钠-葡萄糖协同转运体抑制可防止糖尿病大鼠肾脏氧化应激

摘要

高血糖引发多种慢性糖尿病并发症，其介导的氧化应激增加，最终导致糖尿病肾病。本研究的目的是检查钠-葡萄糖共转运体(SGLT2)的抑制是否可以防止糖尿病大鼠肾脏的氧化应激。方法．采用链脲佐菌素(50 mg/kg)腹腔注射建立糖尿病大鼠模型。每天皮下注射根皮苷(0.4 g/kg)可抑制SGLT2。通过过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和3-硝基酪氨酸(3-NT)免疫组化检测氧化应激。结果．链脲佐菌素诱导的糖尿病可引起高血糖和体重下降。糖尿病大鼠皮质和髓质CAT活性降低;相比之下，GPx活性增加。糖尿病大鼠肾脏3-NT染色明显高于对照组。抑制SGLT2可降低高血糖。然而，糖尿病大鼠仍存在明显的利尿和糖尿。根皮苷处理可恢复CAT和GPX活性，降低3-NT染色。结论．根皮苷对SGLT2的抑制可防止糖尿病大鼠肾脏的高血糖和氧化应激，提示SGLT2活性可能与促氧化机制有关。

1.介绍

糖尿病肾病(DN)是终末期肾衰竭的主要原因，占全球需要透析治疗的所有新病例的35%至40%。临床研究表明，高血糖是介导糖尿病肾病发生和发展的重要原因[1］．多项证据表明，控制肾近端小管中的葡萄糖可能在糖尿病全身性并发症的发生中发挥重要作用[2，3.］．

另一方面它已经表明,增加葡萄糖摄取在糖尿病可能导致肾细胞内葡萄糖水平高,诱导一个增强生产活性氧(ROS),这可能被放大的能力降低细胞抗氧化防御系统在这种情况下(4，5］．最近，我们报道了糖尿病和盐敏感性大鼠中葡萄糖钠共转运体(SGLT2)活性和表达的增加[6，7］．此外，我们还发现，在糖尿病大鼠中，熊去氧胆酸治疗可以防止氧化应激和SGLT2表达的增加[8］．

过量产生ROS已被认为是导致氧化损伤增加的途径的共同结果，最终导致DN [5］．在这种情况下，能够减少或调节高血糖和氧化应激的化合物可能是延迟DN发病的一个合理靶点。

根皮苷抑制SGLT2通过诱导糖尿在糖尿病啮齿动物中发挥降糖作用[9预防Zucker糖尿病脂肪大鼠血糖水平升高[10］．根楝素治疗引起的肾葡萄糖转运抑制导致血糖血浆水平接近正常值，而胰岛素血浆水平没有显著变化。这些观察结果表明，SGLT2抑制剂可能是使高血糖水平正常化的有效药物，高血糖水平与1型和2型糖尿病等疾病相关[11］．

在本研究中，我们假设SGLT2活性的增加可能导致糖尿病期间的高血糖慢性状态，从而导致氧化应激的发展。因此，本研究旨在评估根楝素作为一种葡萄糖钠共转运体抑制剂是否能有效降低链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠肾脏氧化应激的改变。

2.方法

2．1．试剂

链脲佐菌素(STZ)、根吡嗪、黄嘌呤、硝基蓝四唑(NBT)、BSA、黄嘌呤氧化酶、NADPH、谷胱甘肽还原酶(GR)、还原型谷胱甘肽(GSH)购自Sigma (St. Louis, MO, USA)。兔抗3-硝基酪氨酸多克隆抗体来自美国纽约州普莱西德湖。所用的所有其他化学品都是可用的最高分析等级的化学品。

2．2.实验设计

取10 ~ 14周龄雄性成年Wistar大鼠，体重250 ~ 300 g。将动物随机分为4组:对照组(C组)、糖尿病组(D组)、根楝素治疗组(DP组)和胰岛素治疗组(DI组)。单次给予溶解在枸橼酸缓冲液(0.1 M, pH 4.5)中的STZ (50 mg/kg i.p)诱导糖尿病。对照组给予等量柠檬酸缓冲液。

STZ给药72 h后，测定血糖浓度(Accu-Chek传感器舒适，罗氏诊断)，只有超过20.0 mmol/L的大鼠被认为是糖尿病进行进一步研究。

根皮苷(0.4 g/kg/天/4周，20%丙二醇溶液，s.c.)皮下注射，等分剂量，每隔12小时给药，以确保持续抑制肾小管葡萄糖再吸收。

胰岛素治疗给予i.p. (Humulin;礼来公司，印第安纳波利斯，IN)。胰岛素初始剂量为6iu，随后根据早晨血糖值8 - 10iu给予。

糖尿病确诊后，开始治疗并持续30天。所有试验组均维持实验室饲粮和水随意。

给药30 d后，在代谢笼中收集尿液样本(24 h);尿液变量测量为利尿和葡萄糖(IL 300 +，临床化学分析仪)。随后用戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉所有动物。肾脏被灌注后迅速取出。分离脑皮层和髓质，用液氮浸泡后测定酶活性。部分肾脏置于4%多聚甲醛中进行亚硝化应激分析，通过免疫组化分析3-硝基酪氨酸修饰蛋白来测定。

所有动物手术都是按照墨西哥联邦动物实验和护理条例(NOM-062-ZOO-2001)进行的，并得到了国家研究所Cardiología“伊格纳西奥Chávez”的生物伦理学和调查委员会的批准。

2．3.氧化应激的评估

2.3.1。肾组织制备

皮质和髓质用冰售生理盐水彻底冲洗，10% (w/v);每个组织分别在Potter Elvehjem均质器中均质，并置于pH 7.4、含有哺乳动物蛋白酶抑制剂鸡尾酒的50 mM冰冻磷酸盐缓冲液中。匀浆于10000 ×g在4°C下离心30分钟。上清液用于测定酶活性。部分上清液用Bradford法测定总蛋白浓度[12以牛血清白蛋白为标准。

2.3.2。过氧化氢酶试验

在25°C条件下，用Aebi法测定肾过氧化氢酶(CAT)活性₂O₂从含30 mmol/L H的溶液中提取₂O₂10 mmol/L磷酸钾缓冲液(pH 7)13］．结果以U/mL/min表达。

2.3.3。谷胱甘肽过氧化物酶测定

肾谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性的评估方法已在前面描述[14］．结果以U/mL/min表达。

2.3.4。超氧化物歧化酶测定

肾脏匀浆中的超氧化物歧化酶(SOD)活性是通过竞争抑制试验测定的，使用黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶系统降低NBT，这是以前报道过的方法[15］．结果以U/mg蛋白表达。

2.3.5。3-硝基酪氨酸(3-NT)的免疫组化定位

免疫组化:石蜡包埋的肾组织切片(5μM)，并转移到带正电的载玻片。样品经H₂O₂(4.5%)熄灭/抑制内源性过氧化物酶。封闭后，切片与抗3- nt抗体(Upstate Biotechnology Inc.， Lake Placid, NY)在室温下反应1小时。用PBS大量洗涤后，用偶联的抗体过氧化物酶孵育1小时，最后用二氨基联苯胺孵育30分钟。使用图像分析软件(image - pro Plus 6.0, Media Cybernetics Inc, Bethesda, Maryland, MD, USA)进行定量图像分析。该软件确定选定组织区域的密度平均值。因此，随机选取10个野/鼠，测定3-NT免疫染色强度。

2．4．统计数据

数据以平均数表示扫描电镜。数据采用非配对分析-检验或方差分析，然后由Bonferroni进行多重比较-测试，如适用(Prism 3.0;GraphPad Software, San Diego, CA, USA)。假设有统计学意义．

3.结果

3．1.动物的特征

stz诱导的糖尿病导致血糖浓度、利尿和糖尿显著升高，体重显著下降(表)1)．

治疗30天后，根楝素降低了糖尿病大鼠的血糖水平;然而，明显的利尿、糖尿和低体重仍然存在1)．与未治疗的糖尿病大鼠相比，胰岛素治疗导致糖尿病大鼠体重显著增加。此外，胰岛素治疗可完全逆转高血糖、利尿和糖尿(见表)1)．

３．２．氧化应激的评估

3.2.1之上。肾脏抗氧化酶活性

测定糖尿病大鼠、根皮苷处理大鼠、胰岛素处理大鼠和对照组大鼠皮层和髓质中抗氧化酶CAT、GPx和总SOD活性。

数据1来3.显示糖尿病大鼠皮层和髓质中CAT活性降低(图)1(一)和1 (b))，而GPx水平较对照组升高(图2(一个)和2 (b))．有趣的是，根皮苷或胰岛素治疗可使皮质和髓质中CAT和GPX酶活性恢复到正常水平(图)1和2)．皮层和髓质中SOD活性在四组中相似(图)3(一个)和3 (b))．

3.2.2。3-硝基酪氨酸(3-NT)的免疫组化定位

3-NT水平在糖尿病大鼠中显著升高(图4(一)和4 (b))．根皮苷或胰岛素治疗能够将氧化损伤逆转到正常水平。这些结果表明，糖尿病大鼠肾脏蛋白质酪氨酸硝化增强，控制血糖能够预防这些高血糖引起的影响。

4.讨论

在本研究中，糖尿病诱导后肾脏氧化应激显著增加，表现为CAT活性低，而GPx增加;糖尿病大鼠皮质和髓质硝基酪氨酸水平升高。4周的根皮苷治疗可恢复血糖水平、酶活性和硝基酪氨酸水平。这些影响未对代谢控制产生任何影响。胰岛素治疗可防止糖尿病引起的代谢紊乱失调的正常化。

ROS形成增多和糖尿病肾病可能发生在糖尿病中，可能与血浆、组织和肾细胞内葡萄糖水平升高有关[2，16，17］．在控制不良的糖尿病患者中，高的近端葡萄糖管浓度可能会导致过量的葡萄糖、钠和水的再吸收，这可能是由钠活性增强介导的⁺葡萄糖转运蛋白(SGLT);这可能会导致糖尿病并发症的发生[3.，6- - - - - -8，18- - - - - -20.］．本研究的主要目的是研究根皮苷(SGLT2抑制剂)对糖尿病大鼠氧化应激的影响。因此，我们检测了对照组、糖尿病大鼠、根皮苷治疗糖尿病大鼠和胰岛素治疗糖尿病大鼠皮质和髓质中抗氧化酶活性和酪氨酸硝化的变化。

stz诱导的一个月的糖尿病导致皮质和髓质CAT活性降低。相比之下，糖尿病大鼠皮质和髓质中GPx活性增加，保护细胞和组织损伤。肾皮质中GPx的升高和CAT活性的降低表明不同抗氧化酶在氧化应激反应中的代偿机制。

虽然Cu/Zn SOD mRNA在糖尿病大鼠全肾中被显著诱导[21，无论是皮质还是髓质，我们都没有发现总SOD活性的任何变化。然而，我们不排除糖尿病改变Cu-Zn SOD或Mn SOD活性的可能性。

通过stz诱导的糖尿病大鼠肾脏中脂质过氧化物和8-羟基脱氧鸟苷水平的升高，表明了过度氧化应激在糖尿病肾病中的功能和病理生理作用[22，23］．这些观察缺乏在皮质或髓质中存在氧化应激的直接证据，可能反映了糖尿病肾损害的常见后果。在这里，我们通过两种方法提供了氧化应激在皮质和髓质中存在的证据，酶活性测量和3-NT免疫染色，这已经被用来估计氮反应物种的形成。

过氧亚硝酸盐，由超氧化物和一氧化氮(NO)反应形成，修饰蛋白质中的酪氨酸形成硝基酪氨酸，这种稳定的终产物参与线粒体和胞质蛋白质的失活，导致细胞成分的损伤[24］．我们的研究结果表明，糖尿病与皮质和髓质中酪氨酸硝化增加有关，这与之前在糖尿病患者和实验模型中进行的研究一致[25- - - - - -28］．目前尚不清楚硝基酪氨酸是否仅仅是no诱导的氧化剂氧化应激的标志，还是它是否足以改变蛋白质结构，导致酶、受体或信号功能异常。根皮苷治疗糖尿病动物可降低皮质和髓质的硝基酪氨酸染色，与其预防高血糖和恢复抗氧化酶活性的作用一致。这些数据也在胰岛素治疗中得到了证实。

在以往的研究中，根楝素治疗糖尿病大鼠已被证明可以使血糖、血压、蛋白尿和高滤过正常[7，11，29］．以前有报道说根皮苷治疗会增加糖尿[29];然而，在这项研究中，我们未能观察到这些影响。

在本研究中，根皮苷和胰岛素处理在预防糖尿病大鼠CAT活性下降、GPX活性和硝基酪氨酸水平升高方面几乎同样有效。我们的数据清楚地表明，SGLT2参与了糖尿病期间氧化应激的发展。我们推测根皮苷可能抑制SGLT2的活性在活的有机体内．这意味着根皮苷治疗可以减少葡萄糖的再吸收，从而降低高血糖，从而降低酶的糖基化或可能减少活性氧自由基的形成，提高抗氧化酶的活性。

执行了这种方法获得的结果在体外和在活的有机体内提示抑制SGLT2可能用于糖尿病患者，通过抑制SGLT2活性来缓解糖尿病引起的功能障碍，降低氧化应激。

之前，我们已经证明了糖尿病和高血压大鼠皮质中SGLT2活性和表达的增加[6，7］．有人认为，SGLT2诱导的结果不仅代表了在不同滤过率下调节经瘤糖重吸收的反应，而且还在肾损伤中发挥了积极的作用，如氧化应激、糖尿病肾病、高血压和钠⁺再吸收。因此，SGLT2抑制剂可能是潜在的抗糖尿病药物[9- - - - - -11，30.- - - - - -32通过特异性地减轻细胞上皮内葡萄糖通量而具有重肾保护作用[32]，这可能会防止一些导致糖尿病肾病并发症的细胞机制[32］．

综上所述，我们的证据表明，SGLT2抑制可以预防糖尿病大鼠肾脏的氧化和硝化应激，这与血糖控制有显著关系。此外，我们的数据证实，早期持续积极治疗血糖是重要的，以避免未来并发症。

利益冲突

没有利益冲突。

致谢

该项目得到了墨西哥科学技术委员会(CONACYT)、H. Osorio博士155604研究拨款以及Fondos del Gasto Directo autoizado a la Subdirección de Investigación Básica INC“Ignacio Chávez”的支持。半径标注。Claudia Rangel-Barajas对这篇论文进行了批判性的修改。

参考文献

1. H. Shamoon, H. Duffy, N. Fleischer等，“糖尿病强化治疗对胰岛素依赖型糖尿病长期并发症发展和进展的影响，”新英格兰医学杂志第329卷第2期14，第977-986页，1993。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. S. P. Bagby，“糖尿病肾病和近端小管ROS:挑战我们的肾小球中心性，”肾脏国际，第71卷，第71期12，页1199-1202,2007。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. V. Vallon， <糖尿病肾脏病理生理学中的近端小管>美国生理学杂志，第300卷，第2期5, pp. R1009-R1022, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. M. C. Garg, S. Ojha, D. D. Bansal，《链脲佐菌素糖尿病大鼠的抗氧化状态》印度实验生物学杂志第34卷第3期3，页264-266,1996。视图:谷歌学术搜索
5. H. Ha和H. B. Lee，“活性氧增强高糖和糖尿病肾脏培养的肾细胞中的葡萄糖信号”，肾脏学， vol. 10, supplement 2, pp. S7-S10, 2005。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. H. Osorio, R. Bautista, A. Rios, M. Franco, J. Santamaría, B. Escalante，“氯沙坦治疗对高血压糖尿病大鼠盐敏感性和SGLT2表达的影响”，糖尿病研究与临床实践，第86卷，第86期3，页46 - 49,2009。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. H. Osorio, R. Bautista, A. Rios等，“根苷对糖尿病大鼠肾脏中SGLT2表达的影响”，肾脏学杂志》，第23卷，第2期。5，页541-546,2010。视图:谷歌学术搜索
8. H. Osorio, I. Coronel, A. Arellano, M. Franco, B. Escalante，和R. Bautista，“熊去氧胆酸降低钠-葡萄糖共转运体(SGLT2)的表达和氧化应激在糖尿病大鼠肾脏中，”糖尿病研究与临床实践第97卷第1期2, pp. 276-282, 2012。视图:谷歌学术搜索
9. T. Asano, M. Anai, H. Sakoda等，“SGLT作为治疗靶点”，未来的药物，第29卷，第2期5, 2004。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. A. L. Handlon，“钠葡萄糖共转运体2 (SGLT2)抑制剂作为潜在的抗糖尿病药物”，对治疗性专利的专家意见，第15卷，第5期。11, pp. 1531-1540, 2005。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. S. W. Janssen, G. J. Martens, C. G. Sweep, P. N. Span, A. A. J. Verhofstad，和A. R. M. Hermus，“在Zucker糖尿病脂肪大鼠衰老期间，根皮苷治疗可防止血浆胰岛素水平的下降，但不能防止胰岛的组织病理学变化的进展，”内分泌学研究杂志第26卷第2期6、2003年。视图:谷歌学术搜索
12. M. M. Bradford，“利用蛋白质染料结合原理的一种快速、灵敏的微量蛋白质定量方法”，分析生物化学第72卷第2期1-2，页248-254,1976。视图:谷歌学术搜索
13. H. Aebi， "体外过氧化氢酶"方法酶学，第105卷，第121-126页，1984。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. R. A. Lawrence和R. F. Burk，“缺乏硒的大鼠肝脏中的谷胱甘肽过氧化物酶活性”，生物化学与生物物理研究通讯，第71卷，第71期4，第952-958页，1976。视图:谷歌学术搜索
15. “超氧化物歧化酶的一种简单的临床检测方法”，孙勇，L. W. Oberley，李勇，“一种简单的临床检测超氧化物歧化酶的方法”，临床化学第34卷第3期3，页497 - 500,1988。视图:谷歌学术搜索
16. 糖尿病并发症的生物化学和分子细胞生物学自然，第414卷，第2期。第6页，第8 - 8页，2001。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. H. Ha和K. H. Kim，《糖尿病肾病的发病机制:氧化应激和蛋白激酶C的作用》，糖尿病研究与临床实践第45卷第5期2-3，页147 - 151,1999。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. R. E. Gilbert和M. E. Cooper，“进行性糖尿病肾病的肾小管间质:比肾小球损伤的后果更严重?”肾脏国际第56期5、1999年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. N. Bank和H. S. Aynedjian，“在正常和糖尿病大鼠中，腔内葡萄糖的进行性增加刺激近端钠吸收，”临床研究杂志，第86卷，第86期1，页309 - 316,1990。视图:谷歌学术搜索
20. W. T. Noonan, V. M. Shapiro, R. O. Banks，“雌性链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠高渗糖输注过程中肾脏葡萄糖的再吸收”生命科学第68卷第2期26，页2967 - 2977,2001。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. L. A. Sechi, A. Ceriello, C. A. Griffin等，“实验性糖尿病大鼠肾脏抗氧化酶mRNA水平升高”，Diabetologia，第40卷，第5期。1，第23-29页，1997。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. K. Horie, T. Miyata, K. Maeda等，“糖化产物和脂质过氧化产物在糖尿病肾小球病变中的免疫组化共定位。糖氧化应激在糖尿病肾病发病机制中的意义临床研究杂志号，第100卷。12, pp. 2995-3004, 1997。视图:谷歌学术搜索
23. H. Ha, C. Kim, Y. Son, M. H. Chung, K. H. Kim，“显示微量白蛋白尿的糖尿病大鼠肾脏的DNA损伤，”自由基生物学与医学，第16卷，第5期。2，第271-274页，1994。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. B. Halliwell，“什么会硝化酪氨酸?”硝基酪氨酸作为体内过氧亚硝酸盐形成的生物标志物是特异性的吗?2月的信第411卷第4期2-3，页157-160,1997。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. P. Pacher, I. Obrosova, J. Mabley，和C. Szabó，“亚硝化应激和过氧亚硝酸盐在糖尿病并发症发病机制中的作用:新兴的治疗策略，”当前药物化学，第12卷，第2期3，页267-275,2005。视图:谷歌学术搜索
26. N. Ishii, K. P. Patel, P. H. Lane等，“糖尿病大鼠肾皮质一氧化氮合成和氧化应激”，美国肾脏学会杂志，第12卷，第2期8，页1630-1639,2001。视图:谷歌学术搜索
27. M. L. Onozato, A. Tojo, A. Goto, T. Fujita, C. S. Wilcox，“大鼠糖尿病肾病的氧化应激和一氧化氮合酶:ACEI和ARB的影响”，肾脏国际第61卷第1期1，页186-194,2002。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
28. R. C. Thuraisingham, C. A. Nott, S. M. Dodd，和M. M. Yaqoob，“糖尿病肾病患者肾脏硝基酪氨酸染色增加”，肾脏国际(第57卷)第5页，1968-1972,2000。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. S. Malatiali, I. Francis，和N. M. Barac，“根皮苷可预防糖尿病大鼠肾小球高滤过，但不能防止肥厚，”实验性糖尿病研究， 2008年第4期，文章编号305403,7页，2008。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
30. T. Adachi, K. Yasuda, Y. Okamoto et al.， " T-1095, A renal Na⁺-葡萄糖转运蛋白抑制剂可改善链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠的高血糖。新陈代谢，第49卷，第49期。8，页990 - 955,2000。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
31. A. Oku, K. Ueta, K. Arakawa等，“T-1095，肾脏钠的抑制剂⁺-葡萄糖共转运体可能提供一种治疗糖尿病的新方法，”糖尿病，第48卷，第48期第9页，1794 - 1800,1999。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
32. K. Arakawa, T. Ishihara, A. Oku等，“通过口服Na改善C57BL/KsJ-db/db小鼠的糖尿病综合征⁺-葡萄糖共转运蛋白抑制剂T-1095英国药理学杂志第132卷第1期2，页578-586,2001。视图:谷歌学术搜索

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