文摘
玫瑰果在促进健康的产品很受欢迎的水果含有高含量的生物活性化合物。本研究的目的是调查是否健康的好处是由于抗坏血酸、酚类或其他rose-hip-derived化合物。冷冻干燥的粉玫瑰果preextracted偏磷酸和样本然后顺序筛选了C18列。氧化损伤的改善程度是决定红细胞在体外生物测定通过比较还原剂的影响对红细胞单独或红细胞使用浆果提取物。最大抵抗氧化应激,%(平均值±标准偏差),实现当孵化的细胞第一次筛选了meta-phosphoric提取。删除从这个提取增加了抗坏血酸对氧化应激的保护%。20%和100%甲醇提取物的保护%,分别为%。儿茶素的抗氧化吸收测量证实了HPLC-ESI-MS 20%甲醇提取。所有顺序筛选了提取物有助于保护对红细胞的影响研究表明,玫瑰果包含一个承诺水平的临床相关的抗氧化保护。
1。介绍
氧化应激与许多不同的疾病,如心脏和心血管疾病,糖尿病,肥胖和癌症。流行病学研究显示,饮食富含水果促进健康,至少部分是通过延缓疾病的发作与氧化应激(1]。这些好处可能由不同的植物化学物质具有高的抗氧化能力,其中茶多酚是一大群中发现大量的浆果(2,3]。抗氧化能力的测定可以执行许多不同的方法。一般的相关性,化学方法和他们的实际关系人类健康的好处,然而,有争议的4- - - - - -6]。人类细胞系统可以提供比简单的化学生物相关性评估和他们也允许机会考虑添加营养物质之间的相互作用和功能完整的细胞酶系统,以及活细胞的完整的膜。
红细胞可以作为相关调查人类细胞模型的生物利用度和抗氧化保护天然产物对氧化应激。植物植物化学物质的抗氧化潜力与氧化应激曾被评估使用不同红细胞的方法。细胞膜的脂质过氧化程度调查,使用完整的红细胞或红血球膜测量丙二醛,脂质过氧化反应的指标(7,8]。科尔曼(9)使用高铁血红蛋白生成作为氧化应激模型。其他实验室专注于氧化还原酶的水平(10- - - - - -13)以及自由基的使用发电机诱导红细胞裂解(12,14,15]。策略研究膳食抗氧化剂保护使用红细胞也已发表(16- - - - - -19]。红细胞被用来测试氧化应激在几个不同的疾病(20.- - - - - -22),对在体外测试cell-permeating治疗抗氧化剂。Honzel et al。23)和Blasa et al。24)已经开发出红细胞模型以确定天然产品,可以提供持续的细胞免受氧化损伤。
红细胞的适用性作为氧化应激的试验测量在于它适应的预防氧化stress-mediated扰动的结构,因此血红蛋白的功能。红细胞血红蛋白含有超过90%的体重,和第二高的细胞稳定这种蛋白质细胞内谷胱甘肽水平在体内(肝脏)(9]。高谷胱甘肽浓度淬灭活性氧species-mediated血红蛋白结构损伤,可发生由于过氧化物的形成,进而产生于正常的氧气运输(9]。谷胱甘肽维护系统还提供了维持其他细胞抗氧化剂的还原能力的降低。不同的植物化学物质具有不同化学性质可能对抗氧化应激在红细胞和潜在的保护细胞内硫醇(9]。
越来越多的水果和浆果的兴趣丰富许多生物活性化合物的来源,可能会促进健康。许多研究研究人造物质和/或纯化合物在高浓度而不是植物化学物质的联合效应在复杂的食物。在过去的十年中,玫瑰果获得增加利益,因为他们含有一种物质,具有一些抗氧化剂,抗诱变剂的,和抗癌的效果25,26]。玫瑰果已经被用来治疗关节炎等疾病(27- - - - - -29日)、风湿病和糖尿病。主要的生物活性在玫瑰果是酚类化合物,抗坏血酸,天然维生素e,β胡萝卜素、番茄红素、丹宁酸、果胶、糖类、有机酸、氨基酸和必需脂肪酸(30.,31日]。其他rose-hip-derived化合物报道包括galactolipids [31日)和三萜酸(32]。有趣的是,这些化合物的抗氧化作用并不能完全解释的临床疗效,野玫瑰果粉末(33]和玫瑰果中的酚类化合物的功效尚未评估在控制临床试验(30.]。事实上,它仍然不清楚多酚类物质对人类健康的保护作用是由于饮食中酚类或其他代理(30.),如植物化学物质,可以通过绑定红细胞(总oxidant-scavenging能力增强34]。本研究的主要目的是调查不同方面的玫瑰果的抗氧化保护红细胞氧化应激在体外测试系统。
2。材料和方法
2.1。化学物质和细胞
甲醇、甲酸、乙腈,85%磷酸,meta-phosphoric来自默克(达姆施塔特,德国)。抗坏血酸、抗坏血酸盐氧化酶、二甲亚砜(DMSO), KH2阿宝4,Na2阿宝4、EDTA、H2O2买来Sigma-Aldrich (Seelze,德国)。磷酸盐(PBS),没有钙或镁,二氯荧光素二乙酸(DCF-DA)获得表达载体(Lidingo、瑞典)。标准用于HPLC-ESI-MS分析(儿茶素、proanthocyanidin芦丁,槲皮素半乳糖苷,花青色素葡萄糖苷)买来Extrasynthese (Genay、法国)。
2.2。植物材料
评价抗氧化剂的吸收红细胞玫瑰果从三个先进的选择(“BRo30173”,“BRo30289”和“BRo05035”)在采样完全成熟。种子被移除,剩下的肉与皮肤冻干和地面细粉在实验室轧机(黄线,A10 IKA-Werke, Staufen,德国)之前提取。
2.3。丰富的多酚提取做准备
冷冻干燥粉玫瑰果的三个选择是平等的比例和2.5 g的混合粉添加到50毫米偏磷酸preextraction (50 mL)。玫瑰臀部preextract (PE)是在超声波浴前15分钟在4500转离心10分钟。上层清液应用于C18(EC)列(Isolute SPE列、Biotage吸附剂AB),预平衡以100%甲醇和dH洗2o .顺序进行洗脱,第一个获得提取(E1A)由偏磷酸pre-extract的洗脱液。提取两(ea2)和三(E3A)由洗脱液的50毫升20%甲醇水溶液和50毫升100%甲醇,分别。偏磷酸和甲醇作为他们优先提取不同的生物活性化合物根据其物理化学性质。的溶剂提取被使用一个旋转蒸发器在45°C。集中提取被溶解在50 mM偏磷酸。
2.4。抗坏血酸酶去除
抗坏血酸盐氧化酶(AO,西格玛奥德里奇)是用于酶的抗坏血酸降低抗坏血酸脱氢抗坏血酸。抗坏血酸盐氧化酶是溶解在磷酸缓冲KH组成的100毫米2阿宝4,4毫米Na2阿宝45毫米EDTA, pH值设置为5.6。整除的提取物(E1A-E3A),和pH值调整到5.6。这些提取物抗坏血酸盐氧化酶处理提供ascorbate-depleted提取物(E1B-E3B)。为此100单位的抗坏血酸盐氧化酶被添加到包含样品的试管在黑暗中,在室温下24小时。
2.5。抗坏血酸含量的分析提取
抗坏血酸含量的提取系统在日本岛津公司的高效液相色谱法测定(SIL-10A autosampler, SCL-10AVP控制单元,LC-10AD泵、SPD-10AV VP紫外可见检测器单元,BergmanLabora,瑞典)。pre-extract (PE)和偏磷酸提取meta-phosphoric酸(E1A)被稀释2%,20和30倍,分别分析。没有与其他提取物稀释了。的权力平等主义的洗脱液由0.05不2阿宝4和磷酸(8.5%)、洗脱液的pH值调整到2.8。使用Restek分离了,150×4.6毫米,列保持在30°C(列冷却器,吸附剂AB)和一个警卫列。检测是在254海里。评估数据完成了日本岛津公司Class-VP软件(版本6.13 SP2)使用保留时间和光谱数据与外部标准的抗坏血酸。分析了每个样本一式三份。
2.6。由HPLC-ESI-MS分析酚类
主要单酚类的内容不同的提取测定珀金埃尔默Sciex API 150例单四极质谱仪(涡轮离子喷雾接口)根据修改后的方法从描述Salminen et al。35]。高效液相色谱系统由两个珀金埃尔默泵连接到一个珀金埃尔默autosampler(联赛200)。的化合物分离使用Phenomenex Synergi 4μHydro-RP 80 a, 250×4.6毫米列,C18precolumn。0.4%的流动相由甲酸(缓冲)和乙腈(缓冲B)。洗脱液的流量运行1.0毫升分钟−1梯度洗脱是如下:0% B(0 - 3分钟),30%(3-30分钟),40%(30分钟),40%的B(35-38分钟),和0%的B(38 - 42.5分钟)。所有样本的注入成交量8μl .洗脱液分成0.3毫升分钟−1电喷雾质谱在被介绍给系统。喷雾室在4.0 kV的负离子模式和质量离子通过收购获得数据峰值跳和扫描模式。儿茶素检测289.3 m / z (mh)−,proanthocyanidin单体577.5 (mh)−577.5,proanthocyanidin聚体(mh)−609.5,芦丁(mh)−463.4,槲皮素半乳糖苷(mh)−463.4,槲皮素葡萄糖苷(mh)−477.1,花青色素葡萄糖苷(mh)−。一般条件定量HPLC-ESI-MS分析如下:喷雾器天然气9.0 L分钟−1L、窗帘天然气12.0分钟−1,干燥气体温度300°C。
2.7。测定总酚类
总酚类化合物的含量测定采用Folin-Ciocalteu法(36]。总之,五μL与100年不同提取物的涨跌互现μL 5%的乙醇,200μL Folin-Ciocalteu试剂2毫升15% Na2有限公司3,1毫升的dH2o . 765 nm的吸光度测量在室温下2 h后孵化。没食子酸作为标准和总酚类的内容表示为毫克没食子酸当量(GAE) / g干重(dw)。
2.8。铁减少等离子体的能力
等离子体的铁还原能力(收紧)的提取测定根据Benzie方法开发和应变37),但修改以适合96 -格式(38]。不同提取物稀释100倍。十μ这些准备孵化的L 37°C,然后混合260μL ferric-TPTZ试剂(由混合300毫米醋酸缓冲,pH值3.6;10毫米的2,4,6-tripyridyl-s-triazine盐酸40毫米;和20毫米FeCI3的比率4:1:1;解决方案是保持在37°C)。吸光度测量在595 nm 4分钟后在盘子里读者(日出,Tecan北欧AB,瑞典)。菲2 +被用作标准和L-ascorbic酸被用作控制一摩尔的抗坏血酸对应大约两摩尔的收紧(我们获得和使用价值2.02)。
2.9。红细胞的准备
红细胞所执行的准备Honzel et al。23]。简单地说,一个健康的人类志愿者担任献血者。外周静脉血样卷入钠K2edta瓶(BD真空采血管、英国)。瓶是在2400转离心5分钟。等离子体和白细胞和红细胞中删除被吸量管收获,转移到新瓶。PBS的红细胞被洗了三次在2400转离心5分钟。
2.10。红细胞抗氧化保护模型的分析
红细胞生物测定的协议是基于细胞抗氧化保护试验使用红细胞(CAP-e) [23]修改microplate-based化验,但使用H2O2,如自由基生成器。短暂,从剩余的红细胞,0.12毫升加入12毫升的PBS。红细胞被串行处理稀释前面获得的提取(PE、E1A-E3A和E1B-E3B)。红细胞悬液是在黑暗中孵化的摇臂在室温下为120分钟。红细胞被洗两次PBS和细胞外的任何潜在的抗氧化剂从而移除。细胞颗粒是通过添加dH细胞溶解2O和细胞溶解样品荧光染料处理5 - (6)-carboxy-2′, 7′二氯荧光素(DCF-DA),这成为荧光由于氧化损伤。后的样本被暴露在自由基的167毫米过氧化氢(羟基自由基发生器)。10分钟后抗氧化损伤的程度是通过测量每个样品的荧光强度。DCF-DA均值之间的荧光强度比未经处理的红细胞(负控制),hydrogen-peroxide-treated红细胞(积极的控制)和红细胞使用玫瑰果种皮提取的三个独立的板块。
2.11。红细胞的苯酚的分析
从剩下的红细胞,纯红细胞提取ea2处理。所有测量数据进行三个真正的复制。为此,红血球细胞悬液(样本1/3和2/3纯化红细胞)是在黑暗中孵化摇臂在室温下60分钟。红细胞洗两次在PBS消除抗氧化剂不能进入细胞后60分钟孵化。洗后的上层清液保留进行分析。细胞颗粒与绝对乙醇溶解,漩涡和放置在一个超声波浴5分钟,然后在13000转离心5分钟。为分析保存当时上层清液使用HPLC-ESI-MS节中描述2。6。
2.12。统计分析
氧化应激实验的结果表示为均值±标准差。每个观察重复在不同的96孔板一式三份。使用一款统计软件统计分析进行了16个软件(一款统计软件,州立大学,宾夕法尼亚州,美国)。配对t以及分析揭示任何重大区别治疗(提取)。
3所示。结果
在这项研究中,人类红细胞的防止氧化应激是测量在体外。实验进行的野玫瑰果偏磷酸preextract和三个不同极性提取物通过连续洗脱pre-extract的C18固相列。
抗坏血酸的含量在提取和酶处理前后不同的稀释提出了表1。从这些数据,很明显,治疗与抗坏血酸盐氧化酶有效减少抗坏血酸盐的含量在所有样本,尽管微量留在提取E1B。
Folin-Ciocalteu试验用于测量总酚类的内容。高含量的酚类化合物被发现的偏磷酸提取物(PE和E1A)。虽然这个值降低酶治疗后(E1B),它仍高于提取两个(ea2)和三(E3A)(表2)。
内容的提取也分析了单一使用质谱分析酚类化合物。我们发现大量的儿茶素,proanthocyanidin单体,proanthocyanidin二聚体,芦丁,槲皮素半乳糖苷,槲皮素葡萄糖苷和cyanidin-glucoside(表3)。偏磷酸萃取物(E1A)只包含低水平的不同的酚类化合物,而第二(20%甲醇)提取(ea2)特别是,而且第三(100%甲醇)提取(E3A)包含相当多的酚类化合物。量化的单酚类化合物儿茶素和原花青素在场最高金额。
使用化学收紧衡量抗氧化能力测定,metaphosphoric提取(E1A)显示最高的抗氧化能力,464.4±84.2μ摩尔菲2 +/ g干重(dw)。这个值减少4倍酶治疗后98.0±10.6μ摩尔菲2 +/ g dw (E1B),然后低于第二(20%甲醇)提取(ea2)(表4)。
这与使用红细胞的生物模型。在图1,防止氧化应激在红细胞显示提取,用抗坏血酸(a)和抗坏血酸(b)。有趣的是,有一个重要的()增加保护消除抗坏血酸后,用59.4%和67.9%的保护E1A E1B,分别提取浓度的3毫克每毫升。野玫瑰果粉ea2多酚含量最高的是最保护丰富的多酚提取物抑制氧化损伤的20.8%。相应的保护从第三提取(E3A)为5.0%。
确认红细胞的抗氧化剂的吸收,红细胞中多酚的含量是衡量处理丰富多酚(20%甲醇)提取使用HPLC-MS (ea2)。只研究了茶多酚的儿茶素和原花青素进入红细胞检测(图2)。红细胞的吸收非常低,儿茶素总量的3.1%(表提供5)。上层清液中含有50.7%,因此46.2%的添加儿茶素留在红血球膜的颗粒组成。
(一)
(b)
4所示。讨论
人类红细胞携带氧气和可能暴露于活性氧可能导致氧化损伤。几种微量元素可以保护红细胞对抗氧化应激。在这项研究中,我们使用人类红细胞调查细胞保护和吸收顺序提取生物活性化合物的筛选了酸水提取的玫瑰果。所有提取研究有助于保护对红细胞的影响表明,玫瑰果含有多种有效的抗氧化物质。
抗坏血酸的含量最高pre-extract和筛选了偏磷酸提取(PE和E1A)。在这项研究中,偏磷酸水溶液提取显示优越的抵御氧化损伤。在一项研究40),我们表明,保护作用(~75%)的玫瑰果不能由于抗坏血酸含量仅为玫瑰果提取物仅含0.4毫克抗坏血酸在5.0毫克/毫升干重野玫瑰果粉末中含有5.0毫克/毫升而控制抗坏血酸/毫升和提供~65%的保护。这意味着保护能力特别是抗坏血酸,还其他新颖的化合物。
测量的Folin-Ciocalteu测定总酚类曾被发现是偏见由于nonphenolic降低化合物的干扰,如抗坏血酸和糖(41,42)导致估计过高。抗坏血酸的贡献可以确定总抗氧化活性,抗坏血酸对应一摩尔以来大约两摩尔的收紧(在我们的分析我们得到和使用价值2.02)。收紧的贡献价值的抗坏血酸含量的野玫瑰果偏磷酸pre-extract从而计算是31更易与铁2 +/ L(表1),这应该与获得的总收紧值相同的提取是59更易与铁2 +/ L(表4)。提取E1A的收紧的抗坏血酸值内容类似于总收紧值,表明抗坏血酸的贡献,但在提取ea2,抗坏血酸的收紧的贡献只有6更易与铁2 +/ L的收紧总价值75年相比更易与铁2 +/ L。剩下的收紧抗坏血酸的提取几乎没有贡献;因此,有大量的其他化合物,导致这些提取物的抗氧化能力。
收紧化验,偏磷酸提取(E1A)显示最高的铁减少的能力,但这个值降低酶治疗后4倍。enzyme-treated提取的活动(E1B)低于第二筛选了(20%甲醇)提取(ea2)。
Pandey, Rizvi13]研究白藜芦醇的保护作用在人类红细胞氧化应激的标记。人类红细胞能够吸收白藜芦醇和槲皮素,一旦细胞内,这些化合物可以捐赠电子通过红细胞胞外电子受体质膜氧化还原系统。Fiorani和Accorsi11]显示等多种黄酮类化合物槲皮素的吸收,木樨草素、山柰酚、非瑟酮、异鼠李亭,acacetin,白杨素、芹黄素,galangin, tamarixetin。大多数这些代理积累在细胞内,因为他们与血红蛋白结合的能力。在另一项研究中,Fiorani et al。43]研究黄酮类化合物在水和乙醚提取并显示多酚醚提取物引起他们的抗氧化效果质膜氧化还原酶的激活,但黄酮类化合物在水提取细胞试验无效。作者占这些观察通过水组件无法穿过红血球膜(43]。在我们的研究中,防护能力最明显的水提取物。获得了最高程度的保护与第一筛选了偏磷酸提取(E1A),有趣的是,有一个保护的增加红细胞后移除这个洗脱液的抗坏血酸(E1B)。抗坏血酸盐氧化酶有效减少抗坏血酸盐的内容提取,E1B,只有少量剩余。然而,提取E1B最有可能含有DHA,这相当于生物活性抗坏血酸作为红细胞有很高的抗坏血酸再生的能力。红细胞缺乏主动转运体抗坏血酸盐,而DHA是由葡萄糖迅速被易化扩散运输蛋白质,GLUT1。细胞内DHA迅速减少谷胱甘肽的抗坏血酸盐直接化学反应和细胞内的困44]。Enzyme-dependent机制涉及glutaredoxin和硫氧还蛋白还原酶也被证明(44]。增加保护得到enzyme-treated提取(E1B)可能因此被解释为激活抗坏血酸盐和谷胱甘肽。血红蛋白是一种活性蛋白,红细胞稳定并保护细胞内谷胱甘肽的水平。谷胱甘肽维护系统提供了还原能力维持细胞抗氧化剂的减少其他国家。DHA进入细胞的吸收可能暂时耗尽细胞内硫醇的水平,尽管任何显著减少谷胱甘肽水平上升和随后GSSG将立即刺激NADPH一磷酸己糖形成的分流(HMP) [9]。HMP活动将还原谷胱甘肽的水平,和细胞再生抗坏血酸盐、谷胱甘肽可能占增加enzyme-treated提取的保护。也可能,总抗氧化活性的主要贡献可能来自植物化学物质的结合,不是仅从抗坏血酸,正如前面所示的太阳et al。45]。
确定抗氧化剂摄入,儿茶素的内容被HPLC-MS测量。吸收只是提供的儿茶素总量的3.1%。上层清液中含有50.7%,因此46.2%,添加儿茶素留在红血球膜的颗粒组成。这是在协议与科伦et al。34),表明人类红细胞不仅携带氧气,还可以绑定多酚抗氧化剂。
5。结论
所有顺序筛选了提取物有助于保护对红细胞的影响研究表明,玫瑰果包含许多不同的抗氧化化合物。水偏磷酸提取显示最高的抵御氧化损伤,这意味着保护能力的抗坏血酸以及其他身份不明的化合物。
确认
这个项目是由瑞典研究理事会对环境、农业科学和空间规划。作者要感谢卡Axelsson,克里斯蒂安斯塔德市大学与血平,这样Piwowar-Zail寻求帮助,瑞典农业科学大学优秀实验室协助。