文摘

鞘氨醇激酶(SphK)展览两个亚型,SphK1 SphK2。两种催化鞘氨醇的合成1-phosphate (S1P),一位参与缺血预处理(IPC)的鞘脂类。自比SphK1: SphK2随着老化而发生惊人的变化,重要的是评估SphK2红外损伤和IPC的角色。Langendorff老鼠心脏受到红外(全球缺血30分钟平衡,50分钟,40分钟再灌注)。IPC由缺血和再灌注2分钟2分钟的两个周期。在基线,没有不同的左心室压力(LVDP)开发,±dP/ dt马克斯,心率之间SphK2 null (KO)和野生型(WT)的心。在KO的心,SphK2活动被察觉,SphK1活动和WT相比持平。总SphK活动降低了53%。SphK2 KO的心受到红外展出更多心脏损伤(%梗塞大小)与WT (%梗塞大小);缺血后恢复LVDP低KO的心。在WT心中IPC对心脏保护。IPC对红外的保护作用是减少KO心里有更高的梗塞大小(%)相比IPC / IR组在控制心%)。西方分析显示,KO心有实质性的磷酸化水平p38可以使心脏红外受伤。因此,删除SphK2基因的糖分会让红外的心肌损伤和减少IPC的保护作用。

1。介绍

长时间曝光的心肌缺血导致细胞损伤。这对再灌注损伤发生,因此它被称为缺血/复氧(I / R)损伤。活性氧形成再灌注后,和他们牵扯因素损伤(1]。I / R损伤的特点是穷人在再灌注血流动力学功能的恢复和梗死的广泛区域的发展2]。防止I / R损伤可以由缺血预处理(IPC)提供。IPC由短期I / R之前长期(指数)缺血和再灌注。IPC的触发细胞通过pannexin-1 / P2X受体激动剂,从细胞释放₇渠道(3]在短暂的缺血。这些受体激动剂受体结合g蛋白耦合激发保护性反应(4- - - - - -6]。这些包括腺苷、缓激肽和阿片类药物(4,5)和sphingosine-1-phosphate (S1P) [6]。

S1P是一个重要的细胞内信号分子,调节不同的细胞事件和细胞生长和prosurvival效应(7- - - - - -9]。这些细胞信号影响部分由S1P绑定到特定的细胞表面G-protein-coupled受体(7- - - - - -10]。在心脏,S1P心血管研究揭示的培养心肌细胞(11,12),以及体外孤立的心(3,6,13]。S1P引起的肌细胞生存能力的增加可能与激活prosurvival通路,包括PI-3K / Akt和bcl - 2表达之后增加了细胞色素C的释放减少和预防半胱天冬酶激活(9,12]。

鞘氨醇激酶(SphK)是酶负责S1P的形成。它展示两个亚型(SphK1和SphK2)在心脏14- - - - - -16]。SphK1似乎是一种保护性的激酶,其过度增加细胞内S1P内容和促进细胞生长和存活(17- - - - - -19]。事实上,研究SphK1 SphK1 null老鼠证明损失的糖分会让心肌I / R损伤,导致缺血性预处理和缺血后处理的损失(20.,21]。

SphK2在细胞生存的作用尚不明朗。研究电池系统表明,SphK2 SphK2的抗增殖和proapoptotic22- - - - - -24]。相比之下,它最近表明SphK2-directed S1P合成在线粒体对适当的呼吸链的装配(很重要25),因此SphK2活动可能限制呼吸链自由基的生产。在这个场景中,SphK2会保护。辨别SphK2的角色很重要,尤其是对老化发现SphK2活动,但不是SphK1,随老化(26]。然而,迄今为止,没有研究Sphk2的作用在细胞损伤的心已报告。因此,本研究的主要目标是利用老鼠的心,拥有一个灭活SphK2基因确定SphK2影响敏感心肌红外IPC赋予的伤害或心脏保护。

2。结果

2.1。基线特征

基线参数WT和SphK2 KO老鼠心脏不不同。分别为WT KO,没有体重的差异(克和g)、心脏重量(与毫克)、心率(与bpm)或左心室压力(LVDP)基线(开发与毫米汞柱)。KO小鼠表现出没有明显的表型,正常繁殖,血管的正常发展,过一个正常的寿命。

2.2。验证删除SphK2 SphK2和损失的活动

PCR分析DNA的尾巴剪(图1)透露,SphK2空心确实缺乏一个完整的长度SphK2基因。心从零老鼠和WT老鼠subfractionated SphK2进入胞质颗粒分数和化验总鞘氨醇激酶活性(图2)。WT老鼠有胞质特定活动pmol /分钟/毫克蛋白和微粒的部分活动pmol /分钟/毫克。相比之下,KO心胞质的特定活动pmol /分钟/毫克蛋白和微粒的部分活动pmol /分钟/毫克。KO心里总活动降低了大约53%相对于野生型的心(胞质分数减少53%和50%减少颗粒分数)。没有活动的分布变化之间的胞质和颗粒与ca分数。总额的85%活动存在的胞质分数KO和WT的心。SphK活动的发现在KO的心是一致的颗粒分数报告SphK线粒体的活动从SphK2 KO的心25]。

验证SphK2活动没有KO的心,我们利用先前的发现,胞质SphK1和SphK2心里活动可以通过凝胶过滤色谱法(干净地分离16]。分析WT的胞质分数和SphK2 KO心通过凝胶过滤分析如图3。正如所料,SphK2 KO的心是完全缺乏胞质SphK2活动,但SphK1活动没有显著改变。

2.3。删除SphK2损害心脏功能在缺血/复氧(IR)受伤

WT和KO的心受到全球50分钟缺血和再灌注(复氧)的40分钟。年底复苏LVDP红外图所示4。尽管有广泛复苏LVDP由于惊人的变化,基于一维方差分析仍然显著降低复苏LVDP KO老鼠心脏()比WT心()。因此,IR引起更严重的损伤的心脏血流动力学函数相比KO心里障碍观察WT老鼠的心。此外,在KO心梗塞大小显著高于在WT心(KO和在WT,)。

2.4。删除SphK2期间防止心脏保护缺血/复氧损伤和缺血预处理

如图4缺血预处理(IPC)增加心脏在WT心的表现。红外光谱、年底WT-IPC心表现出改进的LVDP (较WT对照组(恢复))。在WT心梗塞大小后少得多()仅与红外()。然而,随着KO心IPC没有提供保护。没有减少梗塞大小(IPC后相比,未经处理的)和远比IPC-treated WT心()。此外,LVDP没有明显的复苏KO心(没有IPC与+ IPC)和获得显著小于LVDP IPC-treated WT心(,)。

2.5。外生Sphingosine-1-Phosphate发挥心脏保护SphK2 KO的心

从我们实验室以前的结果13,20.,27)透露,与S1P WT老鼠心脏可以预先处理药物。图中的数据4表明药物预处理与0.4μM S1P保护SphK2零对红外老鼠心脏损伤。S1P改善LVDP恢复(与未经处理的),显著降低梗死大小(与未经处理的)。这表明预处理的信号通路在KO心中仍然完好无损。

2.6。磷酸化水平的一种蛋白激酶、Erk和p38和野生型和SphK2 KO的心

信号分子的磷酸化形式Akt (P-Akt)和Erk (P-Erk)增强生存在老鼠的心脏。因此,他们的水平来衡量西方墨点法在未经处理的刷新心中WT和KO小鼠。P-Akt容易检测到在KO的胞质部分和WT心(图5)。没有区别P-Akt水平观察WT - KO心(图5)。P-Akt出现在非常少量的颗粒分数WT和KO心(数据未显示)。P-Erk水平表现出广泛分散,平均值WT和KO的心之间似乎没有区别(数据没有显示)。不利的信号分子phospho-p38 (P-p38)存在于WT老鼠心脏在低数量在正常情况下(图5)。相比之下,在KO心中更高水平的P-p38在胞质分数(图中被发现5)。P-p38蛋白质不易检测到的微粒WT或KO心的一部分。

3所示。讨论

基于非心脏细胞的研究,它被假定SphK1 SphK2有相反的影响细胞的生存和SphK1 prosurvival而SphK2是据说antisurvival [22- - - - - -24]。我们以前所示SphK1 KO小鼠的心,一个活跃的SphK1缺血性预处理对心脏保护至关重要的(20.和缺血后处理21]。在目前的研究中,我们首次研究了SphK2的作用在心脏保护测试假设消除SphK2通过基因手段将增强红外损伤和IPC的心脏反应。这些研究对我们使用小鼠模型中删除SphK2基因外显子2 - 5 SphK2活动导致完全丧失,从而减少> 50% SphK活动在胞质和颗粒分数。显著增加补偿SphK1活动不存在。我们没有发现显著差异在基线和野生型之间心功能SphK2零老鼠心脏。然而,40分钟后全球缺血和再灌注的40分钟,恢复LVDP显著减少KO的心,和梗塞大小显著增加。这表明对红外损伤的敏感性增加KO的心。符合这个更加敏感,IPC-induced心脏保护的能力被废除的KO的心。在对比研究是孤立的细胞(22- - - - - -24),这些结果提供了第一个证据的转基因动物SphK2是一个重要的脂质激酶调节心脏细胞生存,并进一步SphK1和SphK2都需要在心脏缺血预处理。SphK2也在肾的保护作用红外损伤(28]。然而,缺血性预处理没有研究,和外生S1P受体激动未能产生肾保护(28]。

IPC导致释放从细胞S1P然后结合细胞表面G-protein-coupled受体和触发器的心血管反应(3,6,29日]。由此可见,删除SphK2可能会少S1P用于发布在短暂的IPC。我们已经表明,减少S1P反应作出了重大贡献的整体效能预处理反应(6]。进一步,我们以前的工作显示,在孤立心脏缺血/再灌注损伤,SphK活动下降明显缺血和仍然压抑在恢复期间,虽然心中已经预先处理,酶活性的恢复更健壮(30.]。并行S1P水平改变(30.,可能存在一个阈值浓度在细胞水平上低于prosurvival路径要么是不激活或抑制。因此,最简单的解释为前提SphK2 KO小鼠的失败是没有足够的细胞S1P达到阈值水平的S1P释放引发IPC(见图6)。

此外,交互SphK2和/或S1P与其他信号分子也可能导致的损失。特别是Strub等人表明,线粒体SphK2活动至关重要的正确组装细胞色素氧化酶(25]。SphK2 KO小鼠包含一个有缺陷的细胞色素氧化酶,限制呼吸。减少细胞色素氧化酶活动会导致积累电子上游,这可能会导致增加活性氧生成(31日]。注射线粒体渗透性转换孔开放(mPTP药物)被认为是再灌注损伤的关键,注射和ROS生成鼓励mPTP药物打开(32]。因此,ROS生成在复氧增加了注射SphK2 KO的心可以促进mPTP药物开放,增加后续伤害。这将提供一个联系SphK2和红外的损失伤害(见图6)。

这些发现具有重要意义对衰老的心。如图3和展示之前16,20.,26),在年轻的啮齿动物的心,超过SphK1 SphK2活动,但随着动物年龄这一比率变化衰老大鼠的心包含SphK1明显多于SphK2活动(26]。本文中的数据表明,这种转变从SphK2 SphK1不大可能影响心脏保护本身。然而,这种转变似乎导致有些S1P水平降低与衰老(26),这可能导致某些心血管不良反应的干预措施,诸如IPC已经指出在岁的心26,33,34]。

激活的一种蛋白激酶磷酸化中扮演一个重要的角色在促进心肌细胞的生存。一种蛋白激酶磷酸化是心血管在体外和在活的有机体内(35,36]。在这项研究中,我们发现一种蛋白激酶的磷酸化水平(Erk)也一样SphK2-KO老鼠心脏在基线WT。然而,不利的信号分子phospho-p38容易探测到在基线KO的心,但在WT心低。这一发现意味着慢性激活KO小鼠p38是存在的。这种观察是小说,因为它已被证明,防止p38磷酸化是心脏保护的一个重要组成部分37]。慢性激活KO p38代表消极倾向的心伤。这可能导致的不良反应SphK2 KO心IR和IPC。

总之,我们的数据首次证明缺血/再灌注后心肌损害是增强小鼠零SphK2和预处理的心血管介入SphK2基因被删除。这些观察结果与之前相反的建议来自在体外模型SphK1和SphK2驱动反对功能调节细胞命运。

4所示。材料和方法

本研究是依法进行的指导实验室动物保健和使用的(国家学术出版社,华盛顿特区,1996年),和所有程序都通过动物保健委员会的旧金山退伍军人事务医学中心。抑肽酶、亮抑酶肽抑肽素A,氯化三苯基四氮唑(TTC)从σ。D-Erythro-sphingosine 1-phosphate (S1P)获得Biomol研究实验室。D-Erythro-sphingosine - [³H)从美国获得放射性标记的化学物质。

4.1。SphK2零老鼠

SphK2 null (KO)老鼠SphK2基因外显子2 - 5被删除(38从Drs)获得。Coughlin肖恩和Rajita帕普(心血管研究所,加州大学,旧金山)。这些老鼠及其野生型的同胞被用于所有研究报告在此和都是3到4个月大的时候学习。男性零(SphK2纯合子)和野生型(WT)老鼠繁殖产生的杂合的(SphK2老鼠)。基因分型用PCR证实没有SphK2基因的外显子2 - 5总是3-4-week-old老鼠的尾巴进行活检。图1用于分析SphK2显示PCR引物,SphK2,Sphk2老鼠。识别WT KO小鼠,使用以下引物PCR采用集。WT,一组5′ATTTTCTGGAGGGCGGGATAGG3′, 5′AAGAGGAACGGGGAGTGAGACAAG3′,这加剧了572 bp的片段。纯合子null (SphK2)老鼠与底漆设置如下:5′GCCACCACTTATGAGGAGAATCG3′, 5′GACACAGAACATCCCATCCCTAAC3′。这组放大一个片段的约378个基点。

4.2。Langendorff隔离灌注心脏准备

雄性老鼠(3 - 4个月大的时候,体重25 - 28 g)是肝素化(500 U /公斤、IP)和戊巴比妥钠麻醉(60毫克/公斤,IP)。在冰冷的心被迅速切除,洗逮捕的解决方案(氯化钠120更易/ L,氯化钾30更易/ L),并通过主动脉插管20量度不锈钢冲针。心被灌注在70毫米汞柱修改Langendorff装置使用Krebs-Henseleit解决方案包含(更易/ L)氯化钠118、4.7氯化钾,CaCl₂2.5,MgSO₄1.2,KH₂阿宝₄1.2,NaHCO₃24日,葡萄糖5.5和5.0 Na丙酮酸。灌注的解决方案都洋溢着95% O₂/ 5%股份有限公司₂并保持在37°C。全球缺血期间的心被降低到一个恒温器室保持心的温度37°C。

4.3。Ischemia-Reoxygenation (IR)和缺血预处理(IPC)协议

协议红外实验由一个20分钟的平衡期,其次是40分钟的全球缺血和再灌注(复氧)的40分钟。IPC,心里平衡了16分钟,然后进行预处理的两个短周期,每个组成的2分钟全球缺血和再灌注2分钟。这是跟随全球50分钟的缺血和再灌注的40分钟。血液动力学(左心室压力(LVDP)开发,LV舒张末期压(LVEDP),和±dP/ dt)记录使用气球插入LV如前所述[20.]。LVEDP最初设定在5毫米汞柱在平衡和随后的变化来衡量。梗塞大小是衡量TTC染色如前所述[20.]。

4.4。鞘氨醇激酶活性

心被迅速从麻醉小鼠切除(戊巴比妥钠60毫克/毫升ip),安装在Langendorff仪器,并与灌注缓冲区刷新1分钟。他们然后在冰冷的均质隔离缓冲区(0.13 M氯化钾,20毫米玫瑰,pH值7.4,1毫米EGTA, 1μ0.25 g / L亮抑酶肽μg / L chymostatin和抑肽素),匀浆是离心机6分钟在350 g多美微型离心机去除细胞碎片和细胞核。上层清液离心机50分钟在100000 g。上层清液提供了和指定为胞质分数。颗粒分数与缓冲洗一次然后repelleted离心。洗了回胞质分数。胞质和膜分数都分别用于SphK活动的分析。放射性分析使用氯仿(新鲜)/甲醇/水三钠的EDTA萃取系统分离反应物([3 h]鞘氨醇)从产品([3 h] S1P)基本上如前所述[30.,39]。标准试验包含Triton x - 100(0.05%)、250毫米氯化钾,1μ300 - 400 M [3 h]鞘氨醇(cpm / pmol), 5毫米ATP, 10毫米毫克^{2 +},100毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值8.0,10毫米抗坏血酸盐,酶蛋白的体积0.5毫升。分离和鉴定保持酶的活性形式的SphK1和SphK2是如前所述[16]。

4.5。西方分析

老鼠心脏灌注是安装在Langendorff装置和在指定的条件下。然后他们被均质在0.13 M氯化钾,20毫米消息灵通的pH值7.4,1毫米EGTA, 1μ0.25 g / L亮抑酶肽μg / L抑肽酶和胃酶抑素和离心机g生成颗粒和胞质分数。颗粒分数与隔离缓冲洗一次。西方分析进行了如前所述[26)使用以下技术:抗体与细胞信号phospho-Akt (Ser 473号(9271),phospho-p38 Thr180 / Tyr182,没有。9211),p38(没有。9218),phospho-Erk1/2 (Thr202 / Tyr204。不。4376)。蛋白质浓度测定用洗涤剂兼容直流蛋白质从Bio-Rad分析工具和用于平衡蛋白质浓度在所有样本。每个车道被装满10μ克蛋白质。

4.6。统计分析

并给出了数据。血液动力学的差异意味着值的意义,梗塞大小,各组由单向方差分析评价,其次是posthoc测试(Newman-Keuls)。SphK差异活动与WT SphK2 KO组织被学生的评估t以及。被认为是具有统计学意义。

确认

这项工作是支持的资助退伍军人事务部,退伍军人健康管理局,办公室的研究和开发(DAV)和国家卫生研究院的基金1 p01 HL068738-01A1和1 ro1 HL090606 (JSK)。作者感谢Drs。Coughlin肖恩和Rajita帕普提供SphK2 null老鼠。