持续扩增DNA损伤信号参与复制的正常人类二倍体成纤维细胞的衰老

文摘

疫源地的磷酸化组蛋白H2AX和ATM代理标记的DNA双链断裂。我们之前报道,残余病灶大小增加了辐照后,这加剧了DNA损伤的信号。在这里,我们解决DNA损伤信号的放大是否参与复制的正常人类二倍体成纤维细胞的衰老。大磷酸化H2AX疫源地(> 1.5μ米直径)特别在presenescent发现细胞。细胞的频率与大疫源地与senescence-associated阳性的细胞β牛乳糖染色。缺氧细胞培养条件正常人类成纤维细胞的复制寿命延长,我们发现大疫源地推迟这些细胞的形成。immuno-FISH分析表明,大焦点部分本地化在衰老细胞的端粒。重要的是,大疫源地的磷酸化H2AX总是与磷酸化与ATM疫源地。此外,Ser15-phosphorylated p53显示colocalization大疫源地。因为衰老细胞的治疗与磷酸肌醇3-kinase抑制剂,渥曼青霉素,抑制p53磷酸化,建议放大DNA损伤信号维持ATM-p53通路持续活化,这对于复制衰老是至关重要的。

1。介绍

众所周知,正常的人类体细胞复制寿命有限,导致从永久性细胞周期阻滞持续激活引起的DNA损伤检查点(1]。因此,据推测,unreparable和持续的DNA损伤可以复制衰老的触发。已经被广泛接受,缩短端粒导致持续激活的DNA损伤检查点(2]。端粒一般形成毛圈结构,否则,端粒的DNA-ends可能感觉到DNA双链断裂(双边带)3]。实验,端粒功能障碍之间的关系,研究了复制衰老使用显性负TRF2蛋白质。端粒循环使端粒的DNA-ends坍塌,导致衰老感应在正常人类成纤维细胞(4,5]。因此,很明显,端粒功能障碍是复制衰老的主要原因。

当端粒功能障碍激活DNA损伤检查点因素,DNA损伤信号可以复制衰老的关键(6]。例如,磷酸化H2AX焦点,这通常被称为γH2AX焦点,被视为有代理标记DNA损伤信号激活,和磷酸化H2AX疫源地的形成通常观察到复制衰老(7,8]。此外,immuno-FISH分析的结合immunofluorescent检测焦点与端粒和端粒鱼显示病灶形成发现鱼在衰老细胞信号,表明衰老细胞端粒导致双边带。此外,两个全基因组研究揭示浓缩H2AX磷酸化以及另一个DNA损伤检查点因素,最后53 bp1,衰老的染色体正常的人类成纤维细胞(7,9]。因此,DNA损伤信号端粒功能障碍似乎引发了复制衰老的关键。

很明显,各种外部压力过早导致DNA损伤诱导senescence-like功能正常的人类成纤维细胞。例如,电离辐射诱导senescence-like生长报道逮捕(SLGA) [10]。它已经表明,持久unreparable双边带导致SLGA,似乎相当于双边带位于端粒末端复制衰老细胞(11]。事实上,我们以前发现持久的焦点在不同大小的细胞中诱导SLGA [12]。最初的焦点,辐照后立即检测到,很小,大多数初始焦点迅速消失了。相比之下,持续焦点特别是在几天后辐照的规模相当大,和大疫源地中观察到细胞接受SLGA。因为大焦点不断放大DNA损伤信号,长期激活DNA损伤检查点应该逮捕不可逆转的经济增长起到了关键的作用。因此,我们这里解决DNA损伤信号的放大是否参与复制的正常人类二倍体成纤维细胞的衰老。

2。材料和方法

2.1。细胞培养和试剂

HE49,正常的人类二倍体成纤维细胞呈指数生长在鹰的最低基本培养基(Nissui、东京、日本)补充10%胎牛血清(热跟踪有限公司,维克,澳大利亚)。常氧细胞培养是在37°C湿润孵化器有限公司为5%₂和95%的空气,和缺氧细胞培养进行湿润孵化器(Ikeda科学有限公司,东京,日本)有限公司为5%₂,2%的人啊₂,93% N₂通过提供氮气从氮气发生器(小岛,京都,日本)。人口翻番水平(PDL)由以下方程计算 ””或““显示细胞培养后的细胞数量计算或电镀种子细胞数量。”每个通道的“代表人口翻倍水平。

2.2。免疫荧光染色

细胞生长在盖玻片上表示PDL与冷PBS洗一次⁻然后用4%多聚甲醛固定/ PBS⁻解决方案在室温下10分钟之后,特里同x - 100 / PBS透化作用为0.5%⁻5分钟在冰上的解决方案。另外,preextraction治疗,排除chromatin-free核蛋白质是由序贯疗法如下,透化作用与细胞骨架Triton x - 100 0.5%,埋头(10毫米HEPES-KOH, pH值7.4,300毫米蔗糖,100毫米氯化钠,MgCl 3毫米₂6小时₂O)缓冲对冰2分钟,4%多聚甲醛固定/埋头在室温下缓冲了20分钟,然后0.5% NP-40 /埋头buffer-treatment在室温下5分钟。主要的抗体治疗2 h在37°C以下列出的抗体;鼠单克隆antiphosphorylated H2AX Ser139抗体和兔多克隆antiphosphorylated H2AX在Ser139抗体(美国纽约北部生物技术),兔多克隆antiphosphorylated ATM在Ser1981抗体(美国宾夕法尼亚州罗克兰),鼠标单克隆anti-p53(美国实验室愿景,CA)和兔多克隆antiphosphorylated p53在Ser15(细胞信号技术、马、美国)。主要抗体治疗后,Alexa萤石488 -共轭山羊antimouse兔抗体或Alexa萤石594 -共轭antimouse或兔抗体(美国或分子探针)被视为二次抗体1 h在37°C。核和4′,复染色6-diamidino-2-phenylindole (DAPI 10 ng / mL;分子探针,或者美国)或碘化propidiumπ。图像获取与一个奥林巴斯荧光显微镜,然后分析了IP实验室软件(美国弗吉尼亚州Scanalytics)。

2.3。Immuno-FISH

如前所述(执行Immuno-FISH化验13]。简单,细胞被固定,permeabilized沾antiphosphorylated组蛋白H2AX抗体如上所述。免疫荧光染色步骤后,标记蛋白质交联有4%多聚甲醛/ PBS⁻在室温下为20分钟。样本然后脱水在70%、90%、和100%乙醇3分钟每风干,和DNA变性了30分钟电炉在80°C。与telomere-PNA探针杂交后5 h,这些细胞被洗了三次以70%甲酰胺/ 10毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值6.8,15分钟,之后5分钟洗0.05三羟甲基氨基甲烷/ 0.15 M氯化钠液pH值7.5 / 0.05%渐变20到5分钟用PBS⁻。微观分析中描述的部分免疫荧光测定。

2.4。衰老相关的β牛乳糖染色

SA -β加染色进行了如前所述[14]。简单地说,细胞被镀成35毫米盘和第二天,它包含0.2%戊二醛和2%多聚甲醛固定在室温下5分钟。固定后,细胞被洗广泛与PBS⁻与染色,然后被孵化的解决方案(40毫米柠檬酸/磷酸钠,pH值6.0,5毫米亚铁氰化钾,5毫米铁氰化钾,150毫米氯化钠,MgCl和2毫米₂包含1毫克/毫升5-bromo-4-chloro-3-indolyl)β和光纯化学工业,-D-galactopyranoside,半乳糖苷(kouichi有限公司,大阪,日本)。

2.5。细胞周期分析

细胞生长的盖玻片固定与冰冷的70%乙醇室温5分钟。广泛的用PBS清洗过程⁻样本处理π(50μ包含200 g / mL)染色方案μg / mL核糖核酸酶为30分钟37°C。使用激光扫描细胞周期分析血细胞计数器(lsc - 101、奥林巴斯、东京)。

2.6。免疫印迹

也准备了完整的细胞提取物radioimmune降水分析缓冲区(50 mM Tris-HCl, pH值7.2,150毫米氯化钠,NP-40 1%, 1%钠脱氧胆酸盐,和0.1% SDS)包含1 x蛋白酶抑制剂。转移的膜蛋白sds - page分离的探索与主要抗体室温2 h其次是生物素化的antimouse或兔免疫球蛋白抗体(Amersham法玛西亚生物技术,英国)作为二级抗体,乐队是可视化使用碱性磷酸酶检测系统(Amersham法玛西亚生物技术,英国)通过添加氮蓝四唑/ 5-bromo-4-chloro-3′-indolyl磷酸(美国罗氏诊断)。

3所示。结果

3.1。疫源地的增长磷酸化H2AX复制衰老

在复制衰老的正常的人类DNA损伤信号放大二倍体成纤维细胞的免疫荧光染色法检测磷酸化组蛋白H2AX Ser139不同的自由人民党(图1(一))。组蛋白H2AX进行磷酸化,形成点状病灶在PDL12近10%的细胞,当细胞指数激增,大多数细胞- SA -β加染色(图1(一),1 (b)和2(一个))。与增加PDL细胞的频率逐渐升高,它达到了近80%在PDL 61年,当大约60%的细胞呈阳性SA -β加。根据我们之前的标准(15),超过1.5的焦点μ米直径的人被认为是在复制衰老大疫源地。没有观察到大疫源地形成PDL 12。然后,大疫源地积极细胞的频率略高的文化PDL 55天,他们61年近60%的在PDL细胞形成。大约有65%的阳性细胞为H2AX磷酸化显示大疫源地。SA -的频率β加阳性细胞是与细胞与大疫源地文化的天。这些数据表明,大疫源地形成DNA损伤检查点相关因素与复制衰老的感应。

本地化的大疫源地调查Immuno-FISH分析结合immunofluorescent H2AX检测磷酸化与端粒鱼(图1 (c))。而大疫源地与端粒信号没有colocalize PDL 21日大疫源地与端粒相关信号在61年自由人民党(图中观察到25%1 (d))。应该提到大焦点完全与磷酸化ATM的焦点,也就是说,活动形式的自动取款机,在任何自由人民党(图1 (e))。这些数据表明ATM-dependent DNA损伤信号放大的大疫源地在衰老细胞,表明不仅功能失调的端粒间质DNA断裂可能与衰老相关的归纳。

3.2。扩展的复制寿命延迟大疫源地磷酸化H2AX的形成

衰老之间的联系感应和大疫源地形成进一步检查在2%的低氧条件下培养的细胞中复制寿命延长(16]。细胞用于本研究最初是在常氧条件下培养了PDL 21前搬到缺氧的文化条件。然后,他们被分成两个不同的文化条件下,缺氧和normoxia。因此,我们设置一天0在文化PDL 21。两组细胞分别维护和亚文化在同一天。PDL细胞也同样高的初始文化时期,然而,细胞生长完全停止在常氧条件下约65天,细胞在缺氧条件持续超过8细胞分裂增殖,最后逮捕了大约80天(图2(一个))。S期细胞周期分析表明,生长逮捕延迟缺氧条件下得多(数字2 (b)和2 (c))。例如,S期分数,在13天,分别为类似的发现在normoxia和缺氧。normoxia下是显著减少5%,而分数仍在16%在天59缺氧,最终发现在93天减少到4%。在缺氧条件下,大疫源地形成类似的观察,如图1然而,他们发现很晚而在常氧条件下培养的细胞(图2 (d))。因此,这些数据表明,大疫源地是由内源性生成氧化应激,和大病灶的形成与衰老密切相关的归纳。

3.3。ATM-p53通路的激活庞大的磷酸化H2AX疫源地

我们下一个检查ATM-p53通路是否参与持续激活衰老细胞的细胞周期阻滞。复制衰老HE49,积累p53伴随着磷酸化Ser15和transactivation观察p21的文化。尤其是p53-p21通路时持续调节p16也诱导(图3(一个))。p53然后用免疫荧光染色后,福尔马林固定表示自由人民党(图3 (b))。大约有20%的细胞在PDL 21弱p53表达核(“+”,如图3 (c)),和其他人在检测p53的水平。增加p53-expressing在PDL细胞观察61年发现在西方墨点法(图3(一个)),p53高度积累在PDL 61(30%表示“+ + +”,如图3 (c))。有趣的是,积累p53与磷酸化ATM疫源地(图形成与焦点3 (b))。p53也是可视化preextraction接受治疗的细胞的福尔马林固定(图紧随其后3 (d))。Preextraction移除chromatin-free核蛋白质和积累p53在核消失,当聚合p53还发现在网站形成大疫源地的磷酸化ATM。此外,Ser15-phosphorylation形式中也检测到p53大疫源地的磷酸化ATM preextraction后(图3 (e))。此外,ATM的影响在p53在Ser15磷酸化激酶抑制衰老细胞显示抑制磷酸化水平特别是在低剂量(图3 (f)),这表明ATM参与激活p53在复制衰老。这些数据表明ATM-p53通路持续活化衰老细胞的大型网站的焦点。

4所示。讨论

目前的研究表明DNA损伤持续放大信号参与复制衰老。

普遍认为,长期在功能失调的端粒DNA损伤反应的激活导致不可逆的细胞周期阻滞在复制衰老17]。事实上,疫源地形成在衰老细胞的端粒检测(7,8]。我们当前的研究扩展了这些观察和补充证据,在功能失调的端粒DNA损伤信号大多是放大。

我们之前的研究结果表明,DNA损伤信号的放大与ATM-p53通路持续活化足够逮捕执行不可逆转的G1对电离辐射(11,12]。我们还表明,增加病灶的大小是必不可少的DNA损伤信号的放大。事实上,残余病灶,维持了几天辐照后,大疫源地,是激活p53的不可或缺的15]。目前的研究清楚地表明,大疫源地的形成也发生在复制衰老细胞(图1(一))。我们的结果如下:(1)增加细胞的大疫源地与衰老感应(图1 (b)),(2)缺氧细胞培养、扩展复制寿命、延迟大疫源地(图的形成2),表明DNA损伤信号的放大之间的相互关系,归纳复制衰老。

人们一直认为端粒功能障碍导致DNA损伤反应的激活。功能失调的端粒是能够探测到焦点的形成伴随着端粒DNA损伤检查点因素鱼信号,所谓telomere-induced焦点(TIF) [8,13气管无名动脉瘘管的),我们也发现在25%的衰老细胞(图1 (c))。气管无名动脉瘘管的人们普遍认为是无上限的端粒暴露端粒的DNA-ends。因此,它假定unreparable双边带长期激活DNA损伤反应的原因8]。另一方面,我们之前的数据代表的本地化磷酸化H2AX焦点不仅在双边带站点还具双着丝的染色体(18,19]。它也表明,telomere-telomere fusion-mediated具双着丝的染色体形成MRC-5和WI-38衰老正常人成纤维细胞的20.,21气管无名动脉瘘管的),建议另一种可能性,可能反映了地区具双着丝的染色体来自端粒融合。确实immuno-FISH分析表明,大疫源地没有telomere-FISH衰老细胞的75%(图信号1 (c))。中村等人精确分析病灶形成的中期染色体利差presenescent WI-38和BJ正常人成纤维细胞22]。他们发现焦点定位在染色体中缺乏telomere-FISH信号中发现超过50%的疫源地presenescent中期利差。因此,大疫源地形成没有telomere-FISH信号telomere-FISH分析可能涉及这样的焦点。另外,telomere-telomere融合后,Fusion-Bridge-Breakage (FBB)周期可能启动双边带间隙染色质区域(23]。一旦功能失调的端粒融合并生成具双着丝的染色体,在后期两个着丝粒是在相反的方向。这样的染色体区域紧张,最终,在间质染色质DNA开始打破地区具双着丝的染色体。模型的基础上,功能失调的端粒可能在大疫源地形成的一种机制在复制衰老,但是间隙染色质区域也可能是候选人为DNA末端。

p21 Formationoflarge疫源地激活ATM-p53通路,从而触发transactivation。代表,p53-p21途径以及p16与不可逆的增长在衰老细胞被捕,尤其是p16表达升高在衰老后期阶段(24]。我们还证实诱导复制衰老(图的两种途径3(一个))。我们发现,低浓度的渥曼青霉素治疗衰老细胞p53的显著抑制Ser15-phosphorylation(图3 (f))。先前的报道表明,集成电路₅₀ATM的渥曼青霉素治疗大约是5μ米(25,自动取款机,但不是dna - pk称为Ser15-phosphorylation p53的一个主要因素在活的有机体内为了应对双边带(26]。因此,可以得出结论,ATM-dependent激活p53在大焦点放大。

总之,这里介绍我们的数据提供强大的大疫源地形成DNA损伤检查点之间的相关性因素和复制衰老归纳。大焦点可能形成在功能失调的端粒以及间质染色质区域,确保持续激活的DNA损伤反应。因此,持续放大DNA损伤信号通过ATM-p53通路在复制衰老中起着至关重要的作用。

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