触。细胞的数量甚至下降速度在6 h 8 h,如图8。一个可能性是,释放类胡萝卜素的数量并不足以对过度ROS生成。另一个可能性是,除了细胞凋亡,人类PBMC另一个GSM RFEMF暴露引起的细胞死亡过程。这是肿瘤病[27- - - - - -29日),是由我们的实验证明暴露人类PBMC细胞形态观察的(数据没有显示)。因此,细胞数量不断减少从6 h到8 h尽管凋亡细胞的数量已经在下降。我们不会讨论人类PBMC细胞肿瘤病的机制在这里但会让未来的纸。最后,我们强烈要求更多的关注可能暴露于辐射对人体健康的影响GSM RFEMF发出手机中继站或设备,因为它可能会导致37%的人类PBMC在八小时死亡。

5。结论

我们已经证明,人类可以诱导细胞凋亡PBMC的辐射900 MHz GSM RFEMF在特定吸收率当暴露持续时间超过两个小时。通过线粒体途径诱导细胞凋亡和由激活ROS和caspase-3和降低线粒体的潜力。ROS的激活是构造扰动引发的脂质、蛋白质和DNA暴露于GSM RFEMF诱导。尽管人类PBMC释放类胡萝卜素的一种自我保护机制抑制ROS的进一步增加,如果继续接触,抗氧化防御系统之间的不平衡和活性氧的形成仍然导致细胞死亡的增加曝光时间。这些发现不仅澄清了GSM RFEMF对人类健康的影响,也揭示其机理。我们希望它能帮助人们意识到可能有害健康的影响暴露于GSM RFEMF辐射的手机中继站或设备在他们的生活/职业环境。

引用

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