活性氧的作用的神经和激素调节PNMT基因在PC12细胞中

文摘

产生应激激素,肾上腺素,主要由肾上腺嗜铬细胞及其生物合成受酶phenylethanolamine N-methyltransferase (PNMT)。研究已经证明,PNMT可能监管通过肾上腺轴激素和神经通过内脏神经的刺激。此外,缺氧被证明PNMT监管中发挥关键作用。本研究的目的是检查的影响产生的活性氧簇(ROS)缺氧CoCl模拟代理₂的荷尔蒙和神经刺激PNMT在体外细胞培养模型,利用大鼠嗜铬细胞瘤(PC12)细胞线。rt - pcr分析显示各自的PNMT intron-retaining CoCl intronless信使rna剪接变体₂(分别为3.0和1.76倍)。瞬时转染细胞化验与CoCl同时治疗₂合成糖皮质激素地塞米松,展示推广活动增加(18.5倍),而mRNA水平两个拼接的变异并不证明协同效应。类似的结果观察当调查CoCl的影响₂全身的活性氧对神经的刺激通过forskolin PNMT。我们的研究结果表明CoCl₂全身的ROS产生协同的影响荷尔蒙和神经PNMT启动子的激活。

1。介绍

肾上腺素是由儿茶酚胺合成的生物合成的酶phenylethanolamine N-methyltransferase (PNMT EC 2.1.1.28) [1]。PNMT肾上腺素生产的一个关键因素在肾上腺嗜铬细胞在急性和慢性压力。压力会导致许多疾病的病理生理学和肾上腺素和糖皮质激素(皮质醇和肾上腺酮)发起的主要应激激素的生物反应允许有机体应对不利的生理、心理和环境压力(2]。所有的儿茶酚胺生物合成的酶包括PNMT压力响应;然而,他们的反应是stressor-specific,依赖于应力强度,持续时间和数量的重复曝光(3,4]。

PNMT基因已被证明是激素和神经调节通过激活-肾上腺轴(HPA)和sympathoadrenal (SA)系统(5]。激活机制发挥转录和转录后影响PNMT基因(6- - - - - -8]。荷尔蒙PNMT基因的激活依赖于极高浓度的糖皮质激素诱导转录变化通过糖皮质激素反应元素(格蕾丝)上游PNMT转录起始位点(9]。通过sympatho-adrenal PNMT系统的激活可以通过乙酰胆碱的释放和PACAP发生内脏神经(5]。等神经递质乙酰胆碱、血清素和肽神经递质PACAP已被证明诱导PNMT通过蛋白激酶A (PKA)和蛋白激酶C (PKC)途径10,11]。此外,乙酰胆碱和PACAP激活信号级联调节转录因子表达只在肾上腺素的细胞如早期生长反应转录因子1 (Egr-1)和促进PNMT转录[12]。

之前的研究表明,缺氧是一种强大的压力参与PNMT[的规定13]。细胞经历降低啊₂水平(缺氧)进行各种生物反应以适应这些不利条件(14]。缺氧,或降低氧气浓度,激活各种复杂的通路在细胞和生物体与氧恢复体内平衡的最终目的。虽然生理对缺氧的反应已经欣赏了很长一段时间,细胞内的分子过程激活仍在调查之中。然而,这个区域已经大大发现先进的一类转录因子响应缺氧,低氧诱导因子(缺氧诱导因子)(15]。低氧诱导因子刺激不同的基因,包括PNMT [16- - - - - -19]。

低氧条件下也可以产生活性氧(ROS)的产生以及活性氮物种(RNS)的方法。ROS的产生/ RNS称为氧化应激,条件的平衡生产和处理ROS / RNS改变(20.]。一些研究报告,让细胞或组织缺氧氧化应激增加,这种增加是由线粒体(21]。ROS和RNS源自缺氧条件会导致固定信号转导和基因表达的变化,导致疾病发展和进展(22]。ROS / RNS函数作为特定的信号分子的激活触发特定的转导通路和细胞损伤组件。ROS / RNS调解这些影响通过特定转录因子的激活控制一系列目标基因的转录。几项研究证明CoCl的交付₂培养细胞可以模拟低氧反应,包括增加活性氧的生产(22,23]。另外,暴露的PC12细胞hypoxia-mimicking CoCl浓度₂已被证明的转录上调HIF1吗α并导致线粒体DNA损伤(24]。

本研究的目的是了解氧化应激的作用引起的缺氧环境,及其影响PNMT的激素和神经的刺激。氧化应激的影响PNMT从而以前没有被证明的肾上腺素和将允许更好的理解影响转录机械上的氧化应激参与PNMT基因的调控。反过来,这将使我们能够更好地了解肾上腺素生产控制通过PNMT及其各种疾病状态下的神经内分泌调节作用。目前的研究表明,模拟低氧胁迫下通过CoCl生成₂,引起PC12细胞ROS的产生,促进PNMT基因转录。此外,氧化应激引起的缺氧CoCl模拟代理₂进一步促进PNMT基因的转录结合激素以及神经刺激。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

PC12细胞(d·奥康纳,加州大学圣地亚哥分校,圣地亚哥,美国)在DMEM培养补充5%马血清,5%牛血清和硫酸庆大霉素(50μg / mL)。所有细胞都保持在37°C湿润孵化器有限公司5%的氛围₂空气和-95%增长到80 - 90% confluency之前通过或用于一个实验。缺氧是通过位移的氧气与氮气从21%降至5%。在实验之前,细胞被转移到包含charcoal-treated血清DMEM。细胞转染研究镀在24-well组织培养板的密度4 - 5×10⁵细胞/。对总RNA提取,细胞生长在100毫米文化菜5×10的密度⁵-1.8×10⁶细胞每道菜。播种后,细胞被允许板材坚持~ 24 h之前开始实验。细胞然后用CoCl药物治疗₂(200μ米)、地塞米松(1μ米),N-acetyl-L-cysteine(5毫米)(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),forskolin (10μ米)(美国马LC实验室、沃本)或与CoCl每个受体激动剂的组合₂图中指定的时间和浓度传说。

2.2。通过流式细胞仪测量细胞内ROS

细胞内活性氧的生产使用CM-H量化₂DCFDA方法(表达载体,C6827)。治疗后,培养基是15毫升锥形管收集。细胞被刮1毫升冷磷酸盐(PBS, pH值7.4)和添加到锥形管,离心机在1000 rpm(5分钟,4°C)和洗冷PBS (pH值7.4)。2.5细胞颗粒resuspended 1毫升μM检测试剂,转移到1.5毫升离心管和孵化37°C 30分钟。细胞被颗粒状,resuspended 1毫升培养基,在37°C和孵化30分钟。孵化后,细胞被离心机在2400 rpm(8分钟,4°C)和用PBS (pH值7.4)。细胞被resuspended 1毫升PBS (pH值7.4)和分析使用流式细胞分析仪(第二章BD生物科学,流式细胞仪)。总之,与488/10 nm细胞兴奋,其荧光发射被记录在530/30 nm范围内。胞内细胞群内ROS的数量成正比的荧光发射。荧光发射值从10000年独立事件被用来计算每个治疗组平均荧光值。治疗组相比,控制细胞染色确定细胞内ROS的相对褶皱变化。

2.3。测量一氧化氮

细胞外的一氧化氮水平量化使用一氧化氮分析仪(型号280,西弗斯仪器,博尔德科罗拉多)(25]。治疗后,培养基中收集1.5毫升离心管。总之,10μ从每个治疗L的媒体被注入高灵敏度探测器。这个设备使用亚硝酸盐的化学发光法来确定媒体内容()和硝酸(),不稳定的氧化产品。的nitroso-compounds和减少到没有被暴露在钒氯化然后决定之间的气相化学发光反应没有和臭氧。从电子发射兴奋二氧化氮是附近的红色和红色检测到红外区光谱和热电的冷却,red-sensitive光电倍增管。校准曲线使用硝酸钠标准被用来计算样品浓度。

2.4。rt - pcr

PC12细胞(1.6×10⁶细胞/毫升)被播种到60毫米文化菜修改DMEM和治疗如前所述。细胞被收获,500年细胞溶解μL Tri-Reagent(西格玛奥德里奇加拿大有限公司)和总RNA分离/制造商的协议。总RNA小球在diethylpyrocarbonate-treated resuspended nuclease-free水和浓度使用分光光度测量吸光度在260 nm (NanoDrop;Nanodrop技术,威明顿、德)。

2μ克总RNA DNase对待我(西格玛奥德里奇有限公司)制造商的协议,随后和cDNA合成用100 U恢复援助Moloney小鼠白血病病毒逆转录酶酶按制造商的协议(Fermentas,伯灵顿,加拿大)。PCR是在25日执行μL反应卷包含78 ng cDNA、使用50 U GoTaq福莱希DNA聚合酶(Promega)含有200μM的核苷酸,1.5毫米MgCl₂,25 ng的正向和反向引物序列的特定基因:PNMT和3 -磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)(表1)。

PCR产品(10μL)在1.5%的琼脂糖凝胶电泳40毫米Tris-acetate EDTA缓冲区(pH值8)和2毫米,与溴化乙锭染色,记录使用Chemidoc XRS (Biorad)成像系统和执行光密度分析使用一个软件的数量(Biorad)。

2.5。质粒

的野生型PNMT promoter-luciferase报告基因构造pGL3RP893生成如前所述[7,26,27]。主管与质粒转化大肠杆菌细胞生成PNMT promoter-luciferase报告基因构造,随后和DNA质粒纯化使用表达载体PureLink HiPure质粒DNA净化设备(表达载体表达载体生命技术公司伯灵顿,加拿大)。

2.6。瞬时转染化验

使用表面进行瞬时转染(PEI)方法如前所述7,28]。PC12细胞生长在24-well组织培养板和1.0转染μ使用5 g的野生型promoter-luciferase报告基因构造μL 1 x表面进行转染1μ克的质粒的潜伏期3 h。转染后细胞用磷酸盐缓冲盐水洗净(PBS, pH值7.4)和维护在培养基24 h,其次是药物治疗。

2.7。荧光素酶检测

细胞培养基,细胞与PBS冲洗两次,然后与100细胞溶解μL裂解缓冲(1.25毫米三磷酸酯,pH值7.8,2毫米德勤,2毫米1,2-diaminocyclohexane-N, N,,-tetraacetic酸10%甘油和1% Triton x - 100)和征服一个冻融循环。细胞溶解产物在3000 g离心10分钟,和20μL的上层清液检测荧光素酶活性黄大如前所述,使用一个微型板块光度计(Fluostar最适条件BMG Labtech Nepean,,加拿大)(7]。总蛋白的溶解产物是由布拉德福德(1976)的方法,和荧光素酶活性表达为光密度每单位μg蛋白(29日]。

2.8。数据分析

所有数据提出了均值±SEM。实验至少重复三次实验和对照组之间和统计意义是由单向方差分析后跟posthoc比较使用Student-Newman-Keuls多重对比测试。结果被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。CoCl效果₂和缺氧细胞内ROS水平

200年PC12细胞治疗μM CoCl₂或暴露于5%氧气24 h增加细胞内ROS水平2.3倍()和1.7倍(控制(图),分别比较1(一))。相反地,接受CoCl PC12细胞₂或暴露于5%的氧气24小时明显下降3μ米()和6μ米()在细胞内没有水平,分别与控制(图1 (b))。

3.2。NAC对CoCl的影响₂诱导基因表达和细胞内ROS水平

CoCl₂治疗显著增加PNMT intron-retaining和intronless mRNA水平的3.0倍()和1.76 ()分别,而未经处理的控制。评估是否信使rna诱导PNMT CoCl₂抗氧化治疗可以废除,细胞使用5毫米NAC CoCl前30分钟吗₂交付(图2(一个),2 (b),2 (c))。细胞使用NAC CoCl之前₂交付显示减少PNMT intron-retaining和intronless mRNA水平的2.0倍()和0.9倍(CoCl相比),分别₂控件(数据2 (b)和2 (c))。

确认清除ROS的NAC CoCl期间₂压力,24小时后细胞内ROS水平测定。NAC治疗显著降低基底细胞内ROS水平的0.5倍()和CoCl水平显著降低₂生成活性氧的1.8倍(控制(图)相比2 (d))。细胞治疗5毫米NAC基底没有水平减少了15μ米(),而细胞CoCl对待₂独自显著降低没有3.4的水平μ米比控制。细胞使用NAC CoCl之前₂治疗相比,没有水平没有显著变化与CoCl细胞治疗₂单(图2 (e))。

3.3。ROS作用的激素调节PNMT基因

以决定是否CoCl所产生的细胞内ROS₂可以加强的糖皮质激素激活PNMT基因瞬时转染化验和rt - pcr进行细胞治疗200μ米的CoCl₂,1μM的地塞米松和24小时这两种药物的组合。瞬时转染化验与PNMT promoter-luciferase报告基因构造窝藏近端−893个基点(pGL3RP893),显示PNMT启动子的激活后地塞米松治疗(2.9倍;),CoCl₂治疗(3.7倍,),联合治疗(18.5倍;)(图3(一个))。rt - pcr证实的增加表达intron-retaining拼接的变体PNMT当CoCl对待₂(3.0倍;)和减少表达式结合地塞米松治疗(0.8倍;)(图3 (c))。此外,rt - pcr显示增加的表达intronless PNMT当接受CoCl拼接变体₂(2.7倍;)相比,控制和减少表达当结合地塞米松治疗(2.7倍;),而单独使用地塞米松治疗(3.5倍;)(图3 (d))。

3.4。活性氧对神经的影响PNMT基因的调控

通过CoCl确定细胞内ROS生成₂治疗的胆碱能激活可以加强PNMT基因瞬时转染化验和rt - pcr进行细胞治疗200μ米的CoCl₂,10μM forskolin和这两种药物的组合24 h。瞬时转染化验与PNMT promoter-luciferase报告基因构造窝藏近端−893个基点(pGL3RP893),显示PNMT启动子的激活后forskolin治疗(2.4倍;),CoCl₂治疗(3.7倍,),联合治疗(12.1倍;)(图4(一))。治疗forskolin和CoCl组合₂显示减少intron-retaining PNMT mRNA水平(1.0倍,CoCl相比)₂单独处理(数据4 (b)和4 (c))。rt - pcr的PNMT intronless拼接变体证明增加表达当forskolin处理(2.0倍,),而控制数据4 (b)和4 (d)),然而,没有进一步增加时结合CoCl治疗₂。

4所示。讨论

肾上腺素肾上腺髓质中,肾上腺素能神经元,心脏、脾脏和肝脏。它参与各种管理系统,如精神运动活动,睡眠、记忆和应激反应(30.]。在肾上腺素细胞,去甲肾上腺素是由酶phenylethanolamine N-methylated N-methyltransferase (PNMT)使用S-adenosyl蛋氨酸co-substrate和甲基供体形成肾上腺素(12]。了解肾上腺素通过合成生产酶PNMT阐明它作为神经内分泌调节的角色至关重要疾病(2]。PNMT基因的激活和调节机制各系统已经被广泛的研究。最近的研究表明,PNMT与stressor-specific逆境应答酶反应(31日,32]。缺氧的压力是压力可以刺激PNMT基因(17]。Tai et al ., 2009年曾表明,缺氧和CoCl₂刺激缺氧诱导因子(HIF) 1α在PC12细胞激活PNMT启动子和PNMT [13]。在adrenomedullary嗜铬细胞,trans-synaptic PNMT监管是通过神经递质释放的调节内脏神经,导致PNMT基因的激活9]。此外,生物合成的肾上腺素肾上腺髓质依赖于高浓度的糖皮质激素(33]。糖皮质激素通过间接控制你PNMT防止PNMT酶的降解,通过调节PNMT mRNA的表达2]。本研究的目标是研究和阐明角色的活性氧(ROS), CoCl缺氧模拟生成的代理₂的荷尔蒙和神经调节PNMT基因。

ROS产生至关重要的细胞功能,包括信号转导、基因转录、鸟苷酸环化酶活性的调节细胞(34]。细胞内ROS水平已被证明在压力增加,其中包括缺氧(35]。ROS的一氧化氮(NO)被认为是一个重要的细胞内信使在中枢和周围神经系统。之前的研究表明,没有导致长期upregulation PNMT和其他儿茶酚胺的生物合成的酶,而这是由循环GMP-dependent信号通路(36]。因此,我们检查了细胞内ROS水平和细胞外水平没有在PC12细胞暴露于低氧或CoCl对待₂。我们的研究结果证实缺氧和CoCl₂增加细胞内ROS水平和显示两个治疗导致细胞外没有下降。这表明CoCl₂作为缺氧模拟剂通过增加活性氧除了HIF1的稳定α和暗示,没有是没有参与的感应PNMT CoCl₂。

治疗的细胞在高浓度的活性氧与已知的抗氧化剂,包括N乙酰半胱氨酸(NAC)和多酚类物质,证明它有能力防止ROS-induced反应(22]。我们的发现证实upregulation intronless和intron-retaining通过活性氧(PNMT基因的转录31日]。此外,减少细胞内ROS水平和随后的抑制PNMT转录时观察到的细胞与CoCl联合治疗₂和南汽。因为先前的研究已经表明,CoCl₂模拟缺氧导致稳定的低氧诱导因子的蛋白质,我们的研究结果进一步证实了NAC可以有效地废除HIF1α稳定的CoCl₂,随后的转录抑制PNMT [37,38]。为了进一步阐明CoCl的角色₂生成的活性氧PNMT激活转录,我们检查了CoCl的联合效应₂地塞米松治疗或forskolin,荷尔蒙和神经PNMT启动子的活化剂。类似于之前的研究,我们已经表明,地塞米松和forskolin增加PNMT的intronless拼接变体基因的表达(6,9]。

糖皮质激素类固醇激素释放肾上腺皮质和效应器原则在应激反应(39]。糖皮质激素敏感性已经报道了在老鼠和牛PNMT子活动,和至少一个假定的糖皮质激素响应元件(GRE)已被确定为每一种特异的PNMT基因(40]。当前的研究表明,PC12细胞转染CoCl全身的启动子和处理₂和地塞米松的结果在一个协同效应,进一步推动PNMT基因的转录大于仅用药物治疗。这种反应可能归因于之前报道CoCl氧化还原机制₂糖皮质激素受体(GR)增加稳定细胞内的蛋白质(41]。此外,个人研究已经确定了一个活跃的−282个基点缺氧反应元素(一定是)和533−−−759 773个基点的格蕾丝PNMT启动子(6,13]。我们假设,这是这些元素的组合刺激导致观察到的协同PNMT启动子的激活。此外,转录因子的蛋白质含量增加,早期生长反应因子1 (Egr-1)和特异性蛋白质1 HIF1 (Sp1)α,可能会进一步推动PNMT启动子,细胞质PNMT蛋白质含量的增加(13,19]。虽然,协同效应在转录水平不是观测到的,从intron-retaining变种PNMT intronless变体的存在,表明通过CoCl进一步转录后调节₂和地塞米松。

先前的研究已经表明,forskolin治疗可能导致神经激活鼠PNMT发起人通过蛋白激酶A (PKA)和蛋白激酶C (PKC)的途径,随后导致Egr-1核蛋白质含量的增加和Sp1和增加细胞质PNMT蛋白(7,42,43]。我们的研究结果显示,PC12细胞转染CoCl全身的启动子和处理₂和forskolin产生协同效应,进一步推动PNMT基因的转录大于单独治疗药物。我们属性应对多种因素的组合,主要由CoCl稳定GR蛋白质₂,增加激活HIF1一定是α,增加Egr-1 Sp1 PNMT启动子的激活。虽然我们只能假设的确切机制目前负责协同PNMT启动子的激活,未来超表达和可拆卸的实验关键管理因素将允许更好地理解PNMT监管。类似与地塞米松联合治疗,我们展示的intron-retaining变体的PNMT intronless CoCl处理时变体₂和forskolin。这些发现表明PNMT的转录后调控这两个药物。

总之,先前的研究已经阐明和确定因素参与PNMT启动子的激活通过激素和神经通路。此外,PNMT的激活和合成蛋白质已被证明通过upregulation HIF1α由缺氧CoCl模拟代理₂。第一次,我们的研究结果表明,缺氧具有协同效应的激活PNMT启动子结合激活时地塞米松或forskolin。此外,这项研究表明,不可能没有参与ROS-mediated PNMT基因的转录,抗氧化治疗结合CoCl₂可以废除ROS-mediated upregulation PNMT的基因。

确认

这项研究是由安大略省北部医学院和加拿大自然科学和工程研究委员会。技术援助在细胞内ROS的测量是由马修Piche提供。

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