文摘
花青素的health-promoted好处,包括血管保护作用和antiatherogenic属性,现在已被公认,但涉及的分子机制尚未阐明。按照我们以前的工作在cytoprotective一些花青素细胞凋亡机制由过氧硝酸盐在内皮细胞,在这里,我们调查malvidin-3-glucoside的保护作用,主要饮食花青素,这样有害的过程,通过探索干扰细胞活性物种形成和凋亡的线粒体途径。预培养的细胞与25μ从peroxynitrite-promoted M malvidin-3-glucoside有效保护内皮细胞凋亡死亡,影响可能是介导的细胞后能够减少活性物种的形成侵略,作为评估二乙酸dichlorodihydrofluorescein化验和羰基化合物的形成。此外,由过氧亚硝基malvidin-3-glucoside抑制线粒体凋亡信号通路诱导,通过抵消线粒体膜去极化,caspase-3和9的激活,增加proapoptotic Bax蛋白的表达。总之,我们的数据扩展我们的知识分子机制提供的血管保护malvidin-3-glucoside,和花青素,内皮功能障碍的预防和动脉粥样硬化。
1。介绍
在过去的十年中,在科学知识有显著增加花青素的有益作用,一大群黄酮类化合物广泛分布在人类饮食,在几个oxidative-stress-related疾病,包括动脉粥样硬化(1,2]。动脉粥样硬化、心血管疾病的主要原因,是一种多因素疾病,内皮功能障碍和炎症中起着重要作用[3,4]。过氧亚硝基被公认为一个相关的动脉粥样化形成的干预因素,作为一个强大的内生几个生物分子的氧化和硝化的物种。它是由扩散限制的反应一氧化氮(NO)和超氧化物阴离子之间由免疫系统细胞和血管细胞(5- - - - - -7]。这个反应有一个最高的速率常数以反应没有,证明在某些浓度(过氧亚硝基的毒性8]。这种活性物种确实可以达到高浓度血管内皮在剪切应力和动脉粥样硬化血管,有人建议推广,尤其是低密度脂蛋白氧化和广泛的蛋白质酪氨酸残基硝化(9,10),导致生产和后续的动脉粥样硬化斑块形成的脂质条纹。然而,过氧硝酸盐可能参与动脉粥样化形成由其他途径,主要通过促进血管反应性的损伤和破坏重要的细胞过程导致细胞凋亡或坏死(11,12]。因此,抵消过氧亚硝基破坏性影响内皮完整性至关重要,和花青素已经展示了他们高peroxynitrite-scavenging活动,在几项研究[13- - - - - -15]。
流行病学研究已经证明,富含蔬菜和水果的风险减少心血管疾病(16,17)和一些主要的贡献者是花青素的摄入量已经估计到9倍高于其他饮食类黄酮(16,17]。饮食中花青素,malvidin-3-glucoside (Mv3glc)是主要成分之一,特别是在红酒18]。尽管争论可用生理浓度的花青素,这是毫无疑问的数据显示,他们沉浸在完整的配糖体形式,包括Mv3glc,摄入后迅速出现在血浆和组织(19,20.]。此外,潜在的在活的有机体内累积效应也应考虑。因此,最近,花青素被认为是有前途的生物活性分子(21]在寻找潜在的功能食品和保健品,主要在预防动脉粥样硬化(1,22]。
虽然在早期研究花青素的生物活性密切相关的抗氧化性能,主要归因于b环羟基和共轭双键系统(23),其抗炎和antiatherogenic效果,在其他几个人,不能完全解释这些属性的基础。在这种背景下,有大量的工作,表示这些属性之外的其他行动机制,即通过干扰关键信号通路和基因调控24,25]。
最近,我们已经表明,花青素具有catecholic或monophenolic结构能够抵消peroxynitrite-induced通过抑制内皮细胞凋亡的关键信号级联,上游和下游的线粒体14]。这项工作后,我们澄清了cytoprotective Mv3glc机制,花青素和3′,5′-dimethoxyl取代基在b环(图1),提供新的见解的潜在作用这一特性调制凋亡的线粒体信号通路。事实上,不同的羟基化和methoxylation模式,主要是b环上,已知调制多酚的抗氧化性能26,27),因此也可以解释他们对内皮细胞的保护作用下过氧亚硝基受伤,这一过程涉及到生产的活性物种,这可能是直接或间接调节细胞信号级联。因此,除了Mv3glc的抗氧化活性,我们评估其能力抵消peroxynitrite-induced凋亡影响干涉线粒体凋亡信号级联,在牛动脉内皮细胞的主要文化(BAECs)作为一个典型的内皮细胞模型。这项工作表明,预培养的细胞与25M Mv3glc阻止几个凋亡事件,如线粒体膜电位的损失,caspases-9和3激活,和增加cytoplasmatic伯灵顿的水平,抑制过氧亚硝基细胞损伤,影响部分由其清除活性物种的能力造成细胞氧化侵略。
2。材料和方法
2.1。试剂
二甲花翠素3 -o- - - - - -β氯化葡萄糖苷纯化从自然资源,获得Extrasynthese (Genay、法国)。Mv3glc纯度97%以上以高效液相色谱法,用于解决方案(5毫米)在DMSO和存储在黑暗中,在氮气气氛下,在−80°C;最后溶剂浓度不超过1%。槲皮素是Sigma-Aldrich有限公司
实验室化学物质,即dihydrorhodamine 123 (DHR 123)、二甲亚砜(DMSO)、十二烷基硫酸钠(SDS)、3 - (4 5-dimethylthiazol-2yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT),胶原酶、明胶、33258年宏彻,基质为caspase-3 (Ac-DEVD-AMC) caspase-9 (Ac-LEDH-AFC), 2′, 7′二乙酸-dichlorodihydrofluorescein (DCFHDA)、青霉素和链霉素/买来Sigma-Aldrich有限公司以及其他化学试剂使用。
细胞培养,杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM),胰蛋白酶0.25%胎牛血清(的边后卫)和磷酸盐(PBS) pH值7.4从Gibco-Invitrogen获得。
主要具体的鼠单克隆抗体伯灵顿和anti-mouse免疫球蛋白二次抗体来源于Abcam(英国剑桥);鼠单克隆抗体β肌动蛋白是从Sigma-Aldrich有限公司购买
2.2。牛主动脉内皮细胞的主要文化
牛主动脉内皮细胞(BAECs)获得从胸主动脉胶原酶治疗(2毫克/毫升)。细胞培养在gelatin-coated(0.2%)组织培养塑料(牛的起源,Sigma-Aldrich有限公司),在DMEM补充10%热灭活的边后卫,100 U /毫升青霉素,100g / mL链霉素在37°C调湿大气的5%。内皮细胞,被他们的鹅卵石形态、亚文化之间的融合和使用第四和第十章节。在每个实验之前,细胞融合80%采用无血清饥饿至少6小时。
2.3。过氧亚硝基的细胞合成和过氧硝酸盐治疗
过氧亚硝基使用淬火流动反应器合成,如前所述[9]。获得过氧亚硝基然后储存在−80°C下N2的气氛。立即使用前,它一直是量化的吸光度在1 M氢氧化钠(302海里米−1厘米−1)。
过氧亚硝基治疗BAECs执行我们之前的描述(14,28]。简单地说,ONOO−稀释在最近准备的氢氧化钠10毫米,交付给最终的浓度500米)作为一个单一的丸,对包含细胞培养板的一侧之前清洗和平衡与PBS钙和镁,pH值7.4,快速旋转中,以确保均匀接触ONOO−在分解。10分钟后,细胞被轻轻地用PBS,取而代之的是没有血清DMEM所需时间。PBS是用来避免ONOO干扰反应−培养基成分。没有观察到的pH值变化在此治疗。相同量的10毫米氢氧化钠(车辆控制)或分解过氧亚硝基(ONOO−在PBS分解或在10毫米氢氧化钠隔夜)被用作控制。与Mv3glc实验,细胞与这种化合物preincubated 14 h,经过这一次孵化中摘除和ONOO细胞被提交−侵略,如上所述。因此,在这些化验,期间没有出现在培养基Mv3glc ONOO的实验−。
2.4。细胞生存能力测试
细胞生存能力评估了mitochondrial-dependent减少3 - (4 5-dimethylthiazol-2yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)甲瓒,报道(29日]。孵化后Mv3glc的浓度表示,14 h,细胞6-well板(细胞/)和PBS洗和孵化与MTT(0.5毫克/毫升)1 h,在37°C,在黑暗中,在新的无血清培养基。删除中之后,甲瓒晶体溶解在DMSO (300L),麻省理工的降低程度量化的测量吸光度在550 nm协同HT板读者。控制细胞的结果表示为一个百分比。
2.5。细胞形态学核
细胞细胞核的形态学观察到荧光显微镜使用cell-permeable dna结合蛋白荧光染料赫斯特33258年。简而言之,peroxynitrite-treated细胞被固定为4% (w / v)多聚甲醛10分钟,在室温下,随后沾染了赫斯特33258 (5g / mL) 10分钟,在相同温度下,用PBS洗净,和安装使用PBS:甘油(3:1,v / v)。核形态变化可视化在倒置荧光显微镜(蔡司Axiovert 40)与蔡司DAPI过滤器。细胞染色质凝结核碎片被认为是凋亡,与正常细胞相比呈现均匀染色细胞核。细胞至少9个随机选择显微镜领域(400 x) /样本统计,凋亡细胞的数量表示为一个细胞总数的百分比。
2.6。Dihydrorhodamine荧光分析
的在体外具体Mv3glc清除过氧亚硝基的能力被抑制评估peroxynitrite-mediated dihydrorhodamine 123 (DHR123)氧化罗丹明123年,紧随其后的是荧光下降,正如前面所描述的Kooy et al。30.与一些细微的修改。Mv3glc原液(5毫米)和DHR123(5.78毫米原液)溶解在DMSO和储存在氮气气氛下−80°C。工作解决方案准备每天在磷酸盐水缓冲pH值7.4(50毫米Na2HPO45毫米氯化钾、90毫米氯化钠和100米二乙三胺五醋酸)。简单地说,25添加了M DHR123盐水与100年磷酸盐缓冲剂二乙三胺五醋酸,在37°C,包含Mv3glc (2 - 10添加过氧亚硝基(1.2米),和之后M氢氧化钠0.1 M),氧化DHR123的荧光强度是衡量在一个优秀的LS 50 b荧光谱仪,在37°C thermostatized试管与磁力搅拌,激发和发射波长的500和536海里(2.5和3.0)狭缝宽度,分别。结果是用百分比来表示控制(DHR123加上ONOO−)。分解在缓冲区没有氧化DHR123。过氧亚硝基槲皮素化合物被用作参考。
2.7。评价细胞内活性物种和羰基的形成
细胞内活性物种评估使用nonfluorescent探针2′,7′二乙酸-dichlorodihydrofluorescein (DCFHDA),穿透细胞膜和可能被活性氧化物种,产生荧光2′,7′二氯荧光素(DCF),基本上如前所述[31日,32]。简单地说,细胞在24-well板(细胞/ 25)曾有或没有孵化M Mv3glc并进一步提交above-referred治疗与过氧亚硝基和孵化6 h。然后,年底前20分钟,每小时和2细胞被孵化在无血清DMEM M DCFHDA准备,37°C,在黑暗中;洗后与PBS的细胞,他们保持在无血清DMEM然后观察到荧光显微镜(蔡司Axiovert 40)。此外,荧光强度测量得到的协同HT板读者(Bio-Tek仪器)(激发和发射波长在485和530海里,职责)。结果表示为荧光强度(任意单位)。
peroxynitrite-promoted细胞氧化反应也跟着的羰基形成。治疗细胞细胞溶解在哈佛商学院缓冲补充1%的蛋白酶抑制剂鸡尾酒,pH值7.5冰。5周期后的液体N2/ 37°C水浴溶解产物在15000 g离心20分钟在4°C,和上层清液(总提取物)被收集并存储在−20°C。蛋白质浓度测定使用Bio-Rad蛋白质分析工具包(美国Bio-Rad),根据布拉德福德的反应。
羰基含量测定在重复使用已建立的比色测定(33]。简单地说,800年与500年g蛋白的孵化L 0.2%的2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH)盐酸(2 N) 1 h在黑暗中,单独使用盐酸2 N和空白准备。样品和空白被沉淀的同等体积的20%三氯乙酸和离心5分钟10000克、4°C。上层清液被丢弃和球团提交三次10分钟用1毫升乙醇:乙酸乙酯(1:1 v / v),涡流的过程中每3分钟。样本然后离心机在10000 g为3分钟,4°C。最后一个球被resuspended guanidine-HCl 0.5毫升的6米,和羰基含量取决于测量吸光度腙的370海里。结果计算摩尔羰基/毫克蛋白使用22000 M的消光系数−1厘米−1。
2.8。线粒体膜电位的测量
线粒体膜电位的测量是由加载细胞荧光探针5、5′,6′6 -tetrachloro-1, 1′, 3、3′-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine碘(JC-1) membrane-permeable阳离子荧光团,积累在线粒体potential-dependent方式,转变其可视化的荧光发射从绿色(525 nm)红色(590海里)(34]。细胞被preincubated Mv3glc和过氧亚硝基如上所述处理;在指定的时候,上层清液被移除和细胞被贴上JC-1 (2在37°C、g / mL) 20分钟。进一步,与PBS洗涤后,细胞在一个可视化倒置荧光显微镜(蔡司Axiovert 40) FITC滤波器组。在不同的实验中,J聚合物的荧光强度之间的比率,在线粒体(励磁550海里,发射600海里),和单体留在细胞质(励磁485海里,发射535海里)被用来获得红/绿荧光比率。荧光强度测量在一个协同HT标仪(美国BioTek仪器公司)。
2.9。还存在测量活动
半胱天冬酶激活是评估,从本质上讲,正如前面所描述的布里托等。12),在胞质蛋白提取。与过氧亚硝基细胞孵化后,有或没有花青素,如上所述,细胞被洗与PBS然后取消在冰上裂解缓冲包含1毫米ethylenediaminetetracetic酸钠(Na-EDTA) MgCl 1毫米Na-EGTA, 2毫米26小时2啊,25毫米玫瑰(pH值7.5)补充0.1%的家伙,100毫米PMSF, 2毫米德勤,1% (v / v)蛋白酶抑制剂鸡尾酒。5的冻融循环后液体N2和37°C水浴溶解产物在14000 g细胞离心10分钟在4°C和收集到的上层清液储存在−80°C。
25的测定酶的活动g缓冲溶液溶解产物蛋白质的反应(25毫米玫瑰,pH值7.5补充0.1%的皮套裤,5毫米德勤,PMSF和100毫米)。的反应是由添加足够的fluorogenic基质(100米)包含特定的乳沟网站,与荧光染料:Ac-DEVD-AMC caspase-3-like活动和Ac-LEDH-AFC caspase-9-like活动。孵化后150分钟37°C, AMC和亚足联的释放是由荧光测量在380/460或400/505 nm(激发/发射),分别在一个协同HT微型板块读者。还存在活动表示为一个百分比的控制,也就是说,没有过氧亚硝基和花青素细胞孵化。
2.10。免疫印迹分析
蛋白表达是评估通过免疫印迹,是描述(14]。从细胞溶解细胞胞质蛋白提取得到解决方案包含300年准备L(10毫米Tris-HCl MgCl氯化钠10毫米,3毫米2,0.5%诺乃清洁剂p 40, 1%的蛋白酶抑制剂鸡尾酒,pH值7.5,10分钟在冰上。在5000转离心5分钟后在4°C,上层清液的收集和储存在−20°C。蛋白质浓度测定使用Bio-Rad蛋白质分析工具包(美国Bio-Rad),根据布拉德福德的反应。
30微克的减少和变性总蛋白提取分离SDS /页面[10% (v / v)]和转移到聚乙二烯二氟化物(PVDF)膜由electroblotting(英国Amersham生物科学)。细胞膜被封锁在TBS缓冲用脱脂牛奶补充了0.1% (v / v)渐变20 (TBS-T: 20 mM Tris-HCl, 150毫米氯化钠,0.1%渐变),然后用抗体探测伯灵顿2 h,在室温下。与TBS-T大量泥沙后,屁股被孵化的碱性phosphatase-conjugated二级抗体1 h,在室温下。免疫反应性的复合体被检测到chemifluorescence墨迹博览会后增强chemifluorescent试剂(Amersham生物科学)9000年台风扫描仪(Amersham生物科学)。肌动蛋白被用作控制加载在细胞质中提取蛋白质。分析了乐队使用ImageQuant TM Amersham生物科学的软件。
2.11。统计分析
所有数据都表示为±SEM手段至少3独立的分析,每一个一式两份。组间差异分析单向方差分析(方差分析),Bonferroni,图基,或学生测试使用。的值被接受为显著。
3所示。结果
3.1。对Peroxynitrite-Mediated保护内皮细胞凋亡
同意我们的先前的报道(12,14),过氧硝酸盐在此实验条件下,诱导凋亡死亡在牛主动脉内皮细胞(图2(一个)之前),一个过程显著降低细胞内与Mv3glc孵化。事实上,这一数字,证明过氧亚硝基细胞治疗,6小时后细胞孵化,节中描述2,导致约30%的凋亡细胞,作为评估核凝结或碎片可视化赫斯特染色,而未经处理的细胞中没有检测到这些特性(少于2%)。减少约70%的凋亡细胞与25 preincubated细胞中观察到M Mv3glc ONOO之前−侵略,类似的结果同其他的花青素。在这个浓度,在所有的经验期间,Mv3glc本身不会影响到内皮细胞生存能力和防止peroxynitrite-induced细胞生存能力下降,MTT测试评估(图2 (b))。值得注意的是,花青素是没有出现在中过氧硝酸盐治疗期间和之后,在潜伏期后,完整的内皮细胞中检测出Mv3glc (3 nmol /毫克蛋白),所评估的高效液相色谱(结果未显示)。
(一)
(b)
3.2。过氧亚硝基Malvidin-3-Glucoside清除活动
众所周知,甲氧基,羟基取代基的b环malvidin-3-glucoside实现向激进的花青素高活性物种,尽管其作为生理抗氧化问题由于中性条件下可能的不稳定和未知的细胞浓度(22]。这种化合物的能力清除过氧亚硝基,与参考抗氧化剂相比,槲皮素,以前评估在颗粒模型系统中,在抑制dihydrorhodamine氧化促进活性物种。
如图3Mv3glc在非常低的浓度(2 - 10米)强烈降低的百分比peroxynitrite-mediated DHR123氧化,揭示高容量的这类黄酮清除过氧硝酸盐浓度的方法。它提供了一个相对较低的集成电路50值(2.9米),与槲皮素(IC50值为1.12米),一个著名的参考具有高过氧亚硝基化合物清除活动。使用碳酸氢盐在IC分析缓冲区没有显著改变50结果值(没有显示)。
3.3。抑制细胞内活性物种的形成和羰基化合物在过氧亚硝基侵略
Mv3glc在peroxynitrite-induced氧化应激的影响内皮细胞也被评估的检测二氯荧光素荧光显微法(DCF)形式。这种分析常用来评估细胞生产活性氧化剂的氧化物种由于nonfluorescent极性分子dichlorodihydrofluorescein二乙酸(DCFH-DA)。这种化合物是被动加载到整个细胞,一旦进入,它是由酯酶裂解产生DCFH,可能对DCF由多种活性氧化物种(35];因此,增加光纤荧光细胞活性氧化物种形成的是一个索引,通常在图所示4(一)过氧亚硝基治疗后6 h(孵化。等预期,积极治疗诱导细胞内氧化应激增加,细胞的增加意味着荧光显示,早在3 h的孵化,继续增加6 h,根据动力学分析之前报道(14]。这种荧光在细胞preincubated显著降低25M Mv3glc过氧亚硝基之前,通常在图所示4(一)并提出了图4 (b)在3和6 h(过氧硝酸盐治疗后孵化;在这些时间,减少荧光约37和24%,分别相对于试验与过氧亚硝基刺激,而花青素。
(一)
(b)
(c)
另一方面,蛋白质羰基形成内皮细胞治疗过氧硝酸盐也评估,作为蛋白质氧化和公认的标志是有用的估计过氧硝酸盐氧化损伤程度的蛋白质(36]。在peroxynitrite-mediated内皮细胞损伤,增加约150%的羰基化合物的形成是观察,评估的一般分析与DNPH [37)(图4 (c))。preincubated Mv3glc时,减少发生羰基化合物形成了约70%,指向明显降低细胞蛋白质的氧化损伤。
3.4。抑制Peroxynitrite-Induced线粒体去极化
众所周知,线粒体膜电位的损失是细胞凋亡的一个特点。为了评估是否抑制这一事件占Mv3glc的抗凋亡作用,线粒体膜电位的变化进行评估后加载的细胞荧光探针JC-1以前提交过氧亚硝基的挑战。在细胞线粒体膜电位高,单体的JC-1染料积累在线粒体和骨料,发出红色荧光,但在细胞发生凋亡,线粒体去极化防止JC-1线粒体内的入口。因此,在这些细胞,JC-1仍在细胞质中绿色荧光单体的形成(图5(一个))。结果在本图显示,在提交给过氧亚硝基内皮细胞损伤,一个强大的减少发生在细胞群发射红色荧光伴随着人口的增加与绿色荧光,反映在红/绿荧光比率下降约60%的相对控制,没有过氧亚硝基(图5 (b))。
(一)
(b)
25日的预培养的细胞M Mv3glc之前过氧亚硝基侵略导致这一比率增加30%的过氧亚硝基的控制,表明这种花青素阻止显著peroxynitrite-mediated线粒体膜电位的损失。
3.5。抑制Peroxynitrite-Induced激活Caspases-9和3
相关的线粒体去极化通常的顺序激活caspases-9和3 (38),和以前的数据从我们的实验室已经报道,peroxynitrite-induced内皮细胞凋亡是由激活的还存在(12]。图6与25显示预培养的细胞M Mv3glc几乎完全阻止caspases-9活动并导致caspase-3活动减少60%过氧亚硝基侵略后6 h(孵化。
(一)
(b)
因此,这些研究结果符合一些之前报道表明在我们的实验条件,过氧亚硝基触发凋亡通过线粒体或内在途径,caspases-3和9效应还存在和发起者,分别的细胞死亡级联,表明Mv3glc能够破坏这个途径,抑制细胞凋亡。
3.6。减少Peroxynitrite-Induced伯灵顿的水平
蛋白质的bcl - 2家族建立了mitochondrial-mediated细胞凋亡中发挥着至关重要的作用[39,40]。从我们的实验数据已经表明,过氧硝酸盐本身破坏了细胞内平衡proapoptotic和凋亡蛋白通过增加伯灵顿bcl - 2细胞内水平而不影响的。我们确认过氧硝酸盐没有修改明显bcl - 2的水平,即使在存在Mv3glc(结果未显示)。
相反,伯灵顿表达水平受到强劲增长期间过氧硝酸盐治疗后,达到对患病率控制在4小时的潜伏期(图7)。这样增加明显减少了大约70%的细胞preincubated Mv3glc,第三和第四个小时结束时,在过氧亚硝基受伤。
(一)
(b)
4所示。讨论
在过去的几年,人们越来越感兴趣的饮食花青素主要是由于增加知识的广泛的药理活性,特别是在预防动脉粥样硬化(41,在这些化合物中,Mv3glc是主要成分之一。尽管确切的机制,花青素对健康有益,还不是很清楚,它已经表明,他们抑制不同proatherogenic途径,即增加阻力低密度脂蛋白过氧化反应,调节血小板聚集,促进氮oxide-mediated血管舒张(16,42]。关心粥样硬化过程,过氧硝酸盐是一种有效的生理氧化剂和其发展的一个关键介于其间的,如上面提到。花青素清除过氧亚硝基的能力在体外众所周知,主要是由于他们electrodonating属性和作为硝化(替代基质43]。然而,尽管过去几十年的研究都集中在生物活性之间的相关性和抗氧化性能,其作为重要的细胞介质与干涉信号通路和基因调控是一个重要的研究领域44,45]。因此,按照我们以前的工作(14),在这里,我们探讨了cytoprotective Mv3glc机制在内皮细胞过氧亚硝基侵略。
具体来说,我们证明了Mv3glc,当以前孵化的内皮细胞,能够保护他们免受peroxynitrite-mediated凋亡细胞死亡(图2(一个))揭示潜在的位阻由于其羟基化模式和甲氧基组细胞吸收并不是一个障碍,允许程度的保护类似于其他研究花青素(14]。事实上,Mv3glc合并成内皮细胞在我们的实验条件下,验证了高效液相色谱分析(结果未显示),同意结果之前报道(20.]。
在内皮细胞,Mv3glc中和活性物种的细胞内形成peroxynitrite-mediated侮辱后,评估的DCF化验(图4),按照其清除过氧亚硝基高能力,dihydrorhodamine氧化试验(图中观察到3)。观察到活性物种形成结果的主要细胞侮辱,考虑到增加的过氧亚硝基潜伏期后被取下,仔细洗细胞。此外,Mv3glc中和氧化损伤细胞的能力就是由这样的物种减少peroxynitrite-mediated羰基化合物的形成,最常见的测量产品的蛋白质氧化生物样品(46),70%相对于没有花青素的测定(图4)。蛋白质是破坏的主要目标由于其丰富和快速的反应与广泛的活性物种,都被认为是相关介于其间的在硬化过程中,和蛋白质羰基作为有用的标记的蛋白质氧化的事件报告在体外或在活的有机体内化验。
因此,所提供的保护,对peroxynitrite-mediated Mv3glc损伤内皮细胞可能是部分由其清除活性物种形成的能力由于细胞氧化侵略。这样的细胞活性物种被认为是负责触发几个有害的事件包括mitochondrial-associated细胞凋亡。按照先前的研究从我们的实验室和其他过氧亚硝基,在较低的浓度,通过触发线粒体凋亡通路,而在较高的浓度主要导致细胞坏死(12]。尽管使用过氧硝酸盐的浓度(500米)显然是高,细胞的净暴露这个物种低得多考虑其半衰期短(小于1 s, 37°C, pH值7.4),达到水平更加封闭那些已经估计了在活的有机体内(47]。
实际上,在我们的实验条件,过氧亚硝基侮辱到内皮细胞诱导凋亡细胞死亡,Mv3glc,类似于其他花青素有不同的b环结构,能够抵消这种有害效应的抑制线粒体信号级联至关重要。事实上,由于过氧亚硝基线粒体潜在的损失,所表示的产生的绿色荧光单体的形式的JC-1线粒体外,有效阻止了细胞与Mv3glc预处理,就是明证的增加JC-1聚合线粒体内红色荧光(图5)。这个结果是相关的,鉴于线粒体在调节细胞死亡通路的重要性。此外,Mv3glc证明其有效性在预防caspases-3和9(图的激活6),一个事件参与mitochondrial-mediated凋亡死亡通路。因此,Mv3glc能力干扰凋亡细胞内的信号级联可以从线粒体细胞保护破坏密切相关。
最近,我们已经表明,过氧硝酸盐引起线粒体膜透化作用通过干涉pro -之间的平衡和凋亡bcl - 2家族成员的水平,通过增加伯灵顿bcl - 2水平没有变化,导致伯灵顿/ bcl - 2比例[加薪12,14]。伯灵顿是一种proapoptotic蛋白形成cytoplasmatic与凋亡bcl - 2家族成员形成但当细胞被提交给一个凋亡侮辱它可能遭受线粒体易位,促进外膜透化作用和随后mitochondrial-mediated凋亡途径。类似于其他花青素先前研究,即花青色素、飞燕草色素和pelargonidin-3-glucoside14),Mv3glc能够减少伯灵顿过氧亚硝基刺激引起的细胞内水平(图7),这表明还存在保护作用可能会先于线粒体去极化和激活。此外,Mv3glc中和伯灵顿水平的提高而不影响bcl - 2水平,减少在伯灵顿/ bcl - 2比例发生,赞成和凋亡蛋白恢复平衡。
总之,我们的结果支持Mv3glc的潜在好处,其中一个最普遍的花青素在饮食,作为血管保护剂。很明显,它能保护内皮细胞对peroxynitrite-induced损失抵消活性物种形成和干涉的规定由线粒体凋亡细胞内信号传导机制。潜在的位阻由于其b环替换模式细胞行动不是一个障碍,允许保护配置文件报告类似结构不同的花青素。事实上,尽管o-dihydroxy(儿茶酚)b环的结构,相关的羟基3位置,似乎赋予花青素显著高于一般抗氧化剂和peroxynitrite-scavenging能力(14),所提供的保护,所有的研究化合物,包括monophenolic天竺葵色素和Mv3glc,反对peroxynitrite-induced内皮细胞线粒体凋亡效应并不显著不同。所有的测试花青素显示能力抵消这种效应以类似的方式,通过抑制至关重要的信号级联,表明细胞行为是远远超过他们的抗氧化活性。尽管需要进一步在活的有机体内的研究来证实这些发现,我们的数据与其他由美国支持的机械化之前报道这类膳食营养的健康益处。此外,它也增强了花青素的观点,包括Mv3glc,可以是有前途的分子功能食品和保健品的发展改善内皮功能,在预防动脉粥样硬化。
确认
这项工作得到了菲德尔基金(欧盟),通过国家基金的竞争项目和基础科学和技术(FCT),在项目的范围PTDC SAU-OSM / 102907/2008。j .艰辛的接收方授予SFRH FCT / BD / 31568/2006。