文摘
背景。手球被认为是间歇运动,一个重要的强调运动员的有氧代谢和无氧代谢。然而,氧化应激反应后手球比赛仍然未知。我们调查的反应后血浆和红细胞抗氧化系统和氧化应激生物标记一个手球比赛。方法。十四岁男性精英巴西手球运动员在本研究招募了。血液样本,立即和24小时后的游戏。结果。复苏的比赛结束后,在24小时内,所有的氧化应激指标的浓度变化显著的方式表明增加血液中的氧化应激(硫醇团体和减少谷胱甘肽减少,而TBARS和血浆抗氧化能力提高)以及红细胞(TBARS水平上升和蛋白质羰基)。红细胞抗氧化剂酶活性也显著改变了手球。肌肉损伤指数(肌酸激酶和乳酸脱氢酶)锻炼后显著增加。此外,赛后il - 6的分泌增加,而肿瘤坏死因子-α在经济复苏有所下降。结论。这项研究表明一个手球游戏精英运动员诱发明显的氧化应激状态,血浆和红细胞大分子氧化改性,以及酶和非酶的抗氧化系统的变化。
1。介绍
运动训练涉及到重复的运动和大量的体力训练和竞争游戏,这可能会导致性能下降,氧化应激和炎症1,2]。事实上,运动刺激已经被公认诱导活性氧和氮物种的生产(罗恩)[2,3]。尽管罗恩有重要作用作为信号分子在几个细胞通路,赞成和抗氧化状态的失衡会导致细胞氧化还原体内平衡损失和不利影响脂质氧化损伤,蛋白质和DNA (3]。此外,过量的罗恩在运动中起着不利的作用通过改变急性疲劳或肌肉收缩功能的影响[4]。
规律的运动训练与upregulation有关抗氧化系统的应对罗恩的增加生产能力。出于这个原因,助氧化剂精英运动员急性运动刺激的反应通常可以减弱(3]。大部分关于运动性氧化应激的研究是进行协议,包括典型的有氧运动(跑步和自行车)3,5)和厌氧(阻力训练和sprint)运动(6- - - - - -8]。不同类型的锻炼可能诱发不同程度的罗恩,影响等离子体氧化应激在一个特定的方式。例如,在应对muscle-damaging锻炼,等离子体氧化应激的指标可能会持续好几天,对比与返回其他值几小时后急性non-muscle-damaging锻炼协议(9,10]。Nikolaidis et al。8]表明muscle-damaging偏心协议产生大量增加等离子体氧化压力参数,直到运动后3到4天。与连续运动相比,间歇运动等体育比赛(足球、篮球、手球)包括有氧代谢和无氧代谢和已收到很少注意在文献[11,12]。间歇运动的生理负荷,如手球游戏,不同于一个连续稳态运动(13]。手球被认为是一个苛刻的运动模式,强调地方重要球员的有氧代谢。此外,手球比赛涉及大量的身体接触等厌氧操作,重复的加速度,短跑、跳跃、投掷、阻塞,推动,和快速移动的方向变化14,15]。精英手球运动员的研究只关注性能参数如最大肌肉力量,冲刺时间,跳跃高度在应对比赛14)或模拟手球比赛16]。
在竞争激烈的手球季节,每周2游戏的需求提升压力施加到运动员,从而增加了受伤的风险由于疲劳和肌肉损伤和性能下降。增加氧化应激引起的训练和游戏可能会影响运动员的运动性能1,17)在整个竞争,尤其是在最密集的游戏的时间表。最近的证据表明,增加氧化损伤的产生与一个过度训练状态(1]。考虑手球比赛的生理和心理的需求,它是合理的假设手球运动员可能暴露于氧化应激的一个条件。因此,本研究的目的是探讨抗氧化系统的响应和氧化应激生物标志物在血浆和红细胞后一个手球比赛。
2。材料和方法
2.1。参与者
十四岁男性精英巴西手球运动员加入了研究(表1)。他们了解与研究相关的实验过程和可能的不适之前给他们的书面知情同意参加。实验程序和协议符合赫尔辛基宣言的原则是人类伦理委员会批准的克鲁塞罗南大学。
2.2。实验设计
标准进行了友好的手球比赛中间的手球的季节,当运动员们习惯于玩游戏。比赛由2×30分钟半和10分钟的间隔在半场休息1分钟之间。在比赛当天,玩家游戏来到体育馆比赛开始前2小时。从每个运动员血液样本收集:运动前(基线),立即在下半年(赛后),24小时后游戏(24小时)(图1)。所有运动员都被要求投弃权票至少4天从游戏和2天从手球训练。
2.3。血液收集和分析
在每个时间点,从肘前的静脉血样收集到10毫升真空采血管管(美国正欲真空采血管)包含0.1毫米乙二胺四乙酸(EDTA)解决方案,并立即处理。血液在1200转离心10分钟4°C获得等离子体。从全血收集红细胞。血浆和红细胞整除(100μL)存储在−80°C (Revco、Ashville、数控、美国),直到分析因变量。使用后,血浆稀释1:100 0.1毫米磷酸盐缓冲剂,pH值7.4,并用于测量以下参数:氧化损伤,总抗氧化活性(收紧试验),减少谷胱甘肽(GSH),谷胱甘肽(GSSG)和减少谷胱甘肽氧化/氧化谷胱甘肽比(谷胱甘肽(GSSG)、肌酸激酶、乳酸脱氢酶和细胞因子释放。
红细胞收集从全血在等离子体被移除。整除的红细胞(100μL)存储在−80°C到氧化损害的评估和酶活动:总超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、glucose-6-phosphate脱氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶,谷胱甘肽还原酶。本研究的所有测量进行了一式三份,和敏感的方法显示在适当的部分。适当的质量控制是化验,确保样品的质量。
2.4。制备匀浆抗氧化剂酶和氧化损伤的测量
抗氧化剂酶和氧化损害赔偿进行了红细胞的整除(100μ通过添加四卷(400 L)发生溶血μL)产生hemolysate冰冷的去离子水。之后,红细胞被离心10分钟,10000×g在4°C和上层的收集。额外的稀释进行生产的最终稀释1:500使用缓冲assay-specific提取解决方案。离心后(10000×g,在4°C, 10分钟),收集得到上清液,用于进一步分析。
2.5。氧化损伤(TBARS化验、硫醇和羰基)
氧化损害是好的策略来间接评价罗恩以来生产生物分子,如脂质和蛋白质可以通过自由基容易受伤。硫代巴比土酸活性物质的测量(TBARS)测定被弗拉格(18通过后的加合物的形成硫代巴比土酸和几个lipid-derived醛之间的化学反应,包括丙二醛。535纳米的吸光度测定混合物达到室温后,由标准曲线和TBARS内容估计清廉μ米1,1,3,3-tetraethoxypropane。硫醇和羰基化合物进行评估生物标记的氨基酸氧化蛋白质分数总血浆和红细胞。红细胞和血浆稀释沉淀用20%三氯乙酸溶液在冰。减少硫醇组检测到彩色的加合物的形成与4毫米5.5′反应后硫代-国际清算银行(2-nitrobenzoic酸)解决方案(DTNB)。DTNB-treated样品的吸光度计算412海里使用谷胱甘肽作为标准(0 - 100μ米)(19]。同样的步骤被用来估计蛋白质羰基。蛋白质羰基与10毫米dinitrophenylhydrazine腙形成确定的在0.25 M盐酸。吸光度的峰值检测到340 - 380 nm范围内的测量,和羰基浓度计算基于摩尔系数ε= 2.2×104米−1厘米−1(20.使用牛血清白蛋白(BSA)作为标准(0 - 1000μg / mL)。
2.6。红细胞酶活性
总超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、glucose-6-phosphate脱氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶,谷胱甘肽还原酶活动测定红细胞使用分光光度计(英国Amersham生物科学)。过氧化氢酶活性测定如Aebi所述21)基于的直接分解过氧化氢(H2O2)。总超氧化物歧化酶活性测定使用尤因和Janero[描述的方法22其中包括减少激进分子氮蓝四唑以下线性一阶动力学在3分钟。谷胱甘肽过氧化物酶(23),谷胱甘肽还原酶(24基于氧化)活动测量βnadph的存在叔丁基氢过氧化物作为衬底。glucose-6-phosphate脱氢酶的活性测定如我们之前所述研究[25]。
2.7。总抗氧化活性(收紧试验)
ferric-reducing能力测定等离子体(收紧试验)是基于等离子体之间的单电子转移反应抗氧化剂和铁3利用氧化剂。股票的解决方案包括0.1醋酸缓冲,pH值3.6,10毫米TPTZ (2、4、6-tripyridyl-s-treazine)解决方案在40毫米HCl, FeCl和20毫米3h·62O的解决方案。试剂(200捆牢的解决方案μL)准备的新鲜和40μ蒸馏水和10 LμL(血浆样本。铁的吸光度的变化2复杂,由于等离子体的一种抗氧化剂的作用,是由分光光度计测量593海里(Tecan、萨尔茨堡、奥地利)。标准曲线线性0到100之间μM FeSO4。
2.8。谷胱甘肽和GSSG确定
全血是用于测定谷胱甘肽状态,使用拉赫曼(描述的方法26]。总谷胱甘肽和GSSG分析使用5、5′-diothiobis-2对硝基苯甲酸与减少谷胱甘肽结合形成5-thio-2-nitrobenzoic酸。谷胱甘肽(GSSG浓度计算从标准曲线用纯GSH / GSSG标准(0-50海里),表示为纳米的谷胱甘肽和GSSG。
2.9。肌肉损伤标记物
等离子体肌酸激酶和乳酸脱氢酶水平进行了分析使用检测设备Bioliquid肌酸kinase-NAC和乳酸脱氢酶从Laborclin(巴拉那河、巴西)。乳酸脱氢酶的方法是基于减少NADH的丙酮酸,导致乳酸和NAD +。催化的浓度是由NADH的分解速度,测量吸光度下降在340海里。肌酸激酶是化验使用一种基于NADPH的速度形成酶方法,吸收340海里。所有样本与已知的标准在分光光度计(Amersham-Biosciences Ultrospec 3100 - pro)。
2.10。细胞因子释放
细胞因子il - 6和tnf化验在等离子体与ELISA包根据制造商的指示(Quantikine、研发系统,明尼阿波利斯,明尼苏达州,美国)。的下限检测的ELISA分析如下:1.56 pg / ml的il - 6和TNF 1.5 pg / ml。
2.11。蛋白质的测定
等离子体的总蛋白质含量测定方法的布拉德福德(27),用BSA作为标准。
2.12。统计分析
数据意味着±标准错误的意思。统计推断是由重复的单向方差分析措施,和图基的事后测试使用(INStat;图垫软件,圣地亚哥,加利福尼亚州,美国)。P值低于0.05被认为是具有统计学意义。此外,百分比变化和尺度效应(ES)预处理和赛后意味着计算之间的区别。ES计算是两个样本之间的差异意味着,除以平均两个样本的标准偏差。确定规模的大小根据[ES精英运动员的解释28)如下:0.25 =琐碎的,0.25 - -0.5 =小,1.0 0.5 -1.0 =温和,> =。
3所示。结果
3.1。氧化损伤在血浆和红细胞
最初在目前的研究中,我们评估了单手球比赛对氧化应激的影响在训练有素的运动员通过测量水平的血浆和红细胞脂质过氧化作用和蛋白质氧化,如表所示2。在等离子体,有增加TBARS水平(62% ES = 0.99)并行硫醇组显著减少(59% ES = 2.22),立即赛后。血浆TBARS水平仍在复苏和达到最高水平升高(107% ES = 1.49), 24小时的巯基共同回到基线水平时24小时。没有改变等离子体金属羰基合物组运动后和恢复观察。红细胞TBARS水平显著增加24小时响应手球比赛(153% ES = 2.63)相比基线,而红细胞硫醇组观察无显著差异。另一方面,红细胞羰基赛后立即组显著增加(40% ES = 2.29)和24小时后的复苏(47% ES = 3.19)。我们的研究结果表明显著增加氧化生物标记在血浆和红细胞的手球运动员赛后。
3.2。收紧,谷胱甘肽(GSSG比率
抗氧化活性的等离子体被收紧的分析评估。赛后立即收紧水平显著增加(74% ES = 1.58),回到基线水平(图24小时2(一个))。这些结果指出在锻炼明显动员的抗氧化剂防御。血浆谷胱甘肽,谷胱甘肽(GSSG配给被认为是氧化应激的一个重要标志。谷胱甘肽浓度显著降低赛后(18% ES = 0.71)和返回向复苏(图的基线2 (b))。没有观察到变化GSSG浓度和谷胱甘肽(GSSG赛后比例。
(一)
(b)
3.3。肌酸激酶和乳酸脱氢酶
肌酸激酶和乳酸脱氢酶作为一种间接肌肉损伤的标志。有趣的是,等离子体的肌酸激酶水平(图3(一个))在24小时内与基线水平相比显著增加(72% ES = 1.52)。血浆乳酸脱氢酶水平显著增加(28% ES = 1.36)立即赛后恢复后,回到基线水平(图3 (b))。这些结果是意料之外的,因为从事本研究的受试者训练有素的运动员和熟悉竞争游戏。
(一)
(b)
3.4。细胞因子释放
与之前的研究一致,血浆il - 6水平明显增加只有立即赛后(66% ES = 2.09)和归一化(图24小时4(一))。另一方面,我们研究的另一个意想不到的结果是显著降低TNF -α(56% ES = 0.67)后24小时内恢复(图4 (b))。
(一)
(b)
3.5。红细胞酶活性
最大抗氧化酶活动被用作生物标记物的氧化应激和监控的适应响应运动(表3)。手球比赛诱导总红细胞超氧化物歧化酶活性显著增加在赛后(166% ES = 3.53)和24小时恢复(248% ES = 3.66),支持这个想法,慢性运动训练可以提高这种酶的反应。红细胞过氧化氢酶显著减少后立即游戏(−36% ES = 0.66)和24小时的复苏(ES−57% = 1.30)相比基线。同样,红细胞谷胱甘肽还原酶显著减少比赛结束后(−46% ES = 0.93)和24小时的复苏与基线相比值(ES−53% = 1.12)。谷胱甘肽过氧化物酶和glucose-6-phosphate脱氢酶活性没有改变立即在24 h后手球比赛。关于我们的实验设计,我们观察到显著增加抗氧化酶活动后手球比赛对抗过度罗恩在锻炼和恢复生产。
4所示。讨论
目前的调查显示一个友好的手球比赛由巴西精英手球运动员改变明显氧化应激生物标记物的反应,抗氧化能力,和肌肉损伤的指标在等离子体和/或红细胞,立即和24小时后的游戏。手球比赛期间,大约90%的释放的能量必须耗氧驱动和运动员跑4 - 6公里在80 - 90%的平均强度最大心率(29日]。同时,签证官的水平94%2马克斯取得了在一个特定的手球运动(13]。在这种情况下,估计有1 - 5%的总耗氧量的结果形成的超氧化物阴离子(30.),尽管最近的一个研究报告更低的值(31日]。鉴于手球的高强度,也就不足为奇了氧化应激的生物标志显著增加后的游戏。在运动中进一步机制有助于罗恩一代除了从线粒体电子漏电子链,如黄嘌呤氧化酶生产、儿茶酚胺和氧合血红蛋白自动氧化,和吞噬呼吸爆发活动(4,5]。质子由于积累乳酸酸中毒,这已经证明在体外有效prooxidant因素(32),也可以导致罗恩形成在手球比赛。此外,血液与所有器官和组织,因此,罗恩的许多可能的来源(33]。
罗恩增加生产期间运动能迅速反应等离子体和细胞膜脂质,蛋白质,和其它细胞成分(3,5]。抗氧化能力之间的不平衡和氧化剂生产手球支持增加引起的氧化损伤在血浆和红细胞。手球比赛诱导显著降低血浆硫醇组,就是明证增加蛋白质的二硫桥形成。大多数硫醇的一个重要特性是,它们可以作为降低代理。罗恩也有强烈的倾向去获得电子其他物种,因此,对于一个oxidant-thiol互动;氧化剂是中和一个相对较小的有毒副产品。
红细胞易受氧化损伤在休息和运动时由于氧气的含量高,血红素铁,多不饱和脂肪酸。虽然等离子体蛋白质羰基赛后并没有改变,我们发现了一个显著增加红细胞蛋白质羰基游戏在24小时后恢复。我们的发现符合Senturk et al。34]报告显著增加蛋白质羰基在详尽的自行车运动训练科目。同样,增加红细胞和血浆TBARS水平揭示高磁化率的不饱和脂肪酸氧化改性在罗恩增产(33]。最近的研究发表了类似的结果对血液氧化应激生物标志物在应对一场足球比赛11,12和室内攀岩35]。脂质过氧化导致膜的完整性和破坏细胞的变化过程和减少细胞的能力来维持离子梯度(4]。关于运动性能、脂质过氧化与组织炎症有关,肌肉疲劳,恢复受损后高强度锻炼(36]。几项研究已经报道的增加TBARS轻快最大和高频的non-muscle-damaging运动后在人类3),通常在一小时内回到基线值运动后(37]。然而,根据先前的研究,我们观察到一个大(ES = 1.49) 24小时运动后血浆和红细胞(ES = 2.63) TBARS水平(1,38]。这个响应TBARS可以持续至1到4天后muscle-damaging锻炼(39]。在这方面,我们观察到明显的乳酸脱氢酶(ES = 1.36)和肌酸激酶(ES = 1.52)水平提供一个间接证据的肌肉损伤后一个手球比赛。从肌肉乳酸脱氢酶和肌酸激酶流出可能归因于质膜渗透性的增加和/或肌内血管(40]。峰的肌酸激酶水平发生后24小时后,游戏同样报道足球比赛(11]。肌肉损伤的增加膜在运动后可能会导致血液中不饱和脂肪酸的浓度增加,这可能是一个机制,通过它muscle-damaging运动后血浆脂质过氧化增加天运动(39]。
虽然不是测量在这项研究中,另一种机制参与运动性罗恩生产相关的肌肉损害吞噬细胞的激活和渗透到受伤的肌肉在运动后恢复(35,41]。激活中性粒细胞是氧化剂的主要来源,因为他们使用各种各样的罗恩,包括超氧化物阴离子、过氧化氢、和次氯酸摧毁受损组织导致运动后炎症、创伤组织,和肌肉修复(39]。
罗恩生产可能参与调节redox-sensitive转录因子调节炎症介质的表达如细胞因子、趋化因子、粘附分子(42]。细胞因子参与控制的免疫和急性期反应,炎症反应和组织修复过程(12,43]。il - 6浓度增加(ES = 2.09)只在赛后立即。虽然il - 6产生早期炎症,它不能被视为一个典型的促炎细胞因子。il - 6结束值峰值出现在一场激烈的运动,或在几个小时内,然后迅速降低到基线水平(44]。plasma-IL-6的反应的大小与运动持续时间、强度和肌肉中招募活动(43]。肌肉损伤不需要为了增加血浆il - 6在运动(45]。骨骼肌在运动中可以产生il - 6在缺乏可观察到的标记的炎症和肿瘤坏死因子-α独立,il - 6与新陈代谢而不是炎症(45]。以前的研究人员表明,il - 6 mRNA和il - 6基因的转录率调节骨骼肌收缩纤维,然后工作肌肉释放到循环(44]。为了锻炼,il - 6的行为在一个自分泌和旁分泌的方式维持葡萄糖体内平衡,引起脂类分解和脂肪氧化,产生抗炎效应的抑制肿瘤坏死因子-α也生产,刺激肌肉修复的卫星细胞的增殖和分化成肌细胞(46]。
谷胱甘肽(GSSG比例研究了有氧运动和无氧运动后氧化应激的敏感标记,发现减少运动后(9]。与硫醇团体一起,谷胱甘肽发挥多功能作用在运动中保护生物免受氧化损伤。谷胱甘肽浓度的降低游戏后立即按照增加等离子TBARS硫醇组和红细胞蛋白质羰基在同一采样时间和,因此,表明罗恩增产。与我们的研究结果相似,安德森和同事(47]报道显著减少谷胱甘肽在训练有素的足球比赛后女足球运动员。谷胱甘肽浓度的减少可能是由于其消费再生抗坏血酸和α-生育酚或直接清除罗恩。在目前的研究中,我们发现,收紧强劲增长之后(ES = 1.58)已经出版的手球比赛之前的研究(11,12]。增加显示急性身体的代偿反应的抗氧化防御罗恩生产。抗氧化能力提升运动后似乎是部分支持增加尿酸(11)和等离子过氧化氢酶活性(48]。尽管如此,立即动员过程中观察到的收紧和运动后是不足以避免血液生物分子的氧化改性。从这个意义上讲,现在有令人信服的证据表明,红细胞有助于维护循环抗氧化剂水平(33]。冲突的结果对红细胞抗氧化酶活动已报告在应对急性运动。观察到红细胞抗氧化酶的变化手球比赛,24小时后的恢复有很大的不同从这些报道后山地自行车赛(49)或最大的轻快和高频运动后测试(50]。我们的研究结果表明总超氧化物歧化酶活性的显著增加比赛结束后和在复苏,而没有显示更改后计竞争(51)或长时间运动试验(50]。因为红细胞不能合成蛋白质,酶活性的增加可以归因于共价修饰的蛋白质或其他蛋白质相互作用(51]。此外,长期影响氧化应激的手球运动员反映感应的适应,尤其是在休息和超氧化物歧化酶活性的增加急性剧烈运动刺激反应(52]。先前的研究已经报道增加(49],减少[51),甚至没有变化(53在运动后红细胞过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶活动。我们表明,过氧化氢酶活性下降后手球比赛和复苏,而谷胱甘肽过氧化物酶活动的观察无显著差异。这些变化与抗氧化剂防御协议被手球比赛。先前的研究也报道了谷胱甘肽还原酶活性可能增加(49)或不会改变50力竭运动后)。在目前的研究中,手球游戏谷胱甘肽还原酶活力显著降低在经济复苏时期。Tauler et al。54)指出,谷胱甘肽还原酶活性抑制可能通过过氧化氢浓度的增加。沿着这条线,过氧化氢酶也被高浓度的过氧化氢(21),暗示损耗的酶促抗氧化池。
慢性运动训练已经training-induced适应性反应与氧化应激(5]。因为这科目使用在目前的调查是精英运动员,熟悉竞争游戏,这可能推测氧化应激后手球游戏可能不会阻止。在这方面,罗恩的抗氧化防御系统似乎控制水平,而不是完全消除它们(4]。这似乎是合乎逻辑的,因为罗恩扮演着很多的角色在细胞信号,肌肉收缩,储存糖元,酶活性5]。
许多研究表明膳食抗氧化剂管理运动发作之前和之后,试图减弱任何潜在的氧化应激增加,虽然结果似乎是影响不仅是水平的锻炼,而且金额,时间,和补充抗氧化的类型(4,55]。先前的研究证明了这一点,政府的抗氧化剂补充的手球比赛前不会提高性能,而是提供防止自由基产生的负面影响在比赛中运动员在竞争(55,56]。
总之,这项研究表明一个手球游戏精英运动员诱导的氧化应激状态体现在血浆和红细胞氧化改性大分子和酶和非酶的抗氧化系统的变化。增加氧化应激引起的训练和游戏可能会影响运动员的运动性能如强度和权力竞争的季节,尤其是在最密集的游戏的时间表。提出进一步的研究来评估氧化应激和炎症标记物在整个运动季节(俱乐部的训练和比赛)的男性和女性运动员。此外,补充抗氧化剂对复苏过程的影响一个手球比赛后仍有待确定。
利益冲突
本文的所有作者披露没有任何实际的潜在的利益冲突包括金融、个人或其他与个人或组织的关系。
确认
作者要感谢手球运动员的参与和承诺的研究。他们的技术援助负债Fineto Jr . C。,Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) for the financial support, and the Handball Department of Universidade Metodista de São Paulo.