二氧化硅纳米颗粒使人多发性骨髓瘤细胞对蛇敏感(Walterinnesia aegyptia毒液诱导的细胞凋亡和生长阻滞

摘要

背景．多发性骨髓瘤(MM)是一种几乎无法治愈的疾病，是第二常见的血癌。初期化疗治疗可能会成功;然而，耐药性的发展敦促使用更高的毒性剂量伴随造血干细胞移植。建立更有效的治疗方法，以克服或规避化疗耐药性已成为当务之急。我们最近证明了从Walterinnesia aegyptia(WEV)单独或联合二氧化硅纳米颗粒(WEV+NPs)介导前列腺癌细胞生长阻滞和凋亡。在本研究中，我们评估了WEV单独和WEV+NP对MM细胞增殖和凋亡的影响。方法．在70例确诊的MM细胞中监测了WEV单独和WEV+NP的影响。采用流式细胞仪检测WEV和WEV+NP的影响。结果．WEV单独和WEV+NP均降低MM细胞活力。通过CFSE增殖实验，我们发现WEV+NP能明显抑制MM细胞的增殖。碘化丙啶(PI)染色法分析细胞周期结果表明，WEV+NP显著改变MM细胞周期，增强细胞凋亡诱导。结论．我们的数据揭示了WEV和WEV+NP对MM细胞的生物学效应，使这些化合物能够有效地治疗MM。

1.背景

多发性骨髓瘤是一种几乎无法治愈的疾病，是第二常见的血癌。它的特点是存在恶性浆细胞，主要位于骨髓。骨髓瘤的治疗主要是针对并发症的处理和恶性细胞团块的减少。初期化疗治疗可能会成功;然而，耐药性的发展敦促使用更高的毒性剂量，并伴有造血干细胞移植[1］．

因此，为了改善成果并延长存活的长度，建立更有效的治疗方法，可以克服并发症或旨在避免化学化的优先权[2］．

天然毒素被认为是治疗包括癌症在内的几种人类疾病的药物来源。特别是，一种无毒剂量的蛇毒被证明既能减少卵巢癌的实体肿瘤大小，又能阻断血管生成过程[3.］．寻找新的抗癌药物仍然是必要的，以增加可用的选择，并确定更少的毒性和更有效的药物。蛇毒是多种物质的复杂混合物，包括毒素、酶、生长因子、激活剂和抑制剂，具有广泛的生物活性。我们最近的研究表明蛇毒具有抗肿瘤的潜力Walterinnesia aegyptia(WEV)对人乳腺癌细胞系MDA-MB-231的作用，并对正常小鼠外周血单个核细胞(PBMCs)显示了作用[4.］．此外，其他数据表明，纳克浓度范围内的蛇毒毒素Vipera lebetina turanica抑制激素难治性人前列腺癌细胞生长;这种效应与NF-有关κb信号介导的细胞凋亡诱导[5.］．

携带化学疗法的纳米颗粒在治疗癌症患者方面显示出巨大的希望。当装载抗癌药物时，纳米粒子可以成功地增加癌症组织中的药物浓度，并在细胞水平发挥作用，增强抗肿瘤疗效。纳米颗粒可被细胞内吞和/或吞噬，从而导致被封装药物的内化[6.］．因此，在本研究中，我们研究了WEV的影响并与二氧化硅纳米粒子（WEV + NPS）组合在MM细胞的增殖和凋亡中。

2。材料和方法

2．1．样品

70例MM患者的骨髓(BM)标本均来自埃及南埃及癌症研究所和埃及Assiut大学医院，并获得了机构审查委员会的批准。

从MM患者的肝素化BM抽液中(通过监测细胞表面CD138的表达)检测骨髓单个核细胞，并通过台班蓝排除法检测>90%的存活率。

2.2。的准备  w . aegyptia毒液

w . aegyptia这些蛇是从沙特阿拉伯中部地区采集的，并保存在沙特国王大学理学院动物学系的蛇笼里。每天用100瓦的灯给蛇加热9个小时，而且水总是可用的。这些蛇每10到14天喂一次专门培育的老鼠。毒液从成年蛇中提取，冻干，并在使用前用1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)重组。

2.3。准备组合w . aegyptia毒液和二氧化硅纳米颗粒

二氧化硅纳米颗粒和蛇毒的结合是在沙特国王大学阿卜杜拉国王纳米技术研究所制备的。利用阴离子表面活性剂在二氧化硅核周围形成双介孔核-壳型二氧化硅纳米球;固体硅芯由此转变为介孔硅芯。首先，合成固体二氧化硅芯时，在含18 mL乙醇和2.6 mL去离子水的溶液中加入0.875 mL氨水;然后加入1.5 mL正硅酸乙酯(TEOS)，同时剧烈搅拌。将所得混合物在30℃加热60 min，离心收集二氧化硅沉淀，用水洗涤3次。其次，合成介孔核壳纳米球——二氧化硅(SiO)₂）使用15mL H中的阴离子表面活性剂分散颗粒₂超声治疗10 min。加入1 g/L聚乙烯吡咯烷酮，持续搅拌60 min，以抑制硅芯的团聚。然后向反应混合物中加入0.1 mL 3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APMS)、0.2933 g (1 mmol) n -月桂酰肌氨酸钠(Sar-Na)和1.5 mL正硅酸乙酯(TEOS)，在50℃下搅拌2 h。最后的固体通过离心回收，用去离子水洗涤，在60°C的烤箱中干燥12小时。在550°C的气流中进行6小时的热处理，去除模板。得到的摩尔比为TEOS: H₂O:道:Sar-Na:盐酸:PVP = 1: 331.6: 0.08: 0.14: 0.06:．合成纳米颗粒后，将25 mg介孔二氧化硅纳米颗粒加入到50 mg/mL的毒液溶液中，加入0.5 mL水。将悬浮液搅拌2小时，防止水分蒸发。用高速离心回收含有毒液的介孔二氧化硅纳米颗粒，然后在60℃真空烘箱中烘干。透射电子显微镜(TEM)使用日本JEOL JSM-2100F电子显微镜(200 kV)。用Quantachrome NOVA 4200分析仪(美国)在77k下测量氮吸附等温线。在进行测量之前，样品在200°C的真空中脱气至少18小时。采用Brunauer-Emmett-Teller (BET)方法计算比表面积(S.BET）在相对压力范围内使用吸附数据范围为0.05至0.35。通过使用Barrett-Joyner-Halenda（BJH）模型，孔隙体积和孔径分布源自等温物的吸附分支，以及总孔体积是由相对压力下的吸附量估算的0.992。

为了确定反应时间对二氧化硅纳米颗粒和蛇毒液之间的相互作用的影响，测试了用于合成固体二氧化硅芯的各种反应时间;双介孔核心壳二氧化硅球形成的形成如图所示1．在1-和6-H反应时间内，观察到均匀的中孔二氧化硅壳。然而，在1小时反应时间，二氧化硅核心似乎非常密集。延伸用于合成固体二氧化硅核心的反应时间，导致径向定向的透明和明显的中孔;将这些中孔锚定在芯内并从核心中心延伸到壳体，如图所示1（b）．随着反应时间从1 h增加到6 h，岩心对比的衰减表明随着反应时间的增加，更多的中孔被锚定，岩心密度的损失;当反应时间为6 h时，孔隙体积增大，也说明了这一点。不同反应时间的壳体厚度变化不显著;厚度保持在50 nm左右。粒径分布表明，两种样品生成的粒径约为300 nm。但如图所示，反应6 h的样品比反应1 h的样品分布更窄2．数字3.显示n₂不同表面活性剂反应时间生成的吸附-脱附等温线;这些等温线呈IV型，是介孔材料的特征。在反应1- h和6-h时，总孔体积分别为0.342和0.416 cc/g。在吸附和解吸支之间观察到的三角形迟滞环可以归因于六角形和片层相的共存。BET表面积分别为304.08和440.73 m²/ g分别在1-和6-H反应时间。很明显，通过增加反应时间来提高中孔核 - 壳结构的纹理特征。

2．4．单克隆抗体

通过荧光激活细胞分选(FACS)进行免疫染色和分析，我们使用了Allophycocyanin (APC)、phycoythrin (PE)和Fluorescein isothiocyanate- (FITC-)、针对人CD3、CD138 (BD pharingen, SanDiego, CA, USA)的偶联小鼠单克隆抗体(mAbs)和Annexin V (IQ产品，荷兰)和相应的小鼠同型对照(均来自美国圣地亚哥BD PharMingen)。CD3对淋巴细胞有特异性，CD138对MM细胞有特异性。所有抗体的浓度都滴定以获得最佳染色效果。单克隆抗体的染色是按照标准方案进行的。

2．5．流式细胞术

用FACSCalibur系统（BD，San Jose，Ca，USA）进行流式细胞术。随后通过CellQuest软件（BD，San Jose，CA，USA）进行分析并显示所有荧光计量数据。每个分析包括至少20 000个细胞的测量值。

2．6．CFSE扩散分析

BM细胞在PBS中洗涤两次并用0.63染色 μM羧基荧光素二乙酸丁二酰亚胺酯(CFSE) (Molecular Probes, Eugene, OR, USA)室温下8分钟。用PBS洗涤三次，去除残留CFSE。将cfse标记的细胞接种于6孔板，用NP、WEV或WEV+NP处理或不处理(0)，在rpmi细胞培养基中培养4天。然后用单克隆抗体对细胞进行染色。采用流式细胞术检测CFSE荧光强度。在CD138阳性的基础上，手动门控并创建MM细胞(R1)。通过观察阳性细胞的相对数量来评估细胞标志物的表达。用同型对照抗体分离阳性和阴性细胞。

2.7。细胞凋亡和细胞周期分析的流式细胞术分析

用NP、WEV或WEV+NP处理后，MM细胞用70%冰乙醇固定并渗透至少1小时，然后用PBS洗涤2次。将细胞在37°C孵育1小时，40分钟内进行DNA染色μg/mL碘化丙啶，100μg/mL DNase-free RNase in PBS。由于荧光区(FL2-A)是细胞周期分析的主要参数，使用Modfit LT 3.0软件(BD, San Jose, CA, USA)分析FL2-A的直方图作为细胞周期图。

使用台盼蓝排除测试识别死细胞。还重新分析了MM细胞以表达膜蛋白V和膜蛋白V和PI，分别鉴定早期和晚期凋亡。

2.8。还活动

根据制造商的说明书，使用荧光蛋白酶检测试剂盒(MBL，爱知县，日本)评估Caspases 3,8和9的活性。

2.9。ROS测量

使用2,7-二氯二硫荧光氟喹霉素（H2DCF-DA）（H2DCF-DA）（H2DCF-DA）（H2Dootechnology，Haimen，China）测定反应性氧物质（ROS）水平。mm细胞（用溶解在1mL PBS的10LM H 2 DF-DA直接处理在37℃下进行20分钟。使用488nm的激发波长和530nm的发射波长监测荧光强度。

2.10。氢过氧化物水平

使用自由基分析系统(FRAS 2, Iram，帕尔马，意大利)评估过氧化氢水平。这个测试是一种比色分析法，利用过氧化氢与一些过渡金属反应后产生自由基的能力。

2.11。统计分析

在进一步进行统计分析之前，首先使用安德森-达令检验对数据进行正态性检验，然后评估方差齐性。数据为正态分布，用平均值表示平均标准误差(SEM)。各组间的显著差异采用单因素方差分析或双因素方差分析，然后使用PRISM统计分析软件(GraphPad software)进行Bonferroni多重比较检验。然后使用单因素方差分析或双因素方差分析对数据进行重新分析，然后使用SPSS软件(第17版)进行Tukey范围测试。差异被认为是有统计学意义的．

3.结果

3．1.WEV和WEV+NP均能抑制MM细胞的生长

利用二氧化硅纳米颗粒模型，我们首先研究了WEV和WEV+NP诱导MM细胞生长阻滞的能力。WEV和WEV+NP对5例MM患者的影响进行了检测(图)4（a）)和XG2细胞系(图4 (b)）在0,1,5,10,25,50,100和1000ng / ml的浓度下，以及0,1,2,6,12,24,36和48小时的孵育时间（图4 (c)和4 (d)）。使用MTT上吸收法测量所产生的韦夫和WEV + NP的细胞毒性效应。从五个独立实验中收集的数据（)表明，WEV和WEV+NP均能显著抑制MM细胞的生长，且呈剂量和时间依赖性。IC.₅₀WEV单独和WEV+NP分别为25 ng/mL和10 ng/mL。在孵育12 h时效果最大。WEV与NP联合(WEV+NP)可显著增强WEV对MM细胞的抑制作用。单独25 ng/mL WEV和10 ng/mL WEV+NP处理12 h时，WEV和WEV+NP对细胞活力的抑制作用最大。然而，单用NP治疗并不影响MM细胞的活力。

３．２．WEV+NP抑制MM细胞增殖

因为增殖过程对于癌细胞的维持和进展至关重要，因此我们使用CFSE稀释测定随后进行流式细胞仪，监测韦夫的影响或与NP的NP与NP对MM细胞的增殖组合。一个代表性实验显示为图中的点图5.． When the MM cells were treated with NP alone, the percentage of proliferating cells was 85%. In contrast, treatment with WEV alone or in combination with NP (WEV+NP) markedly decreased the percentage of proliferating cells to 45% and 22%, respectively. The total data from the different experiments (结果显示，单独使用WEV可显著降低()对MM增殖能力的影响。此外，NP联合WEV可显著增强WEV对MM的抑制作用，而NP单独则无作用(表1)1）。

3.3。WEV + NP在MM细胞中诱导细胞凋亡

抑制癌细胞增殖，戒烟，细胞循环，以及凋亡的诱导都是针对治疗癌症的化学治疗策略。因此，我们评估WEV和WEV + NP是否使用PI，annexin V和流式细胞术分析改变MM细胞的细胞周期。数字6.展示了一个具有代表性的实验;我们发现，未处理的细胞中凋亡细胞的百分比为3%，而np处理的细胞中凋亡细胞的百分比为4%。WEV和WEV+NP均可使细胞凋亡率明显提高至90%。与未处理和NP处理的59%相比，WEV和WEV+NP处理后细胞凋亡的诱导率增加，且S期细胞的百分比分别显著下降至25%，呈负相关。不同实验的总数据(结果显示，单独使用WEV可显著增强MM细胞的凋亡(见表2)1;）。虽然NP对MM细胞的凋亡诱导没有影响，但与单独的韦夫相比，NP和WEV的组合显着增加了凋亡诱导（）。

3．4．半胱天冬酶的活动

我们的结果如图所示7.说明WEV处理后MM细胞中caspase 3、8、9活性升高，而WEV+NP处理后升高幅度更大。结果显示，与未处理的细胞和单独使用NP处理的细胞相比，处理后的细胞中caspases活性显著增加(见表)1）。

3．5.活性氧和过氧化氢水平

ROS和过氧化氢水平的测量表明，与未处理的MM细胞和NP单独处理的细胞相比，处理的MM细胞(通过WEV和WEV+NP)中的ROS和过氧化氢水平显著增加。在MM细胞中，NP单独不影响这些参数1）。

4.讨论

在这项研究中，我们研究了蛇毒，单独或与二氧化硅纳米颗粒的影响，对MM细胞生长和存活。我们使用从临床诊断患有多种骨髓瘤的患者分离的细胞。我们发现单独和与二氧化硅纳米颗粒组合的韦夫以剂量和时间依赖的方式抑制MM细胞的生长。此外，WEV + NP增强了WEV对癌细胞的影响。IC.₅₀对于MM细胞的生长抑制的WEV和WEV + NP的值分别为25ng / mL和10ng / ml;无论它们的敏感度如何，这些值在患者和XG2细胞系中分离的mM细胞中相同。然而，癌细胞对韦夫和韦夫+ NP治疗的敏感性因我们最近证明了IC₅₀WEV和WEV+NP介导MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞生长抑制的值分别为50 ng/mL和10 ng/mL [4.那7.］．此外，这些IC₅₀结果表明，介导的乳腺癌细胞生长抑制并不影响非致瘤性正常乳腺上皮细胞(MCF-10)和人类正常PBMCs的生存能力。此外，此前已有报道蛇毒可诱导多种癌细胞系凋亡[8.那9.］．

不受控制的增殖在细胞更替和肿瘤发生中具有重要意义。因此，我们采用CFSE稀释法检测WEV单独或联合NP对rpmi介导的MM细胞增殖的影响，然后采用流式细胞仪分析。我们的数据显示，WEV单独或与NP联合均能抑制MM细胞的增殖。因此，诱导MM细胞凋亡可能导致其回归，改善疾病预后[10］．因此，能够诱导细胞凋亡的药物可能是治疗MM的有效化疗药物。

尽管MM治疗的前景正在迅速改变，但这种疾病在很大程度上是不可治愈的[11］．目前用于治疗mm的几种化学治疗剂（例如，长春杂星，地塞米松和Melphalan）。然而，这些药物具有增加发展二次血液学恶性肿瘤的风险的缺点，例如治疗相关的髓细胞增强综合征[12］．因此，需要进一步识别负责MM细胞存活，肿瘤发生和耐药性的生物因子和机制的必要性13］．

一般来说，化学治疗药物对正常和肿瘤细胞的攻击非特异性地引起危及生命的副作用，需要对肿瘤的靶向药物递送[14］．事实上，治疗分子通常必须:在通过质膜扩散到合适的细胞器(生物靶点所在的位置)之前，必须穿过一种或多种生物膜。对于靶向位于细胞内的药物，偏离这一理想路径不仅会降低药物效率，还会带来副作用和毒性。由于这些原因，在30多年前，出现了一个想法，即裁剪足够小的载体，将活性物质运送到目标细胞及其相关的亚细胞间隔[15］．各种类型的纳米颗粒，如脂质体、聚合物胶束、树枝状大分子、超顺磁氧化铁晶体和胶体金，已经被用于癌症的靶向治疗[16那17］．纳米载体为克服细胞屏障提供了独特的可能性，以改善各种候选药物的递送[15］．最近的研究表明，纳米粒子通过增强渗透性和滞留效应，可以有效地靶向肿瘤[18-20.］．载药纳米颗粒的递送在晚期甲状腺癌中取得了成功[21]和乳腺癌。

在本研究中，虽然无毒纳米颗粒对MM细胞没有影响，但与WEV单独使用相比，WEV与纳米颗粒联合使用可将WEV对MM细胞的杀伤效率提高两倍。尽管在生物医学应用中使用纳米粒子的兴趣很大，但对它们的细胞摄取和转运仍然缺乏清楚的了解。它们似乎通过网格蛋白和大胞饮介导的内吞作用跨细胞转运[22］．实验数据与此一致，而PLL-g-PEG-DNA纳米颗粒在2 h后以能量依赖的方式内化，超过6 h后在核周区域积聚[23］．在该研究中，作者证明纳米颗粒在细胞质中至少稳定24小时，且不与内体途径共定位。此外，染料木素(一种小泡介导途径的抑制剂)对纳米颗粒摄取的抑制率约为50%。然而，网格蛋白介导的内吞和巨胞吞途径在各自抑制剂的存在下分别减少了17%和24%。这些发现表明，PLL-g-PEG-DNA纳米颗粒通过几种途径进入，因此可能是一种高效和多功能的工具来传递治疗性DNA [23］．另一方面，一些作者证明二氧化硅纳米颗粒(通过ROS)诱导细胞凋亡[24］．为此，我们研究了np处理的细胞中的ROS和过氧化氢，我们证明对它们没有影响。这种差异可能是由于以前的作者使用了更大的剂量。

纳米粒子负载药物的释放可根据温度和ph值等环境条件的变化进行控制。纳米药物在体内的生物分布概况和抗癌功效会因其大小、表面电荷、聚乙二醇化和其他生物物理特性而不同[16］．通过诱导t细胞免疫，纳米粒子不仅可以为癌症提供治疗方法，还可以为传染病提供新的预防策略[25]，预计纳米技术在纳米医生的快速发展领域发挥至关重要作用的原因，为目前无法治疗的疾病创造创新的解决方案和疗法，为各种生物医学应用提供新工具，例如药物递送和基因治疗[26］．

5.结论

本研究揭示了WEV和WEV+NP对MM细胞独特的生物学效应，使这些化合物能够作为MM的治疗手段。

缩写

MM:	多发性骨髓瘤
NP:	纳米粒子
WEV:	Walterinnesia aegyptia毒液
WEV + NP：	Walterinnesia aegyptia毒液结合纳米颗粒。

利益冲突

所有作者均已阅读并同意论文内容并批准投稿。作者宣称他们没有利益冲突,国家提交的手稿没有被发表或在其他地方,州工作符合期刊的道德政策和国家工作进行了相关的伦理审查后在国际公认的道德标准。

作者的贡献

D.赛义德进行了实验，进行了统计分析，准备了数据，起草了论文。M. K. Al-Sadoon负责提取蛇毒，并参与了手稿的修订。G. Badr制定了研究设计并参与了手稿的修订。

致谢

这项工作得到了国家科学技术计划(NPST)的支持，该计划由阿卜杜勒阿齐兹国王科技城(KACST)资助。10-BIO969-02。作者还感谢沙特国王大学阿卜杜拉国王纳米技术研究所的Ahmed El-Toni博士将毒液加载到二氧化硅纳米颗粒上。

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版权

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