文摘

我们比较格列齐特的影响,抗糖尿病的代理具有抗氧化特性的生化,N-acetyl-L-cysteine (NAC)、谷胱甘肽前体,防止2-deoxy -D核糖(少量)在HIT-T15细胞诱导氧化损伤。用台盼蓝染色和流式细胞术与膜联蛋白V / PI染色,格列齐特治疗轻微扭转dRib-induced细胞死亡和凋亡,和NAC治疗显著降低措施。同样,流式细胞术使用DHR 123染色显示的水平dRib-induced活性氧(ROS)部分地抑制了格列齐特,NAC完全抑制。用电子自旋共振谱,格列齐特和南汽回收芬顿反应产生的羟基自由基类似读学位的系统。南汽,但不是格列齐特,完全恢复少量的细胞内谷胱甘肽耗竭使用monochlorobimane荧光和谷胱甘肽化验。因此,格列齐特治疗抑制dRib-induced HIT-T15细胞氧化损伤更少比南京因为格列齐特没有恢复细胞内谷胱甘肽含量和南京一样有效。此外,细胞内谷胱甘肽的海拔高度而不是自由基清除可能防止dRib-induced氧化损伤的重要机制β细胞线。

1。介绍

胰腺β细胞功能和质量逐渐下降,时间在2型糖尿病患者。氧化应激似乎是原因之一。2-Deoxy -D核糖(少量)是一个功能强大的还原糖,迅速在胰腺癌增加氧化应激和细胞凋亡β肽(1,2]。通过添加这dRib-induced氧化损伤是完全预防N乙酰-l半胱氨酸(NAC),称为谷胱甘肽前体(1]。格列齐特是一种胰岛素促分泌素,属于第二代磺酰脲类。它还具有抗氧化作用,独立于它的降糖效果(3]。在一个在体外研究中,格列齐特显示没有找到直接免费自由基清除效果,在格列本脲4,5]。等离子体氧化应激标记,氧化低密度脂蛋白(LDL)和血小板聚集在gliclazide-treated显著提高糖尿病患者与治疗组相比,与其他磺酰脲类药物(6- - - - - -8]。

我们的研究的目的是探讨格列齐特能否防止dRib-induced氧化损伤胰腺β细胞线。此外,我们试图阐明格列齐特的抗氧化机理,通过比较其效果与南汽dRib-induced氧化应激和细胞凋亡β细胞线。

2。材料和方法

2.1。材料

格列齐特、南汽、dihydrorhodamine 123 (DHR 123)、二甲亚砜(DMSO), 5 5-dimethyl-1-pyrroline-N氧化(DMPO) FeSO₄,和H₂O₂从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。一滴、台盼蓝和monochlorobimane (mBCl)获得Amresco(梭伦,哦,美国)。盐酸和乙醇来自默克(达姆施塔特,德国)。rpmi - 1640,苯酚red-free rpmi - 1640,杜尔贝科的磷酸盐(DPBS),胰蛋白酶,青霉素,链霉素Gibco英杰公司(美国纽约大岛)。胎牛血清(的边后卫)从HyClone(美国UT Logan)。所有文化菜来自BD猎鹰(美国新泽西富兰克林湖)。

2.2。细胞培养

分泌细胞HIT-T15韩国提供的细胞细胞系银行(首尔,韩国)。在rpmi - 1640细胞培养中补充10%的边后卫,100亩/毫升青霉素、链霉素和100毫克/毫升。文化是维持在37°C湿润有限公司5%₂大气和亚文化通过胰蛋白酶化0.05%胰蛋白酶- 0.02% EDTA在Ca^{2 +}- - - Mg^{2 +}无DPBS融合当他们到达约70%。亚文化两天后,新鲜的培养基代替rpmi - 1640含10%的边后卫,35到50毫米少量预处理后添加到介质与不同浓度的格列齐特或1毫米NAC 30分钟。文化是培养6 - 24小时。

2.3。评估细胞的生存能力

细胞培养在24-well板1×10的密度⁵每口井。他们孵化与35毫米一滴24 h,有或没有格列齐特、南汽。然后,细胞收获和0.4%台盼蓝染色极其为5分钟。在样例转移到血细胞计数器中,死细胞,不排除排除它的染料和可行的细胞数。结果表示为可行的细胞在整个人口的百分比。

2.4。流式细胞术测定细胞凋亡

流仪分析膜联蛋白V和propidium碘(PI)双重染色法进行描述(2]。在6-well HIT-T15细胞培养板的密度5×10⁵每口井。50 mM少量的细胞被刺激和格列齐特或NAC 24 h。结果计算平均荧光强度和表达为褶皱区别赋形剂对照组治疗(0.04% DMSO)。

2.5。评估细胞内活性氧(ROS)水平

细胞内ROS水平评估使用fluorescein-labeled染料DHR 123所描述的2]。HIT-T15细胞被镀在6-well文化板块的密度5×10⁵每口井。细胞被刺激的50 mM少量和格列齐特或NAC只有6 h因为广泛的细胞死亡可能干扰ROS测量。

2.6。评估羟基自由基清除活性

电子自旋共振(ESR)谱用于评估羟基自由基清除活性在体外。生成的羟基自由基是iron-catalyzed芬顿反应和自旋陷阱DMPO反应迅速。合成DMPO-hydroxyl激进的加合物的水平测量使用ESR谱仪(JEOL、东京、日本)。格列齐特、南汽与DPBS首先溶解在乙醇,然后稀释(pH值7.4)。反应混合物ESR分析由DMPO 0.2毫升的0.3米,0.2毫升的FeSO 10毫米₄0.2毫升10毫米H₂O₂和0.2毫升的控制车辆(乙醇)或样品(格列齐特或NAC溶解在乙醇)孵化在室温为2.5分钟。光谱仪条件磁场336.5公吨,功率1.00千瓦,9.4380 GHz频率,调制幅度0.2公吨,获得200年,扫描时间0.5分钟,扫描宽度10吨,采样时间常数0.03 s,温度25°C。格列齐特和南汽集团的ESR信号强度估计与一个ethanol-treated对照组相比。

2.7。测量细胞内谷胱甘肽的水平

细胞内的内容减少谷胱甘肽(GSH)是评估使用荧光染料,mBCl。谷胱甘肽结合专门mBCl形成荧光GSH-mBCl加合物反应介导的细胞内谷胱甘肽S-transferases [9]。镀HIT-T15细胞的密度在96 -文化板块1×10⁴每口井。细胞与格列齐特或NAC preincubated 30分钟,然后用35毫米培养少量只有6 h,因为细胞死亡可能干扰谷胱甘肽测量。股票100毫米mBCl准备在DMSO溶液,这是进一步溶解在苯酚red-free rpmi - 1640的最终浓度介质5毫米用于实验。然后,2μL(5毫米mBCl的解决方案是添加到每个包含100μL的介质测量前20分钟。这些细胞被洗两次冷DPBS和由此产生的荧光测量使用DTX 880多模检测器(美国贝克曼库尔特,富勒顿,CA)使用一个激发波长的发射波长360 nm和465 nm。获得的荧光被纠正细胞内蛋白质在每一个。最后的结果表示为纠正荧光与vehicle-treated控制相比的百分比。

细胞内总谷胱甘肽测定使用谷胱甘肽测定工具包(开曼化学公司,安阿伯市,美国)基于一个使用谷胱甘肽还原酶酶的回收方法。HIT-T15 6-well文化的细胞培养板的密度5×10⁵每口井。细胞治疗如上所述。细胞被冰冷的DPBS清洗和用离心重10000克15分钟紧随其后。立即得到的上层清液用于测量总谷胱甘肽。总谷胱甘肽的浓度表示为微摩尔每升在引用标准曲线。

2.8。统计分析

所有数据都表示为均值±SD。组间比较分析单向方差分析(方差分析)邓肯的紧随其后事后测试。所有使用SPSS分析软件(版本14.0;SPSS Inc .)、芝加哥、IL,美国),被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。dRib-Induced氧化损伤是稍微减少了格列齐特,明显减少了南汽

格列齐特的保护作用和南汽dRib-induced细胞死亡被台盼蓝排斥试验评估。24小时孵化与35毫米一滴诱导HIT-T15细胞的大量死亡。预处理与格列齐特略,但明显阻止这dRib-induced细胞死亡方式存在剂量依赖的相关性。增加1毫米NAC减少细胞死亡的水平明显比格列齐特治疗(图1)。流式细胞仪使用双重染色膜联蛋白V和π显示50 mM少量刺激24 h产生大量增加的早期和晚期凋亡率。预处理50或100μM格列齐特部分减毒dRib-induced凋亡,1毫米NAC几乎减少了细胞凋亡的vehicle-treated控制(图2、表1)。由HIT-T15细胞ROS生产测量后6小时孵化与50 mM少量流仪测定使用DHR 123染色。产生的少量刺激细胞内ROS增加近100倍数量相比vehicle-treated控制。添加格列齐特剂量依赖性抑制细胞内ROS水平上升的影响程度很小。然而,预处理与南汽完全封锁了这个dRib-induced ROS增加(图3、表2)。

3.2。格列齐特和南汽清除芬顿Reaction-Driven羟基自由基类似的程度

直接评估ROS-scavenging能力格列齐特和南汽,我们进行了ESR谱在细胞和dRib-free条件。羟基自由基生成与DMPO芬顿反应系统的捕获剂ethanol-treated控制在0.4%。添加格列齐特造成显著降低DMPO-hydroxyl激进的加合物的水平与控制。氢氧自由基信号预处理与南汽也显著降低。的清除羟基自由基的能力通过芬顿反应,生成有格列齐特和NAC(图之间没有显著差异4)。

3.3。南汽但不是格列齐特治疗恢复少量的细胞内谷胱甘肽耗竭水平

当HIT-T15细胞被刺激与不同浓度的少量6 h,细胞内和总谷胱甘肽含量显著减少,剂量依赖性降低(见补充图1在网上补充材料doi: 10.1155 / 2011/390678)。增加10、50和100μ玛格列齐特从未逆转dRib-induced损耗降低,总谷胱甘肽HIT-T15细胞。然而,预处理与1毫米NAC完全恢复dRib-induced消逝,增加谷胱甘肽水平比vehicle-treated控制(图5)。

4所示。讨论

这项研究表明,格列齐特治疗只有轻微dRib-induced氧化损伤的保护作用,但是,NAC治疗几乎完全阻止HIT-T15细胞氧化损伤。我们假设格列齐特和南汽有不同程度的保护dRib-induced氧化损伤,因为他们有不同的抗氧化机制。在这个实验中,格列齐特可以清除羟基自由基生成的芬顿反应但没有一滴再生细胞谷胱甘肽耗竭。然后,格列齐特略抑制dRib-induced上升在细胞内ROS和细胞凋亡。然而,南汽具有自由基清除和glutathione-regenerating能力和完全逆转dRib-induced氧化应激和细胞死亡。细胞内谷胱甘肽的海拔比自由基清除在预防dRib-induced更重要β细胞损害因为NAC是更有效的比格列齐特在保护他们免受dRib-induced损伤。此外,我们推测,谷胱甘肽再生是一个关键的预防机制β细胞损伤产生的少量因为南汽,谷胱甘肽前体,完全恢复了dRib-induced HIT-T15细胞氧化损伤。

磺酰脲类药物的降糖效果的进步降低2型糖尿病患者的血糖反应最初治疗被称为二次失败(10]。在临床研究中,这是证明了格列齐特二级故障率较低相对于其他磺脲类(11,12]。这二次失败是现在公认的共同进步的形式β细胞恶化开发后期阶段2型糖尿病的治疗糖尿病药方案(13,14]。氧化应激是已知的机制之一β在2型糖尿病患者细胞失败。在这个研究中,我们不能阐明格列齐特的直接保护作用的机制对dRib-induced氧化β细胞损伤。然而,我们认为自由基清除的机制,因为格列齐特淬火芬顿reaction-driven系统游离羟基自由基。在以前的研究中,格列齐特证明了自己是一个普通自由基清除剂(4,5)和一种有效的抗氧化剂,减少氧化应激标记在活的有机体内(6- - - - - -8]。因此,我们认为较低的二级失败率格列齐特的抗氧化效果,这也可能导致ROS-scavenging活动。

我们展示了细胞内谷胱甘肽耗竭可能是最重要的机制dRib-induced HIT-T15细胞氧化应激。然而,我们并没有建立一个机制细胞内谷胱甘肽的疲惫。Fico et al。15)报道,少量产生氧化应激细胞凋亡抑制谷胱甘肽的合成,通过增加谷胱甘肽在老鼠胚胎干细胞线流出。我们不能学习少量对谷胱甘肽合成的影响,但我们测量细胞外的谷胱甘肽水平和氧化谷胱甘肽(GSSG)谷胱甘肽射流由少量的间接评估。在我们的谷胱甘肽测定,少量刺激没有提升细胞外谷胱甘肽和GSSG水平与控制细胞培养基(数据未显示)。最近,施密特et al。16)也报道了细胞内谷胱甘肽的衰落观察培养的星形胶质细胞在接触少量没有伴随着增加细胞外谷胱甘肽。因此,dRib-induced谷胱甘肽耗竭的细胞机制可能随细胞类型,所以更多的研究阐明少量的确切机制显然是必要的。

长时间暴露在高葡萄糖浓度会导致不可逆转的β细胞功能障碍和细胞凋亡,这种现象称为葡萄糖毒性(17]。田中et al。18)表明,南汽,谷胱甘肽的生物合成的底物,避免葡萄糖毒性HIT-T15细胞和Zucker糖尿病老鼠脂肪。据报道,过度的谷胱甘肽过氧化物酶催化过氧化氢的还原谷胱甘肽可以保护胰岛细胞对氧化应激和改善高血糖在db / db糖尿病小鼠19,20.]。这些结果表明,谷胱甘肽可能是一个治疗目标,防止β细胞失败的2型糖尿病患者高血糖的条件。

总之,格列齐特部分减毒dRib-induced HIT-T15细胞氧化应激和细胞凋亡。然而,它的影响远小于NAC因为格列齐特没有恢复少量的细胞内谷胱甘肽耗竭,与南汽。主要针对dRib-induced氧化损伤保护机制似乎是细胞内谷胱甘肽的高程,而不是通过活性氧清除。因此,细胞内glutathione-elevating代理可以完全防止dRib-induced氧化损伤;此外,他们可能会保护β肽对葡萄糖毒性。

确认

作者感谢教授金赢得Hyun有用的讨论和技术援助。这项工作是支持的科研补助金的济州国立大学在2008年。

补充材料