文摘
NADPH氧化酶类构成超氧化物阴离子的主要来源()在高血压。一些研究显示NADPH氧化酶类的一个重要的角色在不同的效果由TGF -β1。在这项研究中,我们表明,慢性P144管理,从类型III TGF -肽合成β1受体,显著降低心脏NADPH氧化酶表达和活动以及硝基酪氨酸水平观察控制自发性高血压大鼠(V-SHR)级别类似于控制血压正常的纯种京都的老鼠。此外,P144也能够减少显著增加胶原蛋白I型蛋白质和mRNA的表达从V-SHR中观察到的心。此外,胶原蛋白表达之间的正向关系,NADPH氧化酶的活动,和硝基酪氨酸水平是所有动物中发现的。最后,TGF -β1-stimulated Rat-2表现出显著的NADPH氧化酶活性,抑制在P144的存在。可以得出结论,封锁TGF -β1月P144抑制心脏NADPH氧化酶,因此添加新的数据来阐明这种酶的参与profibrotic行动的TGF -β1。
1。介绍
高血压与心血管改变多个功能和结构(1,2]。等,这些变化特点是进步的纤维胶原蛋白的积累,即胶原蛋白I型,在动物和人类的心肌和动脉高血压左心室肥厚(3]。虽然确切的机制生理胶原蛋白变成病理纤维化组织仍然是未知的,有许多研究表明当地生产的一个重要的角色转化生长因子β1 (TGF -β1)(4]。TGF -β1作为一个关键纤维发生的细胞因子在许多组织通过提高细胞外基质合成(5]。
目前,在体外研究描述,激活的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)在TGF -氧化酶系统的作用β1-induced效应(6- - - - - -9]。此外,协会的NADPH氧化酶TGF -β1-induced纤维化一直也观察到一些实验模型(10- - - - - -13]。NADPH氧化酶被显示为一个超氧化物阴离子的主要来源()[14]。它由一个膜结合细胞色素形成的一个小亚基(p22phox)和大(NOX1-5 Duox1-2)亚基,在某些情况下,细胞质的子单元,在磷酸化绑定到细胞色素(15]。在大鼠的心脏,Nox2和Nox4 NADPH亚型表达。有证据表明,酶是诱导的Nox2-dependent形式和生成,特别是体液激活(15,16]。Nox4-dependent酶似乎活跃起来从而可以直接生成过氧化氢(H2O2)[17,18]。
合成肽P144被描述,包括氨基酸730 - 743从人类membrane-proximal TGF -配体结合域β1 III型受体,也称为betaglycan, TGF -作为一个竞争对手β1 III型受体,隔绝TGF -β1。P144能够抑制肝纤维化大鼠肝衰竭模型以及在小鼠模型sclerodermia [19,20.]。此外,我们组最近证明P144防止高血压心肌纤维化和I型胶原蛋白合成实验(21]。
TGF -之间可能的相互关系β1和NADPH氧化酶的心脏损害尚未研究高血压的一个实验模型。鉴于TGF -β1是一个主要因素结构的发展变化在高血压靶器官22),我们调查是否慢性治疗P144抑制心脏NADPH氧化酶,这种效应是否与心脏相关antifibrotic肽的属性。
2。材料和方法
2.1。动物
这项研究是在协议指南发表的实验动物保健和使用由美国国立卫生研究院(NIH没有出版。85 - 23,1996年修订)(23),经动物实验伦理委员会批准西班牙纳瓦拉大学(090/05;100/07)。英国老鼠提供了哈伦有限(英国斯特)。12个男性Wistar-kyoto大鼠(WKY) (V-WKY)和10周大雄性自发性高血压大鼠(月)(V-SHR)收到车辆(生理盐水)腹腔内12周,然后是牺牲了22岁的周。此外,10周大WKY (,P144-WKY)和10周大萎缩(与腹腔内P144 P144-SHR)治疗12周,然后牺牲。肽是溶解在盐溶液,浓度是体重调整获得平均日剂量为1毫克/公斤体重/天。这个剂量被选中,因为它已经证明了此前在啮齿动物中,P144展品肝和皮肤antifibrotic活动时间剂量为0.5毫克/公斤体重/天(15,16]。所有的老鼠被安置在单独的笼子里免费获取标准的鼠粮,自来水在一个安静的房间在恒定的温度(20 - 22°C)和湿度(50 - 60%)。他们被斩首牺牲之前,老鼠体重与氯胺酮麻醉75毫克/公斤(1000年Imalgene,梅里亚)和甲苯噻嗪5毫克/公斤(Rompun,拜耳)。
2.2。测量血压
收缩压(SBP)、舒张压(菲律宾)测量在所有老鼠每2周的标准tail-cuff方法使用一个LE5007计算机(Letica科学仪器)的压力。
2.3。组织样本的准备
牺牲后,心被仔细切除和冻结在mRNA−80°C,酶活性和蛋白质分析。
NADPH氧化酶活性和免疫印迹研究心脏匀浆冰在磷酸缓冲盐(50毫米K2HPO4,50 mM KH2阿宝4、0.001毫米EDTA和蛋白酶抑制剂pH = 7)玻璃/玻璃电机驱动的组织均质器2分钟。匀浆离心机在2000克10分钟。颗粒被丢弃,上层清液储存在−80°C。蛋白质含量是由洛瑞的方法。
2.4。NADPH氧化酶活性
化学发光检测10μmol / L lucigenin和200年μmol / L NADPH被用来测量生产于200年μ克组织匀浆。发光管中被记录在10分钟光度计(天狼星Berthold检测系统)。缓冲区空白是减去从每个阅读,曲线下的面积的值被用来量化化学发光。数据表示为相对光单位(rlu)产生每秒每毫克的蛋白质。
2.5。免疫印迹
分析了硝基酪氨酸(NT)的表达水平和胶原蛋白I型和Nox4 Nox2 NADPH氧化酶亚型,蛋白质电泳分离。膜是孵化与特定的抗体Nox4和Nox2亚型(圣克鲁兹圣克鲁斯生物技术公司),NT(北部生物技术、微孔)和胶原蛋白I型(生源论)一夜之间在4°C的稀释1:1000。膜与适当的孵化peroxidase-conjugated二级抗体(通用电气医疗集团)1小时在室温下(1:25000 anti-rabbit Nox4, 1: 10000 anti-mouse Nox2, 1: 10000 anti-mouse胶原蛋白I型,和1:20000 anti-mouse NT)。蛋白表达与ECL-Advanced化学发光系统可视化(Amersham生物科学)。乐队进行了分析使用Chemidoc检测系统和一个软件数量(Bio-Rad)获得密度测量任意单元(AU)。这些墨迹是reprobed单克隆α微管蛋白抗体(圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司)作为控制加载。数据表示为相对表达式α微管蛋白。
2.6。实时rt - pcr
信使核糖核酸(mRNA)与Oligotex隔绝总RNA信使RNA工具包(Quiagen)。实时PCR反应使用TaqMan基因表达进行了调查:Nox4 Rn (00585380), Nox2 Rn (00576710), p22phox Rn (00577357), p47phox Rn (00586945), TGF -βRn 1 Rn(00572010),纤连蛋白(00569575)、I型胶原蛋白(Rn01463848),实验(Rn 01529736),结缔组织生长因子(CTGF, Rn 00573960),赖氨酰化氧(Rn液态氧,01491829),和18 s核糖体RNA (Hs - 03003631)。数据归一化到18 s核糖体RNA表达。相对mRNA的表达是由2-ΔΔCT方法(24]。
2.7。细胞培养和在体外实验
从美国购买Rat-2成纤维细胞系类型文化收集和维护在杜尔贝科修改鹰的介质(表达载体)补充10%胎牛血清的边后卫,表达载体,Penicilin-Streptomicin解决方案(表达载体)和二性霉素b(表达载体)。Rat-2细胞被播种密度为5.25×105T-25组织细胞培养瓶(Nunc),允许在一夜之间遵循。细胞培养在reduced-serum中等(1%的边后卫)前24 h TGF -β1刺激。使用四个条件:(1)细胞在媒体降低血清孵化,孵化(ii)细胞在降低血清包含TGF -媒体β1 (10 ng / mL),(3)细胞培养在降低血清媒体包含P144 (200μg / mL), (iv)细胞培养在降低血清包含TGF -媒体β1 (10 ng / mL)和P144 (200μg / mL),收获前24小时。治疗后,细胞是使胰蛋白酶化和颗粒状。细胞颗粒在磷酸盐溶液洗(表达载体)和离心机在4°C 1100 g 5分钟然后用于蛋白质提取。
NADPH氧化酶活动进行如上所述。在这种情况下,生产10日测量μg细胞的蛋白质。
2.8。统计分析
结果意味着±SEM。分析四组之间的差异,单向方差分析了菸害的测试是执行一次正常证明(Shapiro-Wilks测试);否则,非参数检验(Kruskall-Wallis)一个Mann-Whitney紧随其后U以及(由Bonferroni调整alpha-level不平等)。二元关联进行皮尔逊相关的测试。统计分析是使用Windows的计算机程序SPSS 15.0版。
3所示。结果
3.1。P144对血压的影响
V-SHR SBP和菲律宾的值升高(SBP: 246.7±3.6毫米汞柱;菲律宾:208.6±5.9 mmHg) 22岁的周相比V-WKY (SBP: 175.0±3.5毫米汞柱;菲律宾:128.7±7.1毫米汞柱;)。有趣的是,22周时,血压值较低()P144-SHR (SBP: 215.6±5.9毫米汞柱;菲律宾:比V-SHR 191.9±4.5毫米汞柱),尽管他们仍然较高(比V-WKY)。P144-WKY之间没有观察到显著差异(SBP: 160.8±5.2毫米汞柱;菲律宾:126.9±4.3毫米汞柱)和V-WKY。
3.2。在心脏P144 NADPH氧化酶的影响
心脏NADPH氧化酶活性高(比在V-WKY(图)V-SHR1)。P144减少管理的通知》()NADPH氧化酶活性在P144-SHR V-WKY水平。没有发现差异P144-WKY和V-WKY之间(图1)。因此,心脏信使rna和蛋白质水平的Nox2(图2)高()比V-WKY V-SHR。与V-SHR相比,管理P144 Nox2 mRNA和蛋白水平降低(图2在P144-SHR) (类似于V-WKY)水平。其他NADPH氧化酶亚基与Nox2 NADPH氧化酶同种型也评估在mRNA水平。心脏丰富p22phox和p47phox更高()V-SHR(2.26±0.15盟和2.23±0.21 AU)比V-WKY (1.00±0.09 AU p47phox p22phox和1.00±0.08 AU)。在同一条线上NADPH氧化酶活动结果,P144减少管理的通知》()的mRNA表达p22phox和p47phox P144-SHR组(1.47±0.1 AU和0.99±0.23 AU)水平与V-WKY相似。
(一)
(b)
有趣的是,心脏信使rna和蛋白质水平的Nox4 NADPH氧化酶同种型(图3)高()比V-WKY V-SHR。与V-SHR相比,管理P144 Nox4表达降低(图3在P144-SHR) (类似于V-WKY)水平。
(一)
(b)
3.3。P144对心脏的影响硝基酪氨酸的含量
自从亚硝基化蛋白质被认为是氧化应激的结果,nitrotyrosilated蛋白质的水平被免疫印迹量化。遵循相同的模式,NADPH氧化酶活动确定心脏匀浆,NT含量高()比V-WKY V-SHR组(图4(一))。同样,P144减少管理的通知》()在P144-SHR NT表达的水平。nitrotyrosilated蛋白质的水平相似V-WKY和P144-SHR之间。
(一)
(b)
之间的直接相关性被发现心脏NADPH氧化酶活性和所有的老鼠(NT水平,),这表明NADPH氧化酶过度活跃可能发挥重要作用的发展高血压心肌氧化应激在这个模型(图4 (b))。
3.4。P144对心脏胶原代谢的影响
心脏胶原蛋白I型蛋白表达和mRNA水平高(比在V-WKY(图)V-SHR5)。P144减少心脏胶原蛋白类型的管理我在P144-SHR蛋白表达。没有发现差异P144-WKY和V-WKY之间(图5)。
(一)
(b)
TGF -的mRNA的表达β1,CTGF,纤连蛋白,实验和液态氧()比V-WKY V-SHR。P144导致慢性管理减少表达式(这些分子的)的mRNA水平(图6)。
此外,结合数据从所有组、胶原蛋白之间的直接正相关性被发现I型蛋白表达和参数评估氧化应激,也就是说,NT水平(,)和NADPH氧化酶活性(,)。
3.5。在体外发现
在体外研究表明,TGF -β1刺激(Rat-2成纤维细胞(图),NADPH氧化酶活动7)。有趣的是,P144完全阻止了TGF -β1-induced NADPH氧化酶活性(图7)。
4所示。讨论
本研究的主要发现如下:(i)慢性管理P144抑制NADPH氧化酶活性和表达,以及NT-assessed氧化应激的萎缩;(2)慢性管理P144防止心脏胶原蛋白的过度表达I型胶原合成和分子相关在同一个老鼠;(3)P144能够阻止TGF -β1-induced NADPH氧化酶活动培养鼠成纤维细胞。总的来说,这些发现表明,TGF -干扰β由P144 1-NADPH氧化酶轴可能导致心脏antifibrotic行动的肽。
越来越多的证据表明,NADPH氧化酶活性增加心脏病的几个动物模型(25,26]。在我们的研究中,NADPH氧化酶活性增加V-SHR与调节Nox2和相关联的子单元,即p22phox p47phox。此外,心脏在未经处理的V-SHR NT水平的高度与平行增加NADPH氧化酶活性,表明增加氧化应激在V-SHR,大概NADPH氧化酶激活。有趣的是,增加表达Nox4同种型也观察到V-SHR的核心。鉴于已经证明Nox4 NADPH氧化酶同种型生成主要是H2O2(17),我们可以推测,增加心脏V-SHR NADPH氧化酶活性是由于upregulation Nox2同种型及其胞质成分。
TGF -β1类型III受体或betaglycan是最丰富的TGF -β1结合蛋白在细胞表面(27]。Betaglycan强化TGF -β1绑定的信号I型和II型受体,因此,可能参与配位演讲(28]。大部分研究预防纤维化高血压心脏病都集中在药物干扰血管紧张素的有效性II-aldosterone-TGF -β1轴[29日,30.]。在这种背景下,我们小组开发了一种合成肽序列的细胞外地区的人类betaglycan P144,预测潜在的粘合剂TGF -β由计算机程序(131日]。我们最近证明P144防止心肌纤维化和胶原蛋白I型合成在月21]。
不同的实验方法提出TGF -一个关键的角色β1在NADPH氧化酶的活化。载脂蛋白E-deficient老鼠的一项研究表明,升高系统性TGF -β1水平导致血管改变通过NADPH氧化酶激活(32]。此外,达尔食盐过敏老鼠的换成治疗心力衰竭预防心脏功能障碍和重塑,这是与TGF -的抑制有关β1、抑制NADPH氧化酶亚基的表达(33]。在鼠心室细胞氧化应激引起的NADPH氧化酶系统介导的心肌细胞收缩功能障碍引起的TGF -β1 (34]。在与这些协议的研究中,我们发现,治疗与P144防止NADPH氧化酶过度活跃在萎缩。此外,我们的数据显示,NADPH氧化酶活性的降低慢性治疗P144与NADPH氧化酶亚基丰度显著降低,减弱NT水平P144-SHR的核心。因此,P144治疗似乎限制氧化应激通过降低NADPH氧化酶的丰度月心控制应变的水平。在成年大鼠心脏成纤维细胞的研究表明NADPH氧化酶抑制了血管紧张素II-stimulated胶原蛋白的生产(4]。最后,活性氧的生成,以应对Rac Rat-2已经证明了成纤维细胞(35]。从当前扩大这些数据的研究发现表明P144抑制TGF -的能力β1刺激NADPH氧化酶活动在同一大鼠成纤维细胞的细胞系。
多项研究表明,降低NADPH氧化酶激活与逆转心脏损害在几个实验模型(33,36,37]。事实上,吴等人表明,乙酰水杨酸的抗氧化性能与对血管紧张素的保护作用密切相关II-induced心脏肥大(26]。此外,吡格列酮和坎地沙坦对心脏纤维化施加有利影响衰减的NADPH氧化酶活性(37]。当前研究的结果使我们能够表明P144 antifibrotic行动的实验性高血压可能会阻止TGF -的能力β1-induced NADPH氧化酶激活。然而,进一步的实验应该执行更好的解决这个问题的可能性。
当前研究的一些局限性必须认可。首先,剂量为1毫克/公斤体重/天选择研究P144的影响NADPH oxidase-mediated TGF -β1的影响。之前证明P144展品肝和皮肤antifibrotic活动在剂量高于0.5毫克/公斤体重/天在啮齿动物19]。事实上,其他组织的萎缩和WKY大鼠以前对待P144剂量的0.5毫克/公斤体重/天,而没有antifibrotic效果观察心脏水平(数据没有显示)。第二,虽然我们没有确定H2O2生产,建议Nox4蛋白质表达水平可能是代表Nox4-dependent H2O2生产。最后,为了更好地理解NADPH氧化酶和胶原蛋白生产之间的联系,进一步的数据在体外研究将是必要的。
总之,目前的结果支持P144,从类型III TGF -肽合成β1受体,阻止NADPH oxidase-dependent氧化应激和纤维化萎缩的心。因此,P144可能有趣治疗代理保护高血压心脏对氧化应激和纤维化。应该进行进一步的研究来更好的解决这个问题的可能性。
缩写
| NADPH: | 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 |
| TGF -β1: | 转化生长因子-β1 |
| : | 超氧化物阴离子 |
| 月: | 自发性高血压大鼠 |
| NT: | 硝基酪氨酸 |
| CTGF: | 结缔组织生长因子 |
| 液态氧: | 赖氨酰化氧 |
| SBP: | 收缩压 |
| 菲律宾: | 舒张压。 |
确认
本文是通过资助协议应用的基础医学研究(费马)和CIMA UTE项目,教育部瓦政府(87/2007),科学和创新部(RECAVA RD06/0014/0008) (saf2008 - 04228)和欧盟(媒体项目给予健康- f2 - 2010 - 261409)。作者感谢安娜蒙托亚,拉奎尔Ros, Idoia罗德里格斯,形态和成像技术支持部门。