白藜芦醇抗氧化的调节作用状态，来抑制细胞因子的表达和细胞凋亡的限制四氯化碳诱导的大鼠肝损伤

抽象的

最近的研究表明白藜芦醇在许多动物模型中的化学预防作用，如缺血，类风湿性关节炎，人癌和糖尿病。本研究旨在研究通过四氯化碳在大鼠肝损伤模型中白藜芦醇的化学预防潜力。每天腹腔内腹腔腹泻（0.4g / kg体重）处理雄性Wistar大鼠8周。从第一天到最后一天的第一天，白藜芦醇（100mg / kg，200mg / kg体重）口服给出。调查评估白藜芦醇对四氯化碳攻击性肝组织中的形态学，氧化地位，组织病理学，免疫组织化学和凋亡分析的影响。该研究表明炎症细胞因子TNF-α在实验大鼠中，IL-6在实验大鼠中表达，而白藜芦醇降低了TNF的免疫阳性α和IL-6，恢复受损肝组织的结构改变。白藜芦醇还通过抑制氧化应激和凋亡来保护肝细胞。

1.介绍

肝脏是药物和化学物质代谢的主要器官，也是许多有毒化学物质的主要靶器官。环境致癌物，四氯化碳(CCl₄），已被认为是化学诱导大鼠肝损伤的最佳特征实验模型之一。CCL.₄是一种经典的肝毒剂，引起肝硬化，纤维化和坏死，通过产生高度反应性的三氯甲基自由基，起始脂质过氧化并引起内人坏死。高水平的活性氧物质（ROS）诱导细胞损伤，并参与几种人类病理，包括肝硬化和纤维化[1，2]．因此，使用具有抗氧化特性的化合物可以预防或缓解许多与ROS相关的疾病。ROS的形成是一个自然发生的过程，哺乳动物细胞已经发展了几种保护性的抗氧化防御机制来对抗ROS的形成和解毒[3.]．还建议ROS在细胞色素释放中发挥重要作用，然后是凋亡反应。顽固的kupffer细胞，肝星状素和正弦内皮细胞，导致促炎细胞因子如IL-6，TNF-α，tgf-β， eNOS，它们与化学诱导的肝毒性过程密切相关[4- - - - - -7]导致中性蛋白和单核细胞浸润到受损器官中[8，9]．肿瘤坏死因子-α， IL-6在多种肝损伤实验模型中被认为具有肝毒性[10.，11.]．

白藜芦醇(3,4 '，5三羟基二苯乙烯)是一种天然的多酚，主要存在于葡萄皮，红酒，浆果和花生中1）.在过去的几年中，白藜芦醇效益的大多数科学证据是基于体内或体外研究，其中该化合物具有包括抗癌的几种药理活动[12.),抗氧化剂(13.,抗炎14.]，反脂肪[15.]、抗伤害性和平喘性活动[16.]．报告还表明它在青光眼具有有效作用[17.],胰腺炎[18.]和骨关节炎[19.]．预防和治疗心血管疾病，改善微循环疾病[20.]．白藜芦醇对胆汁淤积的氧化应激有保护作用，对乙醇和硫代乙酰胺引起的啮齿动物急性和慢性肝损伤有肝保护作用[21.，22.]．小剂量白藜芦醇可减少缺血再灌注引起的肝损伤，保护肝细胞抵抗抗氧化防御失败[23.]．白藜芦醇通过抑制炎症细胞因子如TNF-的过度产生而具有免疫调节作用α，IL-1β，以及IL-6 [24.]．

细胞凋亡是一种细胞自杀的遗传编码形式，对多细胞生物的发育和内环境稳定至关重要[25.，26.]．之前的报告表明，增加的肝细胞凋亡是有助于肝脏炎症和纤维发生的重要机制[1]．越来越多的证据表明细胞凋亡参与了CCl早期大鼠肝损伤₄诱导肝损伤[27.]．

在CCl中触发凋亡的事件₄引起的急性肝损伤尚不清楚。CCL.₄-分离肝细胞的诱导毒性是由直接溶剂对细胞膜的损伤介导的[28.]．诸如kupfer细胞的非正生细胞被细胞因子释放激活，这可能有助于在肝脏毒性损伤毒性损伤后的病理生理学过程有助于肝细胞凋亡[29.]．因此，我们假设在CCl上₄侮辱，细胞因子在肝脏中表达，改变凋亡过程，可以通过定白藜芦醇来逆转。

因此，本研究通过检测形态学、组织病理学和TNF-的时间变化来揭示白藜芦醇可能的化学预防方法α和IL-6免疫表达与四氯化碳的氧化应激和凋亡事件关联₄诱导雄性Wistar大鼠亚慢性肝损伤。

2.结果

2.1。身体和肝脏重量

不同组大鼠的平均体重如图所示3.．无统​​计学差异，看到的任何治疗相关的组和对照组的增长率之间。在四氯化碳中观察到最终体重略有下降₄对照组(B组)与正常对照组(A组)比较，但结果无统计学意义。与正常对照组(A组)相比，白藜芦醇处理组(C和D组)保持了正常体重，表明白藜芦醇对大鼠的生长反应几乎没有不良影响。B组的平均肝重及相对肝重()及C组()与正常对照组相比有显著性差异。D组与正常对照组比较，差异无统计学意义。此外，D组与A组差异有统计学意义(）与CCL相比₄控制(表1）.

2.2。白藜芦醇对CCL的影响₄- 诱导的结节生长

在正常对照（A组）的肝脏中未观察到可见的肝细胞结节，而在CCL中清楚地看到宏观结节₄对照组大鼠肝脏(图4）.结节的大鼠数，结节发病率，结节总数，CCL的结节多重性₄对照组以及白藜芦醇治疗组均显示在表中2．一个重要的(，)与B组比较，白藜芦醇100 mg/kg (C组)和200 mg/kg (D组)治疗组的结节发生率降低;同样，与b组相比，所有两个白藜芦醇处理组的结节总数都更少。结节多样性也很显著(）在C组和D而不是B组。在C组和D组之间进行比较时，意义（出现了结节多样性的结果。

与B组相比，白藜芦醇100 mg/kg (C组)和200 mg/kg (D组)的剂量可以减少结节的出现，并减少小于3mm的结节的发育(1 mm)3.）.发现平均结节体积显着降低（）与B组相比，C组。此外，获得了统计学上显着的结果（）在组d相比，组B.结节体积肝脏体积的百分比显著降低（）与B组的C组中，与B组相比，）与B组中的所有白藜芦醇处理基团相比，在所有白藜芦醇处理的基团中观察到结节体积的降低。D组D也显示出显着（)结果与C组比较。

２.３.白藜芦醇对脂质过氧化、肝谷胱甘肽和谷胱甘肽的影响

白藜芦醇对肝组织脂质过氧化、肝谷胱甘肽、谷胱甘肽含量的影响见表4．丙二醛(MDA)是脂质过氧化的最终产物，也是常见的标志物。MDA含量显著()较高的CCl₄对照组。白藜芦醇100 mg/kg (C组)和200 mg/kg (D组)处理显著降低MDA含量。由于组织的氧化应激通常涉及GSH和GST系统，我们测量了各组肝脏中GSH和GST的水平。CCl的管理₄显着耗尽的GSH和GST含量;用白藜芦醇治疗显着保护CCL诱导的GSH和GST消耗₄．

2.4。白藜芦醇对肝组织学的影响

识别和组织病理学变化改变肝细胞损伤和白藜芦醇对四氯化碳的保护作用期间₄-诱导毒性如图所示5．正常对照组(A组)肝脏组织病理学显示肝细胞排列规则，细胞核清晰可见(图)5（a））.腹膜内注射CCL₄0.4 g/kg剂量组(B组)肝中央静脉周围可见广泛的小叶中央坏死，中央静脉扩张，中央静脉周围肝细胞再生面积少，可见肝远端部分(图)5（b））.与CCl组相比，C组中央静脉扩张幅度明显，但扩张幅度很小₄对照组（B组）（图5（c））.D组肝切片肝细胞坏死保护良好，中央静脉扩张差，肝细胞在中央静脉周围排列整齐。肝中央静脉远端可见肝细胞分散再生区;很少有明显的坏死区(图5（d））.

2．5．白藜芦醇对TNF-表达的影响α

TNF-的表达α通过免疫组织化学分析（图6）和tnf-的百分比α各实验组大鼠肝组织免疫阳性细胞见表5．正常对照组肝脏切片显示TNF-免疫染色完全缺失α(图6（a））.大量的TNF-α在CCL的肝脏组织切片中检测到免疫阳性细胞（28.5±2.4）₄对照组(B组)(图6（b））.相反，TNF-的减少α免疫阳性（15.3±3.6），（白藜芦醇-(100 mg/kg)与CCl比较₄控制(图6（c））.此外，TNF的减少α显着的免疫阳性（）与CCL相比，白藜芦醇 - （200mg / kg）处理的大鼠₄对照组(图6 (d)）.

2.6。白藜芦醇对IL-6表达的影响

数字7肝组织中IL-6免疫组化染色的典型显微照片。表格5显示IL-6免疫阳性细胞的实验组大鼠的各种基团中的表达（作为百分比）。正常控制的肝脏切片显示IL-6的免疫染色的完全不存在（图7(一)）.CCl肝组织切片中检测到大量IL-6免疫阳性细胞(18.2±0.7)₄对照组(B组)(图7 (b)）.IL-6免疫阳性降低(，）与CCL相比，白藜芦醇（100mg / kg）治疗₄控制(图7 (c)）.观察到IL-6免疫阳性的递减（，）与CCL相比，白藜芦醇 - （200mg / kg）处理的大鼠₄控制(图7 (d)）.

2.7。估计肿瘤坏死因子-αELISA检测IL-6

细胞因子(TNF-α肝脏匀浆中的IL-6）显示在图中8．TNF-α的水平α(图8(一个)）和IL-6（图8 (b)）显着（）在CCL升高₄对照组。白藜芦醇100和200 mg/kg的治疗显著()降低炎症细胞因子的水平。此外，每公斤200毫克白藜芦醇的效果更为显著(）与白藜芦醇-100mg / kg处理的组相比。

2.8。白藜芦醇对细胞凋亡的影响

CCL.₄在实验动物模型中，注射引起的坏死与凋亡呈剂量和时间依赖性。TUNEL法进行细胞凋亡免疫组化分析(图)9）.由色原产生的棕色染色表明细胞凋亡。值得注意的是，在几乎所有的病例中，棕色染色与凋亡小体的染色质浓缩重叠，从而证实TUNEL检测与凋亡的形态学表现密切相关。正常对照组细胞凋亡率普遍很低(图)9（a）)， CCl中阳性表达较多₄-诱导肝切片(图9（b））.在白藜芦醇处理基团（C组和D）中观察到较少的凋亡细胞（图9（c）和9（d））.TUNEL阳性凋亡细胞的百分比表示为凋亡指数。B组的凋亡指数值被发现为21.3±1.2。白藜芦醇（100mg / kg）减少细胞凋亡（13.71±0.17）统计学意义（）与B组相比。此外，高剂量白藜芦醇（200mg / kg）的细胞凋亡（10.6±0.28）的降低更为统计学意义（)与CCl相比₄对照组。D组细胞凋亡指数显著降低(）与C组相比。

3.讨论

许多物质的抗氧化剂和自由基清除活性已经评估，并提出了具有强抗氧化活性的化合物显示有前途的肝保护活性[30.，31]．多酚类化合物广泛分布于水果中，被认为是预防发病过程中氧化损伤的膳食抗氧化剂[32]．因此，我们假设多酚化合物白藜芦醇有助于预防氧化应激引起的各种肝损伤。

CCL诱导的肝损伤₄是异生素诱导的肝毒性的最佳表征的系统和可用于筛选药物保肝[常用模型33- - - - - -35]．早期的研究描述了白藜芦醇对高剂量CCL诱导急性肝损伤的影响₄［36]．发现白藜芦醇通过减少NF-Kappa来防止纤维化β激活和TGF -βCCl的内容₄大鼠诱导肝损伤[37]．我们的数据首先表明次级调整CCL₄治疗引起了大鼠明显的毒性，通过肝结节明显增加和定位的形态学变化、肝组织氧化状态和组织病理学结构的改变以及促炎细胞因子的过表达来评估。到目前为止，白藜芦醇对CCl的化学预防研究₄亚慢性毒性及其与细胞凋亡和炎症细胞因子水平的关系尚未见报道。在目前的研究中，已经认识到ccl4诱导的肝毒性是通过继发于细胞致死的肝细胞凋亡模式介导的。白藜芦醇是预防ccl4诱导的大鼠肝损伤的良好候选物质。在我们目前的研究中，实验动物的体重没有改变，这可能被认为是白藜芦醇作用的一个重要方面。

本调查结果表明，白藜芦醇治疗大大减少了CCL₄- 大鼠肝损伤，通过口服途径施用白藜芦醇改良结节形成。尽管在动物的寿命期间，但所有肝细胞结节都变得恶性，但许多研究支持肿瘤/增生结节是肝癌的前体。在目前的研究中，观察了白藜芦醇对结节生长抑制的影响和回归增强。

既往研究表明，谷胱甘肽在解毒CCl活性毒性代谢物中起关键作用₄．失败解毒代谢物促进肝坏死[38，39]．GSH与CCl的有毒代谢物形成加合物₄并有助于CCL的排毒₄．有人认为，CCl的主要原因之一₄诱导的肝损伤的脂质过氧化反应引起的它的自由基衍生物〔38]．GST是位于胞质内的一种可溶性蛋白，在外源性物质的解毒和排泄中起重要作用[40]．此外，GST在功能上与谷胱甘肽以及内源性和外源性物质结合。我们的研究结果表明，白藜芦醇处理显著抑制脂质过氧化，降低CCl₄-诱导肝谷胱甘肽减少，增强谷胱甘肽活性。

组织学发现清楚地表明，由于CCL的给药，肝组织的正常结构被改变₄-released活性氧引起变性的肝细胞，肝周围的中央静脉广泛中心坏死。相比之下，白藜芦醇治疗大鼠的病理组织学参数明显改善。有没有坏死区和中央静脉扩张的迹象。我们的结果也为最近的发现的每白藜芦醇保护原代大鼠肝细胞免受损伤活性氧引起的[41]．

在本研究中，我们分析了白藜芦醇对CCl促炎细胞因子释放的抑制作用₄- 诱导大鼠肝损伤模型。细胞因子作为控制基因的中枢调节因子，通过刺激肝细胞的增殖来诱导细胞凋亡或对细胞的保护作用。细胞因子构成了一个复杂的网络，涉及调节炎症反应并维持器官功能的稳态。肝损伤的几种实验模型中的主要肝毒性介质是TNF-α和il - 6。肿瘤坏死因子-α是一种循环因子，当给携带肿瘤的老鼠时，它会导致肿瘤坏死。慢性肝损伤包括病毒性或酒精性肝病、肝炎、缺血和胆道梗阻，浸润性炎症细胞和肝细胞中这些水平均升高[42]．接触肝毒性化学物质可促进TNF-α诱导坏死细胞死亡和肝细胞凋亡[43]．IL-6是多功能细胞因子以及TNF-α激活肝星状细胞，增加细胞外基质蛋白的产生，最终导致肝硬化。肝损伤后IL-6浓度升高提示IL-6可能参与肝细胞增殖，但一些研究表明IL-6缺陷小鼠肝细胞再生受损[44]．在我们最近的发现中，TNF的过度表达α和IL-6在CCL₄通过白藜芦醇处理基团显着降低对照大鼠。

肝细胞损伤与小叶中央区坏死密切相关。然而，坏死和细胞凋亡都可以由药物和化学物质引起。研究表明，细胞凋亡是细胞死亡的一种预编程形式，其特点是细胞有组织地分裂;这种结构衰变所产生的残余物被称为凋亡小体，然后被吞噬清除。与炎症反应和纤维化增强相关的不受调节的凋亡的病理性比率。我们研究了凋亡在四氯化碳诱导的肝损伤中的可能作用，以及它与白藜芦醇的化学预防性质的关系。我们的结果表明，在四氯化碳刺激下的肝脏中，细胞凋亡导致的细胞损失深刻而迅速，并表达了更多的TUNEL阳性细胞。白藜芦醇治疗组的细胞凋亡发生率均有抑制作用。

结论白藜芦醇对四氯化碳致肝损伤大鼠模型的保护作用得到了证实。天然抗氧化剂在生物系统中的保护作用及其机制是近年来研究的热点。这项研究提供了生物学证据，支持白藜芦醇用于治疗肝病。白藜芦醇可下调细胞凋亡和抑制炎症细胞因子水平，这可能与白藜芦醇保肝作用的分子机制有关。大量的努力正在进行开发特异性和安全的肿瘤坏死因子-的生物学和分子抑制剂α和IL-6的潜在治疗用途。了解炎症疾病的分子基础，以改善人类健康风险评估，以及识别炎症介质的功能多态性，应该允许更好地估计易感人群，并帮助改善人类风险评估。

4.材料和方法

4．1.化学物质

白藜芦醇，四氯化碳（CCL₄），硫氨酰脲酸试剂（TBA），降低谷胱甘肽（GSH），生物素化兔抗小鼠IgG，链霉抗生物素蛋白过氧化物酶，抗唑辛蛋白过氧化物酶，3,3-二氨基苯并二氯乙烯（DAB），末端脱氧核苷酸转移酶（TDT）和脱氧尿苷三磷酸（DUTP）是从Sigma Chemical Company（圣路易斯，Mo，USA）获得的。ELISA Kit是从BD Bioscience（加利福尼亚州圣何塞，美国）购买的。谷胱甘肽-S-S-转移酶检测试剂盒购自Stratagene（La Jolla，Calif，USA）。兔子抗小鼠TNF-αIL-6抗体购自美国加利福尼亚州圣何塞市的Anaspec公司。所有其他化学药品和试剂均采用从当地公司购买的最纯的分析级。

4．2．动物和饮食

从印度化学生物学研究所（IICB，Kolkata，India）获得了无病原体的雄性Wistar大鼠最初称重100-150g）。将动物适应标准实验室条件（温度18c±2c，相对湿度40％至70％，12小时：12小时光/暗循环），并置于固体底部聚丙烯笼（每个笼子4只动物）床上用品一周内在开始实验之前。将动物用半化基础饮食和脱矿质饮用水喂养随意．“机构动物伦理委员会”[动物实验管制及监督委员会(CPCSEA注册)]的建议。不。在整个实验过程中都严格遵循对实验动物的照顾和使用。

4．3．肝损伤诱导

The experimental hepatic injury was initiated by intraperitoneal injection of carbon tetrachloride (0.4 g/kg/day) dissolved in purified mineral oil and continued up to 8 weeks. It is an important xenobiotic swallowing or inhalation exposure of CCl₄在一段时间内会增加动物肝脏损伤的频率[45]．

4.4。白藜芦醇剂量选择

The doses of resveratrol 100 mg and 200 mg/kg bodyweight/day were selected based on previously reported chemopreventive and toxicological properties of this compound in rats. These doses have been found to suppress diethyl nitrosamine-initiated hepatocarcinogenesis in rodent model [46]．白藜芦醇不溶于水，因此悬浮在0.7%的羧甲基纤维素中。

4.5。实验设计

在适应依赖后，大鼠随机分成四组，每组10只动物（图2）.用0.1ml矿物油和CCL治疗正常对照（A组）₄对照组(B组)给予CCl治疗₄（0.4克/千克/天）。治疗组（C组）动物以100mg / kg口服的浓度与CCl一起接受白藜芦醇₄(0.4 g/kg/day)，持续8周。另一组(D组)口服浓度为200 mg/kg的白藜芦醇，同时给予CCl₄(0.4 g/kg/day)，持续8周。每周记录动物体重。8周后禁食过夜，随机处死。收集肝脏切片用于进一步实验。

4.6。形态

用乙醚麻醉处死来自每组的动物。肝脏很快被切除，用冰冷的磷酸盐缓冲盐水（pH7.4）冲洗，以冲出任何血液，在纸巾上呈衬垫干燥，称重，拍照。每个肝脏在表面上宏观检查，以及来自所有大鼠的所有组的可见肝细胞结节的3 mm横截面。通过其两个垂直平面用vernier卡钳测量结节，以获得最接近的mm，以获得每个结节的平均直径。根据其各自的直径（<3-> 1和<1mM）计数结节并分为两组。结节体积（）通过使用公式确定 在哪里=平均直径的一半（mm）。

4.7。脂质过氧化的评估

通过测量硫碱酸 - 反应性物质（TBAR）测定肝脂质过氧化水平[47]．样品与0.375% TBA和15%三氯乙酸组成的硫代巴比妥酸(TBA)试剂在0.25 N盐酸中混合。将反应混合物置于沸水浴中30分钟。样品在48℃下离心(2000 rpm, 10 min)， TBARS浓度在室温下用分光光度计测定532 nm处的吸光度。

4.8。肝谷胱甘肽和谷胱甘肽活性

肝脏迅速除去并用冰冷的0.15米KCl称重并灌注，然后用4体积10毫米均化三羟甲基氨基甲烷-液在Ultra Turrax组织均质器中含有0.15 M KCl、0.1 mM EDTA、1.0 mM二硫苏糖醇和0.01 mM苯甲基磺酰氟的HCl (pH 7.4)。使用Ellman试剂比色法估计肝脏谷胱甘肽水平(Systronic 2202, Ahmedabad，印度)[48]．以1-氯-2,4-二硝基苯为底物测定胞质GST活性[49]．

4.9。组织病理学

CCL后八周₄或随机选择来自每组的载体处理动物;从10％福尔马林中固定在10％福尔马林中并加工组织病理学研究，从醚 - 麻醉大鼠中切除一部分肝脏。将组织通过70,90和100％醇脱水，并嵌入低熔点石蜡蜡中。第5部分 μ切割M厚度，连续放置于载玻片上。每个肝组织用苏木精和伊红染色，在光镜下进行组织病理学评估。

4.10。TNF-α的免疫染色α，IL-6

免疫组化检测TNF-α和IL-6在冷丙酮固定中，通过抗生物素蛋白 - 生物素 - 过氧化物酶复合方法进行石蜡嵌入肝脏切片．简而言之5 μ将赖氨酸涂层载玻片的M薄片脱烷基化并再水合。用于TNF-的免疫标记α通过将柠檬酸盐缓冲液pH6.0中的截面加热20分钟，促进IL-6抗原检索。内源性过氧化物酶活性被1％H封闭₂O₂在0.1 m Tris-NaCl中，（pH 7.6）30分钟。在5％正常的山羊血清中孵育后，然后将切片在4℃下分别在4℃下孵育过夜，初级纯化的抗小鼠TNF-α一个ntibody, primary purified anti-mouse IL-6 antibody at 1 : 50 dilutions, respectively, in 1% bovine serum albumin (BSA). Sections were then incubated with a biotinylated secondary antibody, goat anti-rabbit IgG (Sigma) for 30 min at 37°C with 1 : 100 dilutions. This was followed by incubation with streptavidin peroxidase (1 : 100) for 1 h. After that 100–400 μ将L二氯丁丁酰氯（DAB）试剂加入到每个截面中。一旦部分转动棕色，载玻片浸入双蒸馏水中（DDH₂O)两次，每次5分钟。切片脱水后用DPX固定，作为阳性对照。光镜下计数免疫阳性细胞百分率。

4.11。酶联免疫吸附试验（ELISA）

肝脏TNF-αIL-6水平使用从BD Biosciences (San Jose, california)购买的商业ELISA试剂盒进行估计，根据制造商提供的方案。微板上涂100用100μL/孔的捕获抗体并在4孵育过夜℃。一个fter washes, the plates were blocked with assay diluent (BD Biosciences) at room temperature (RT) for 1 h. One hundred microliters of liver homogenate in PBS supplemented with protease inhibitors, were added to each well of the plate, followed by incubation for 2 h at RT. Working detector (100 μL)载入每孔，RT下再孵育1 h，然后加入100μl底物溶液。通过加入50次停止反应 μL停止解决方案。用96孔板光谱仪(SpectraMax 190;加州森尼维尔市)。细胞因子浓度的计算采用对数-对数线性回归，按照协议中的说明进行。

4.12。TUNEL法检测细胞凋亡

采用TUNEL法检测肝组织切片中的凋亡细胞。切片经蛋白酶K (20μg/mL in PBS)，室温下洗15分钟，用双蒸馏水冲洗。玻片用2% H淬火₂O₂在室温下5分钟，用缓冲液平衡。然后将载玻片与末端脱氧核苷酸转移酶（TDT）缓冲液（30mM Trizma碱，pH 7.2,140mM氯化钠，1mM钴氯化钠）一起温育，然后含有TDT和脱氧尿苷三磷酸（DUTP）的TDT反应溶液在37℃℃，然后用2％标准盐水洗涤柠檬酸盐，在室温下停止反应10分钟。然后用PBS洗涤载玻片5分钟，并在室温下与抗毒素过氧化物酶一起温育30分钟（1：100）。使用0.05％的二氨基苯并氯酰氯（Dab Kit Sigma，St.Louis，Mo，USA）开发了0.01％H的颜色₂O₂稀释三-HCL（pH7.5），然后用Leishman染色轻微染色。然后洗涤，脱水和安装部分。通过核染色鉴定凋亡细胞。每场计算大约200个细胞，每次载玻片检查五个田地，每组检查五个载玻片。凋亡指数（AI）被确定为标记细胞（TUNEL阳性）相对于使用的细胞总数的百分比（见表6）

4.13。统计分析

数据用平均值±S.E.M.表示。比较采用One way ANOVA，然后适当使用图形垫棱镜进行后测(Dunnett’s test)。结果被认为有统计学意义，当，．

承认

作者感谢Jayanta Bhowmick先生在准备和评估组织病理学切片方面的帮助。

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