文摘
背景。流行病学研究表明,饮用咖啡可以减少癌症的风险,但chemopreventive效应的分子机制仍然不明。客观的。识别差异表达基因在孵化HT29结肠癌细胞与即时含咖啡因的咖啡(ICC)或咖啡酸(CA)使用全基因组芯片。结果。ICC孵化HT29细胞造成57基因的超表达和161年underexpression,而CA孵化诱导12基因的超表达的underexpression 32。使用维恩图,我们建立了一个列表5十二underexpressed基因过表达基因和两个实验条件之间的共同点。这个列表是用来生成一个生物学协会网络STAT5B和ATF-2出现高度相互关联的节点。STAT5B过度被确认在mRNA和蛋白水平。ATF-2的mRNA水平变化被证实为ICC和钙、蛋白质含量下降而只是观察到治疗组细胞。细胞周期蛋白D1的水平,STAT5B和ATF-2目标基因的表达下调CA在结肠癌细胞和刑事法庭,在乳腺癌细胞CA。结论。咖啡多酚能够影响肿瘤细胞周期蛋白D1的表达式通过调制STAT5B ATF-2。
1。介绍
饮食中多酚类物质是最丰富的抗氧化剂。他们的主要食物来源是水果和植物的果汁等饮料,茶,咖啡,红酒。现有的证据强烈支持的贡献多酚预防心血管疾病、癌症、骨质疏松症暗示这些抗氧化剂的作用在神经退行性疾病和糖尿病的预防1]。
完善,多酚摄入导致plasma-antioxidant容量的增加。然而,仍有一些不确定性的效率提高细胞的保护组件,如脂质或DNA,在人类对氧化应激(2]。多酚类物质和其他抗氧化剂被认为通过清除自由基保护细胞成分对氧化损伤。然而,这个概念现在似乎是一个过于简单化的观点的作用方式(3]。更有可能的是,细胞对多酚类物质主要通过与受体或酶的直接互动参与信号转导,这可能导致细胞的氧化还原状态的修改,可能引发一系列redox-dependent反应(4]。这也可以应用于多酚具有抗癌的作用,哪些属性可以由许多不同的解释机制。
Hydroxycinnamic酸是几乎所有植物中主要的多酚类(2]。hydroxycinnamic酸的主要代表是咖啡酸,主要发生在食品与奎尼酸叫绿原酸酯(5-caffeoylquinic酸)。咖啡是一种人类饮食中绿原酸的主要来源;每日摄入咖啡在咖啡的人是0.5 - 1 g而戒酒者通常会摄取< 100毫克/天。研究表明,大约33%的摄取绿原酸和咖啡酸的95%被吸收肠道(5]。因此,大约三分之二的摄取绿原酸到达结肠,这可能是代谢咖啡酸(6]。
生物利用度数据表明,绿原酸的生物效应将变得明显在咖啡酸的新陈代谢,因此需要研究这种酸的影响。绿原酸和咖啡酸是抗氧化剂在体外(7,他们可能会抑制诱变和致癌N-nitroso化合物的形成,因为它们的抑制剂N-nitrosation反应在活的有机体内(8]。此外,绿原酸可以抑制DNA损伤在体外(9),因为它能抑制脂质peroxidation-induced DNA加合物的形成(10),抑制活性氧species-mediated核因子(NF -κB),激活蛋白1 (AP-1),并通过移植增殖蛋白激酶激活抗氧化酶(11]。这些研究表明,咖啡多酚是有效chemopreventive代理。
最近的荟萃分析表明逆咖啡摄入和结肠癌的风险之间的关联,肝脏,乳腺癌,子宫内膜癌(12- - - - - -15]。此外,在未来以人群为基础的群组研究,逆饮用咖啡和癌症风险之间的联系已被证明。Naganuma集团(16)发现,每天至少一杯咖啡的消费与上消化道癌症的风险降低49%在日本人口,而威尔逊和合作者(17)发现,男性经常喝咖啡似乎较低的患一种致命的前列腺癌的风险。较低的风险明显当消费规律或无咖啡因的咖啡。它提出了逆咖啡摄入和结肠癌之间的联系可以解释,至少部分的绿原酸在咖啡18]。Ganmaa et al。19)观察到的一般保护作用的咖啡因摄入量对ER亚型乳腺癌风险,但结果只是发现雌激素受体阳性乳腺癌的重要。在这项研究中,咖啡因和乳腺癌之间的关系是强在绝经后妇女雌激素受体和progesterone-receptor-positive乳腺癌比雌激素受体和孕激素受体阴性乳腺癌[19]。在另一项研究中,喝咖啡特别减少发展中er阴性乳腺癌的风险,但不是雌激素受体阳性乳腺癌[20.]。
虽然从流行病学数据有足够的证据支持,咖啡似乎降低某些癌症的风险,咖啡chemopreventive背后的分子机制的影响仍然未知。出于这个原因,我们研究的目的是确定在分子水平上的影响咖啡多酚类物质在低浓度相当于一杯咖啡,使用作为一个模型人类结肠癌细胞系HT29营养基因组的方法。此外,咖啡多酚的影响也是评价乳腺癌细胞。
2。材料和方法
2.1。材料和化学物质
细胞培养与即时含咖啡因的咖啡(ICC)(常规冻干速溶咖啡)和咖啡酸(CA,σ)。化合物溶解在DMSO (CA),或无菌水(ICC),存储在−20°C。
2.2。细胞培养
结肠腺癌HT29和乳腺癌MCF-7细胞系经常生长在火腿的F12培养基补充7%胎牛血清(的边后卫,无论是从Gibco) 37°C公司5%2调湿大气在10厘米的菜,或者在33毫米板。
细胞培养与刑事法庭或CA浓度相当于一杯咖啡。中使用的浓度细胞孵化项目,7μ在H g / mL2O mQ ICC和1.68μg / mL在DMSO对CA,分别考虑了这些化合物的数量在一个一杯咖啡及其分布在一个常规人体水分含量为75%。这些浓度并未造成任何细胞毒性效应的细胞MTT试验所确定的孵化项目(21]。
2.3。微阵列
基因表达分析了杂交的人类基因组U133A GeneChip + 2.0从Affymetrix微阵列,包含47000个成绩单和变异。HT29细胞孵化与刑事法庭和CA 24 h。总RNA是一式三份样品准备使用Speedtools总RNA提取工具包(Biotools)后,制造商的建议。总RNA RNA质量测试到2100年生物分析仪真核生物纳米系列二世(安捷伦科技)。标记、杂交和检测进行了制造商的规格后IDIBAPS基因组服务(医院诊所,巴塞罗那)。
2.4。微阵列数据分析
进行量化与GeneSpring GX v.11.5.1软件(安捷伦科技),它允许multifilter比较使用数据从不同的实验执行规范化,一代的列表和功能分类的差异表达基因。输入数据受到预处理基准转换使用健壮Multiarray平均总结算法使用的中值控制样本。分组每个实验条件的一式三份,列表后差异表达基因分析可以使用火山生成的阴谋。每个基因的表达报告每个条件后所获得的价值的比例相对控制条件正常化后,数据的统计分析。修正后的截止值应用的< 0.05;然后该统计分析的输出被折叠表达式过滤,选择具体的基因的微分表达式至少1.3倍。基因分类建立了本体的数据库。
2.5。ICC和CA之间常见的基因治疗
常见的基因差异表达基因从列表中选择为每个治疗使用维恩图。新生成的列表包含在和underexpressed基因。
2.6。代生物学协会网络
禁止建造内的援助途径分析GeneSpring v.11.5.1(安捷伦)中描述Selga et al。22)的治疗中常见的基因差异表达的列表。过滤筛选是由程序之间的数据处理和书目交互数据库100相关基因。网络协会在文献中被证实。
2.7。RT实时聚合酶链反应
从HT29细胞总RNA提取使用Ultraspec (Biotex)按照制造商的指示。
互补DNA合成中描述Selga et al。23)和互补产品被实时PCR用于放大。STAT5B和ATF-2 mRNA水平测定7000年ABI棱镜序列检测系统(应用生物系统公司)使用3μL的cDNA反应和assays-on-demand Hs00560035_m1 STAT5B, Hs00153179_ml ATF-2,和Hs00356991_m1 APRT从应用生物系统公司(所有)。APRT信使rna作为内生控制。后的反应是执行制造商的建议。折叠使用标准计算基因表达的变化Ct方法。
2.8。免疫印迹
整个提取获得控制或治疗细胞根据Selga et al。23]。五μL提取的用于确定布拉德福德蛋白质浓度的测定(Bio-Rad)。提取被冻结在液体N2并存储在−80°C。总提取物(50μg)是解决SDS-polyacrylamide凝胶和转移到PVDF膜(止动剂P,微孔)用半干的electroblotter。
临时身份证蛋白检测系统技术(微孔)被用来探测膜。该系统通过膜积极推动真空试剂适用于蛋白质位置,与传统技术的扩散膜作为试剂运输。表1编译使用的抗体不同的决定。
信号被检测到中等辣根peroxidase-conjugated抗体,anti-rabbit(1: 5000或1:10000稀释;Dako)或anti-mouse(1: 2500稀释,Amersham NIF 824)并使用ECL增强化学发光法,按照制造商的推荐(Amersham)。化学发光检测与ImageQuant拉斯维加斯4000迷你技术(通用电气医疗集团)。
2.9。统计方法
rt - pcr和免疫印迹分析,值表示为均值±SE的三个不同的实验。数据被不成对学生的评价t测试和分析使用诉18.0.0 PASW统计数据。软件。
3所示。结果
3.1。ICC和CA孵化项目HT29基因表达的影响
超过47000的表达谱成绩单和变体包括在微阵列从Affymetrix HG U133 + 2.0比较控制HT29细胞间和细胞孵化与CA或刑事法庭,在无毒浓度24 h。GeneSpring GX软件v.11.5.1被用来分析结果。通过1.3倍的差异表达基因的列表P截止值< 0.05中描述的生成方法。HT29细胞与国际刑事法院的孵化时,57 underexpressed基因过表达,而161个基因。中过表达基因,24%属于转录因子类别和19%细胞周期或生物合成的过程。在underexpressed基因,细胞周期对应的类别是最受影响的基因(53%)紧随其后的是转录因子(19%)和生物合成的过程(12%)。在孵化与CA, 12基因过表达而32 underexpressed基因。中过表达基因,33%属于转录因子类别,25%,细胞周期和16,7%生物合成的过程或免疫反应。内underexpressed基因,再一次类别相应的细胞周期是最受影响的基因(30%)紧随其后的是生物合成的过程(15%)和转录因子(12%)。差异表达基因的列表给出了表2,3,4,5。这项工作中给出的数据存入基因表达综合(地理,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/),可通过地理系列加入[GSM867162]。
3.2。代生物学协会网络
生物学协会网络(禁止)是构造中使用路径分析GeneSpring v.11.5.1中描述的方法使用在孵化开始列出常见的基因差异表达与CA和刑事法庭。这个列表包括五个基因过表达基因和十二underexpressed(表6)。在生成的网络、信号传感器和转录激活5 b (STAT5B)和激活转录因子2 (ATF-2)出现高度互连节点(图1)。这两个主要节点被选中作进一步验证。STAT5B过表达对控制23.8%细胞接受国际刑事法庭和33.4%处理,而ATF-2被发现在HT29 underexpressed孵化与刑事法庭(相比减少32.5%控制)和CA(下降26%)。
3.3。验证STAT5B和ATF-2信使rna和蛋白质含量的变化
STAT5B过度HT29细胞在孵化与CA和刑事法庭被确认在mRNA(1.16——1.3倍比控制,分别)和蛋白质水平(1.5——1.2倍比控制,分别)(数据2(一个)和2 (c))。对于ATF-2, mRNA水平变化被证实为CA和ICC(0.88——0.86倍比控制,分别),而蛋白质含量的下降只是观察到治疗组细胞(0.62倍而控制)(数据2 (b)和2 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.4。表达的细胞周期蛋白D1孵化ICC和CA
细胞周期蛋白D1在mRNA和蛋白过表达水平超过50%的乳腺癌基因扩增的存在与否,这是其中一个最常见的过表达蛋白在乳腺癌(24,25]。细胞周期蛋白D1转录是由STAT5 [26- - - - - -29日]和ATF-2 [30.- - - - - -32]。
我们通过免疫印迹分析细胞周期蛋白D1的水平在MCF-7和HT29细胞与国际刑事法院的孵化和CA。如图3(一个),孵化MCF-7细胞CA和ICC导致大幅减少的细胞周期蛋白D1蛋白水平,加上STAT5B的水平的增加,而不是减少ATF-2的水平。在HT29细胞中,孵化与CA并不影响细胞周期蛋白D1的水平,而国际刑事法庭的存在导致细胞周期蛋白D1的增加水平3 (b)。
(一)
(b)
4所示。讨论
在这个工作我们人类癌症细胞的基因表达谱分析处理刑事法庭或CA。咖啡酸被选中,因为它是hydroxycinnamic酸的主要代表。使用微阵列我们确定特定基因的微分表达式在几个生物学途径。两个异常基因的mRNA表达的变化,STAT5B ATF-2,观察到的微阵列被实时RT PCR证实,和蛋白质含量的变化也通过免疫印迹分析。选择STAT5B和ATF-2根据获得的结果在生物学协会网络的建设。最后,细胞周期蛋白D1的调制,目标STAT5B ATF-2转录因子,在孵化与咖啡多酚也成立。
我们表明,国际刑事法庭和CA的一杯咖啡能够诱导STAT5B HT29细胞信使rna和蛋白质的水平。STAT5最初被描述为一种prolactin-induced乳腺因子(33]。两个密切相关的克隆STAT5互补,老鼠和人类cDNA库,显示两个不同的基因,STAT5A和STAT5B编码两种STAT5蛋白(34- - - - - -37]。
除了催乳素,STAT5蛋白质激活多种细胞因子和生长因子,包括2、IL-3, IL-5, IL-7, IL-9, IL-15、集落刺激因子、红细胞生成素,生长激素促血小板生成素,表皮生长因子、血小板源生长因子。STAT5B的主要功能是调节生长激素的影响(38,39]。调制STAT5水平或转录活动已经描述的细胞治疗与川陈皮素等天然化合物,柑橘类黄酮(40),西娅黄素(41],silibinin天然多酚类黄酮素,水飞蓟素的主要生物活性成分隔绝Silybum marianum(42]。此外,据报道,butein,茎的主要生物活性多酚成分采用verniciflua表达下调STAT3-regulated基因产物的表达,如Bcl-xL, bcl - 2,细胞周期蛋白D1, mcl1 [43]。
STAT5B参与多样的生物过程,如生长发育、免疫调节、细胞凋亡、复制、催乳激素通路和脂质代谢。STAT5B缺乏症是一种最近发现的疾病实体,包括严重增长hormone-resistant衰竭和严重的免疫缺陷(44- - - - - -46]。STAT5B表达式的感应在孵化与CA和刑事法庭可以代表一个营养工具移植这种转录因子和小说研究表明自然疗法的策略在克罗恩氏病和炎症性肠病STAT5B似乎维持粘膜屏障完整性和宽容47,48]。在结直肠癌STAT5a和STAT5b扮演重要角色在STAT5a和STAT5b差别进展和对这些结果在细胞生存能力逐渐下降,主要归因于G1细胞周期阻滞和凋亡细胞死亡(49]。在这种背景下的增加造成STAT5B ICC和CA对结直肠癌患者,会有负面影响,因为它会引发细胞增殖和生存。
在人类乳腺癌,STAT5A / B已被证明的双重角色乳腺肿瘤形成的引发剂以及促进分化的肿瘤。STAT3、STAT5A STAT5B过表达或持续激活在乳腺癌(50- - - - - -52)和主动STAT5A / B在人类乳腺癌预测有利的临床结果(53]。通过Jak2-STAT5催乳激素受体信号转导通路已经被认为是正常的乳腺上皮细胞增殖和分化的关键(54- - - - - -56]。它已经表明,NUC-pYSTAT5的水平减少乳腺癌进展正常原位入侵,然后,淋巴结转移(57]。此外派克et al。57]发现没有检测到NUC-pYStat5肿瘤的患者在抗雌激素治疗是如何与贫穷有关乳房癌症特异性生存。我们分析了STAT5B调制通过PRL通路在咖啡多酚在乳腺癌细胞系。MCF-7细胞系的选择因为催乳素受体的表达往往是发现在雌激素受体阳性乳腺癌肿瘤(58]。在我们的条件下,孵化与CA和ICC导致STAT5B MCF-7细胞中的蛋白质含量的增加,这个结果可能是一个可能的基础包含咖啡多酚在乳腺癌患者的饮食。
ATF-2属于ATF-cAMP反应元件结合蛋白(分子)家族的转录因子,可以绑定到营地响应元件(CRE)发现在许多哺乳动物基因启动子(59,60]。ATF-2展品致癌基因和肿瘤抑制功能(61年]。不尽在多个基因参与细胞周期的控制,例如,细胞周期蛋白D1基因和ATF-2绑定这个序列刺激细胞周期蛋白D1的转录(30.,31日]。ATF-2介导的细胞周期蛋白D1启动子可以刺激诱导的促生长因子,如雌激素(31日),肝细胞生长因子(62年),再生基因产物(63年]。ATF-2与扩散,入侵,移民和阻力在乳腺癌细胞系dna有害。
ATF-2表达的差别,对这些HT29细胞CA和ICC孵化后报告是根据观察到的活动减少ATF-2在胃细胞孵化与绿原酸、咖啡酸的前体(64年]。令人惊讶的是,蛋白质含量的验证显示的upregulation ATF-2蛋白质与刑事法庭,但不是与CA, HT29和MCF-7细胞。这个微分的行为可能是由于其他刑事法庭组件除了CA。在这个方向Rubach et al。64年]报道的不同响应在孵化后ATF-2活动胃细胞化合物与不同的咖啡。焦棓酸,苯邻二酚,βN-alkanoylhydroxytryptamides N-methylpyridinium ATF-2活动增加,而绿原酸和咖啡因减少它64年]。在我们的条件下孵化HT29细胞与ICC ATF-2 mRNA水平适度的减少造成的。然而这种效果并不是在蛋白质翻译水平。我们假设ICC包含其他多酚除了咖啡酸能够增加ATF-2蛋白质含量通过增加翻译的信使rna,蛋白质的稳定性的增加或抑制其降解。在这个方向等植物多酚(-)-epigallocatechins-3-gallate (EGCG),染料木素,毛地黄黄酮,芹黄素,白杨素,描述了槲皮素、姜黄素、单宁酸拥有proteasome-inhibitory活动(65年,66年]。
ATF-2转录活动的监管,主要是水平的磷酸化状态,被描述在治疗癌症细胞的天然化合物。MCF-7细胞的抗癌剂3 30-Diindolylmethane,来自芸苔属植物蔬菜,激活物和p38通路,导致c-Jun ATF-2磷酸化,增加绑定的c-Jun-ATF-2为和形成的近端监管元素干扰素-γ启动子(67年]。现有Biochanin-A、异黄酮、红三叶草,卷心菜和紫花苜蓿,对某些癌细胞有抑制和apoptogenic效应通过阻断p38 MAPK的磷酸化和ATF-2剂量依赖性的方式(68年]。物的压力激发了通路是一个主要的细胞内信号转导级联参与肠道炎症(69年,70年),upregulation ATF-2已被证明在克罗恩病(71年,72年]。因此CA可能是潜在的治疗特性在不同的州的肠道炎症由于其综合影响STAT5B和ATF-2 HT29细胞。
最后,细胞周期蛋白D1的调制,目标STAT5B ATF-2转录因子,在孵化与咖啡多酚成立于结肠癌和乳腺癌细胞。在结直肠癌细胞周期蛋白D1过度是常见的,但这些发现对其预后价值是相互矛盾的。在最近的一项研究中,阳性表达细胞周期蛋白D1蛋白被发现在95年169年的结肠腺癌标本,并增加了细胞周期蛋白D1水平与预后不良相关(73年]。此外,有显著相关性的积极表达p-Stat5和细胞周期蛋白D1结肠腺癌患者。然而,在另一项研究中,细胞周期蛋白D1超表达与改善的结果共有386名病人手术切除的结肠癌,列为TNM阶段II或III。带等。74年p21]表明,低、高p53、低细胞周期蛋白D1,和高AURKA II和III期结肠癌患者复发。在这种背景下刑事法庭对细胞周期蛋白D1水平的影响可能是积极的或负面的影响在结肠癌细胞中,根据肿瘤的进展。细胞周期蛋白D1水平的增加可能是更好的结果的一个标志,因为它最近证实,细胞周期蛋白D1表达式与长期生存在男性直肠癌和缺乏细胞周期蛋白D1与更积极的男性患者的表型(75年]。然而,一些天然化合物如花青素,花青素,芹黄素,毛地黄黄酮和非瑟酮都描述了实验诱导细胞循环逮捕并通过减少细胞凋亡在HT29细胞周期蛋白D1的水平(76年- - - - - -80年]。根据这些数据,增加观察HT29细胞周期蛋白D1的水平上与国际刑事法院的孵化可能的结果中,不同于多酚化合物的存在。
在MCF-7乳腺癌细胞,细胞周期蛋白D1表达下调与咖啡多酚在孵化。MCF-7细胞系的选择的基本原理是基于观察,尽管细胞周期蛋白D1超表达存在多个组织学亚型乳腺癌,它已经表明,绝大多数的细胞周期蛋白D1-overexpressing乳腺癌ER阳性(24,25,81年]。细胞周期蛋白D1过度报道40到90%的病例的乳腺浸润性癌基因扩增时在约5 - 20%的肿瘤(24,81年- - - - - -83年]。在细胞周期蛋白D1-driven癌症,阻断细胞周期蛋白D1表达式通过瞄准细胞周期蛋白D1基因RNA、蛋白质应增加成功治疗的机会。细胞培养的研究也引起了某些化合物可能以这种方式行动(84年,85年)和方法使用反义阻断细胞周期蛋白D1的表情,核,或相关分子专门针对驾驶分子病变本身(86年- - - - - -88年]。相信化合物调节细胞周期蛋白D1表达可能在人类肿瘤的预防和治疗作用。例如,flavopiridol,基于一个合成黄酮类提取物的印度工厂的潜在治疗癌症,引起细胞周期蛋白D1稳态蛋白质含量快速下降,在[89年]。把所有这些结果一起,抑制细胞周期蛋白D1的表情似乎是癌症治疗的好方法。在这个方向我们观察到咖啡和咖啡酸能够大大减少乳腺癌细胞周期蛋白D1的表达可能表明,一些咖啡组件可以作为一个协作的治疗乳腺癌的治疗工具。
缩写
| APRT: | 腺嘌呤phosphoribosyltransferase |
| ATF-2: | 激活转录因子 |
| 禁令: | 生物学协会网络 |
| CA: | 咖啡酸 |
| DMSO溶液: | 二甲亚砜 |
| DEPC: | 焦碳酸二乙酯 |
| 国际刑事法庭: | 即时含咖啡因的咖啡 |
| rt - pcr: | 逆转录-聚合酶链反应 |
| STAT5B: | 信号传感器和激活转录5 b。 |
确认
这项工作是CDTI赠款支持050618年saf2008 - 0043, saf2011 - 23582 (Ministerio de Educacion y Ciencia de Espana)和ISCIII-RTICc RD06/0020(红色Tematicas de Investigacion Cooperativa en Salud) RD06/0020/0046。我们的研究小组把“质量区别”从“Generalitat de加泰罗尼亚”sgr2009 - 00118。c . Oleaga奖学金的获奖者从联邦选举委员会(Federacion del诺拉咖啡馆)。所有的作者没有利益冲突。