文摘
背景。衰老是一个多因子的过程表现为生理功能逐步下降。减少肾脏功能与心血管疾病和死亡率相关。因此,增加我们了解肾脏衰老通过了解解剖,生理,病理变化在肾脏衰老的老年人的重要,以防止灾难性的结果。方法。男2 -,12 -,大和24 C57 / BL6小鼠被用于这项研究。我们测量组织学变化、氧化应激、肾脏和体内蛋白质的表达。结果。Twenty-four-month-old老鼠显示增加蛋白尿。肌酐清除率下降与衰老,虽然这不是统计学意义。有阻力指标纤维化也许可以增加血管系膜体积和24-month-old老鼠。也有增加F4/80表达和细胞凋亡被TUNEL分析。尿液isoprostane排泄增加与衰老和SOD1 SOD2减少24-month-old老鼠。氧化应激可能是由Sirt1减少,PGC-1α,ERR-1α,PPARα表达式。克罗索表达式也降低了。结论。我们的结果表明,Sirt1是与衰老和减少可能与目标分子包括PGC-1改变α/ ERR-1α信号和PPARα。克罗索也能导致氧化应激。药物靶向这些信号分子可能减少肾脏衰老的病理变化。
1。介绍
老化在大多数物种与受损的适应性和自我平衡的机制,导致对环境或内部应力率增加的疾病(1,2]。许多不同的理论主要disease-independent肾衰老,可分为进化、分子、细胞和系统性,已经提议在过去和最近的研究提供了证据,这些理论(3]。
与年龄相关的变化导致的几个器官功能下降,包括肾脏(4]。描述了与年龄相关的肾脏结构和功能的变化(5),不仅在人类但在范围广泛的其他物种,包括大鼠、小鼠、仓鼠,狗和猫。修改相关的肾脏老化包括肾小球结构变化。随着肾脏功能变得年长,肾小球基底膜增厚和起皱与毛细循环损失有关,和系膜扩张矩阵的结果之间的不平衡细胞外基质的形成和删除(6]。
轻度肾功能的变化与衰老往往伴随着管功能变化,这未必是公认的人类,除非他们导致疾病或病理条件的强调。这些变化包括减少钠体内平衡的损失与浓缩或稀释尿液的能力在年轻人中看到的程度(7],它会加重脱水在老年人中。运输也有障碍的一系列其他电解质和离子在管状上皮细胞,以及降低药物排泄。直接和间接的激素功能肾也随着年龄的变化,包括钝化肾素反应(8]。
众所周知,正常的衰老过程与干扰细胞内生理现象包括端粒缩短,减少克罗索表达式,失活的无声信息监管机构T1 (SIRT1),激活肾素-血管紧张素系统和氧化应激。糖尿病和代谢综合症被认为导致相同类型的器官损伤衰老过程,特别是在肾脏,心脏,神经。因此,我们研究了肾的过程改变小鼠的衰老过程中,关注SIRT1的变化,过氧物酶体proliferator-activated受体α(PPARα),克罗索,氧化应激相关酶(9- - - - - -11]。
2。材料和方法
2.1。动物模型
天主教大学动物保健委员会批准了实验性的协议。老化的C57BL / 6小鼠从韩国购买生物科学和生物技术研究所(Chungcheongbuk-do、韩国)。老鼠被安置在一个控制温度和控制光的环境。小鼠被分为三组:丽江组(2 M组,),12个月大的组(12 M组,),大和24组(24 M组,)。
2.2。肾功能
老鼠放在个人老鼠代谢笼(Tecniplast、Gazzada、意大利)提供水和食物为后续测量24小时收集尿液白蛋白、肌酐浓度。蛋白尿(Albuwell M, Exocell、费城、PA)和尿肌酐(肌酐的同伴,Exocell)使用ELISA试剂盒测定。测量血清肌酐浓度进行Samkwang医学实验室(首尔,韩国)使用酶比色方法(模块化民进党系统,罗氏,汉堡,德国)。肌酐清除率是使用标准公式计算(尿肌酐(mg / dL)×尿液体积(毫升/ 24 h) /血清肌酐(mg / dL)×1440(最小/ 24 h))。
2.3。组织学
肾脏样本固定在10%福尔马林。组织是嵌入在低温石蜡融化,和4 -μ米部分处理和沾hematoxylin-eosin(他),周期性acid-Schiff (PAS),和马森的三色的。肾小球体积和系膜区通过检查确定不是部分使用彩色图像分析仪(TDI范围眼,3.5版本的Windows,奥林巴斯,东京,日本)。相对系膜区被表示为系膜/肾小球面积。阻力指标纤维化也许可以找到的是定义为一个matrix-rich扩张与管状扩张,间质小管萎缩,肾小管形成和肾小管基底膜增厚。十个领域每部分进行评估。
2.4。免疫组织化学
石蜡切片是deparaffinized二甲苯和水化乙醇在染色标记的炎症,包括巨噬细胞(AbD Serotec F4/80,牛津大学,英国)。部分是处理一个antigen-unmasking解决方案组成的10毫米柠檬酸钠,pH值6.0,然后用磷酸盐(PBS)。部分是孵化H为3%2O2在甲醇阻断内源性过氧化物酶活性。马血清非特异性结合被10%正常。孵化后主要抗体(F4/80 1: 50)在4°C一夜之间,抗体与peroxidase-conjugated二级抗体使用矢量可视化打动工具包(向量实验室,伯林盖姆,CA)。部分然后在乙醇脱水,清除在二甲苯和安装没有复染色。所有部分都是评估使用彩色图像分析仪(TDI范围眼,3.5版本的Windows,奥林巴斯)。
2.5。TUNEL分析
细胞凋亡是量化使用原位TUNEL检测化验设备(Chemicon国际,泰梅库拉,CA)。TUNEL-positive肾脏细胞的数量确定使用1000×放大。
2.6。免疫印迹分析
从肾皮质组织总蛋白提取Pro-Prep蛋白分离的解决方案(内含生物技术、京畿道,韩国)根据制造商的指示。使用下面的抗体免疫印迹分析:衬衫1(1:2000年,寿命生物科学、西雅图、佤邦),克罗索(1:5000年,Kyowa白光Kogyo有限公司,静冈市,日本),PPARα(1:1000年,Abcam、剑桥、MA), PGC-1α罗福斯生物制品(1:2000年,利特尔顿有限公司),estrogen-related receptor-1α(ERR-1α微孔)(1:2000年,Billerica, MA),超氧化物歧化酶1 (SOD1)(1: 5000年,试验设计,罗彻斯特,纽约)和超氧化物歧化酶2 (SOD2)(1: 10000年,Abcam)β肌动蛋白(σ1:10000年,圣路易斯,密苏里州)。
2.7。评估肾脏氧化应激
评估氧化应激我们测量了24小时尿8-epi-prostaglandin F2α(isoprostane) (OXIS保健品公司,促进城市,CA)浓度。
2.8。统计分析
数据表示为±标准错误(SE)。组织之间的差异都检查使用方差分析有统计学意义Bonferroni调整(SPSS 11.5 v, IBM,阿蒙克,纽约)。一个值小于0.05被认为是显著的。
3所示。结果
3.1。蛋白尿、血清肌酐和肌酐清除率
24 M组显示24小时蛋白尿高于2 M集团()(图1(一))。虽然并没有显著的差异,血清肌酐增加24 M组与其他组相比(图1 (b))和肌酐清除率也减少24 M组与组(图12米1 (c))。因此,这些结果表明,老化与肾功能恶化相关。
(一)
(b)
(c)
3.2。组织学检查
组织学检查发现,系膜区扩大24 M组的3.5和2.1倍,比2 M组和12 M组,分别为(与2米)(数据2(一个),2 (c))。也有阻力指标纤维化也许可以显著增加24 M组,19岁,18.2倍2 M组和12 M组,分别为(与2米)(数据2 (b),2 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.3。免疫化学F4/80和TUNEL检测
炎性细胞浸润,由积极的存在表示F4/80细胞,显著增加24 M组与2 M组和12 M集团(和2米)(图3)。我们也调查了TUNEL-positive肾脏细胞的三个实验组。与2 M组相比,24 M组明显更多的TUNEL-positive肾小球细胞(与2米)(数据4(一),4 (b))和皮质管区域(与2米)(数据4(一),4 (c))。这些结果说明老化阻力指标纤维化也许可以与系膜扩张和增加有关,这可能与炎症和细胞凋亡有关。
(一)
(b)
(c)
3.4。24小时尿8-epi-PGF2水平α
Isoprostane浓度增加12 M组和24 M组比2 M组(和分别对2米)(图5)。这些发现表明,氧化损伤增加换肾细胞衰老的老鼠。
3.5。SOD1和SOD2的表情
通过免疫印迹分析,我们研究了抗氧化蛋白SOD1和SOD2的变化。SOD1的表达和SOD2减少24 M组与2 M组,低于12 M组。(和,分别地。,和2米)(图6)。
(一)
(b)
(c)
3.6。SIRT1的表达
SIRT1激活可以由几个细胞条件影响,如氧化应激。的相关内容SIRT1蛋白质免疫印迹分析衡量,这表明,SIRT1蛋白质水平显著降低在24米组与2 M组和12 M集团(与2米)(数据7(一),7 (b))。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.7。表达PGC-1α和ERR-1α
PGC-1α产生广泛的影响和直接coactivates多个转录因子,包括核受体如PPARs和犯错误。肾脏的衰老过程,减少了SIRT1可能调节PGC-1α。免疫印迹分析表明PGC-1α减少在24 M组与2 M组和12 M集团(与2米)(数据7(一),7 (c))。ERR-1逐渐减少α表达式的12 M组和24 M组与2 M组(与2米)(数据7(一),7 (d))。
3.8。PPAR的表达α
PPARs发挥重要作用在细胞分化的规定,开发和高等生物代谢和肿瘤发生。PPARα表达在肾脏低24 M组的价格相比2 M组和12 M组,通过免疫印迹分析评估(和2米)(图8(一个))。
(一)
(b)
3.9。就这种基因的表达
克罗索是一种跨膜蛋白,除了其他影响,提供了一些控制机体对胰岛素的敏感性和似乎是参与衰老。在肾脏,克罗索是减少老化。我们的研究结果显示,24米克罗索水平下降组与2 M组和12 M集团(和2米)(图8 (b))。
4所示。讨论
衰老是一个多因子的过程表现为生理功能逐步下降。在这项研究中,我们调查了有关的生理和病理变化在肾脏衰老。肌酐清除率下降和蛋白尿增加老化。阻力指标纤维化也许可以也有增加的系膜卷,,炎症(F4/80阳性细胞)和细胞凋亡。病理改变的速度衰老可能取决于血管紧张素ⅱ水平,一氧化氮(NO)、转化生长因子β高级糖基化终产物(AGE),氧化应激和脂质12]。我们的研究表明,组织损伤衰老可能发生氧化应激(13,14)由SIRT1, PGC-1α,PPARα和克罗索15]。
组织损伤的老化可能发生自由基产量和/或抗氧化酶缺乏与随后的脂质过氧化反应和氧化应激(13,14]。岁肾脏显示增加活性氧的水平和thiobarbiturate acid-reactive物质,这与脂质氧化损伤(16]。此外,氧化应激和脂质过氧化作用的其他标记,如isoprostanes,年龄,和增加血红素加氧酶,也指出在老年大鼠(17]。尿液isoprostane排泄随着年龄的增加在这个研究和表达SOD1 SOD2 24-month-old老鼠也减少了。许多研究已经进行评估的方法防止衰老过程与饮食富含抗氧化剂如维生素E (17)或与血管紧张素转换酶抑制剂(18)或血管紧张素受体阻滞剂。血管紧张素ⅱ的血流动力学效应增强肾脏的衰老过程诱导intraglomerular高血压和随后的肾小球损伤。它也会影响没有合成、氧化应激、免疫调节,诱导生长因子、炎症、细胞迁移和细胞凋亡12,19]。这些发现表明,肾素血管紧张素醛固酮封锁可能是一个潜在的治疗治疗防止衰老过程。
在这项研究中,我们表明,SIRT1表达减少24-month-old老鼠。SIRT1表示整个身体,具有广泛的生物学效应,可以显著影响细胞的生存和寿命期间急性和长期的损伤机制涉及氧化应激和细胞代谢(20.]。细胞中,SIRT1使用NAD +作为基质,但NAD +水平也可以控制SIRT1的脱去乙酰基活动。SIRT1激活可以由几个细胞条件影响,如热量限制,运动,和氧化应激21]。假设Sirt1和活化蛋白激酶(AMPK)周期调节,共同分享许多共同目标分子,如PGC-1α、PPARs Forkhead盒(FoxO)和NF -κB (22]。有人建议,激活AMPK和SIRT1允许并发脱乙酰作用和磷酸化的目标分子,减少容易衰老。肾脏的衰老过程,减少了SIRT1可能调节PGC-1α。我们建议aging-induced抑制SIRT1 / PGC-1α信号可能会增加氧化应激与AMPK在合作。这个信号也会影响分解代谢,线粒体功能、血管再生、炎症和胰岛素抵抗[22]。
PGC-1α产生广泛的影响和直接coactivates多个转录因子,包括核受体如PPARs [23,24)或糖皮质激素受体(25),雌激素受体和犯错误20.,26)和非核的受体转录因子包括肌细胞增强因子2 (27)和FoxO家族转录因子(28]。通过同时coactivating这些转录因子,PGC-1α可以快速和协调调节转录程序,控制能量代谢。尽管PGC-1αcoactivation可以改变以应对不同的刺激或组织的方式,肾脏PGC-1的衰老过程α通过提高PPAR的表达产生影响α和它的目标分子ERR-1α。ERR-1α由PGC-1激活α和PPARα诱发基因与角色在脂质运输(29日),氧化磷酸化30.,31日),脂肪酸氧化32,33),三羧酸循环(23,34,35],线粒体生物起源[30.,33),和氧化应激防御(36]。在我们的研究中,PGC-1的表情α/ ERR-1α也减少了与衰老,诱发氧化应激。
PPARs能源体内平衡发挥重要的生理作用和炎症。PPARα刺激没有被证明能增加系统培养内皮细胞(37)和诱导超表达蛋白质和RNA酶水平SOD1等培养的人脐静脉内皮细胞(38]。PPARα抑制衰老可以诱导氧化应激,导致阻力指标纤维化。也许可以系膜扩张和PPARα在老化过程中激活可以改善肾功能(39]。
克罗索基因最初是标识为假定的age-suppressing基因在小鼠体内扩展寿命当过表达(35]。有两种类型的蛋白质克罗索。膜克罗索函数作为调节分泌荷尔蒙的受体的磷酸盐和合成活性维生素D的肾脏。克罗索分泌功能体液因子与多效性的活动,包括生长因子信号的抑制,抑制氧化应激,调节离子通道和转运蛋白(35]。克罗索主要是肾远端肾小管细胞中表达。动物研究表明,这种蛋白质的nephroprotective影响大多归因于其可溶性形式的抗氧化性能36]。糖尿病、高血压、肾脏疾病和老化减少克罗索蛋白的表达,从而增加钠/磷酸盐转运蛋白活性和氧化应激,进而诱发血管钙化和内皮功能障碍。有新兴数据从人类研究表明克罗索可能是一种可改变的因素参与心血管和肾脏疾病的发病机制在高危人群。这部小说进一步数据需要确认是否蛋白质有可能作为治疗工具,可以用来防止或减缓cardiorenal疾病的进展36]。
5。结论
总之,我们的结果表明,衰老过程与肾功能的恶化和增加阻力指标纤维化,也许可以系膜扩张,可伴有炎症、细胞凋亡和氧化应激。SIRT1表达式与衰老和减少可能与改变PGC-1等目标α/ ERR-1α信号和PPARα。减少克罗索也能导致氧化应激。药物靶向这些信号分子可能减少肾脏衰老的病理变化。
作者的贡献
c . w .公园和b . s . Choi贡献同样这项工作。
确认
这项研究受到了基础科学研究项目通过韩国国家研究基金会(NRF)由教育部、科技部(2011 - 0023126)和朝鲜卫生技术研发项目,资助卫生和福利部,大韩民国(批准号A111055)。